CN107557439A

CN107557439A - 一种检测晋南牛igf1r基因cnv标记的方法及其应用

Info

Publication number: CN107557439A
Application number: CN201710986321.7A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 马懿磊; 蔡含芳; 白跃宇; 马云; 雷初朝; 蓝贤勇; 黄永震
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-10-20
Also published as: CN107557439B

Abstract

本发明公开了一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以晋南牛的耳组织全基因组DNA为模板，利用一对特异引物IGF1R‑CNV扩增牛IGF1R基因的拷贝数变异区域，同时利用另外一对特异引物BTF3‑CNV扩增牛BTF3基因片段作为对照，然后利用2^‑ΔCt的方法计算个体的拷贝数，本发明提供的方法为建立晋南牛IGF1R基因拷贝数与生长性状之间的关联奠定了基础，通过对拷贝数变异与生长性状进行的关联分析，有利于加快晋南牛分子标记辅助选择育种工作。该方法简单、快速、便于推广应用。

Description

一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学研究领域，具体涉及一种检测晋南牛IGF1R基因拷贝数变异的方法，该方法利用实时定量PCR技术，以基因组DNA为模板，以BTF3基因为参照，根据2*2^-ΔCt值从而确定个体的拷贝数是否插入或缺失。

背景技术

随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，揭开了动物生长发育的各种生物学机制。现在人们不断提高牛肉的质量和数量来推动牛产业化的进程，以此满足人们日益增加的对牛肉的需求。体尺性状和牛肉的质量是由多种基因共同调控的。现在认为分子标记辅助选择中通过提高优秀的分子标记频率对于动物育种的发展是有效的。随着对基因组研究的深入，有证据证明拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)可能影响基因网络并调节相关基因的表达，促成个体表型的可变性，因此优化与体尺性状相关的候选DNA标记如CNVs会加速牛遗传进程的发展。

拷贝数变异一般是指在全基因组范围大于50bp的缺失、复制和插入的结构变异，是基因组内发生重排导致的。可以通过剂量效应影响改变对剂量效应敏感基因的表达水平；通过产生融合基因可能会有的一些新功能；还有一些像基因功能阻断、位置效应、隐性等位基因的去除效应等影响基因的功能和个体间的表型。

目前，人和动物全基因组范围内的CNVs检测方法主要有三种，分别是微阵列比较基因组杂交芯片(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)、二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)和SNP芯片技术。在比较基因组杂交芯片中寡核苷酸探针芯片被广泛使用，具有高灵敏度、高精度和样本量小的特点；而细菌人工染色体芯片制作成本高、分辨率低且耗时长，很少会使用。此外，现有的芯片平台对新的拷贝数变异的检测效率很低。随着二代测序技术的发展，当前最有效的检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。

目前，对基因组己知的CNV检测主要有两种方法，基于PCR的检测技术和基于杂交的检测技术。PCR的检测技术主要包括实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)、依赖连接的多重扩增探针杂交技术(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification,MLPA)和短片段多重定量技术(Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments,QMPSF)。目前使用最广泛的是qPCR技术，该方法敏感性高、操作方法简单、速度快、重复性好且污染少。杂交技术主要包括Southern blotting杂交、荧光原位杂交(Fluorescence insitu hybridization,FISH)、多重扩增探针杂交技术(Multiplex Amplifiable ProbeHybridization,MAPH)等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。

胰岛素样生长因子I型受体(insulin-like growth factor-I receptor，IGF1R)是胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactors，IGFs)发挥生物学效应的效应器，它可以调节IGFs的半衰期和活性，在免疫调节、淋巴细胞的生成、肌肉和骨的生长起着非常重要的作用。目前揭示IGF1R基因组的变异会影响IGF1R的生理功能，甚至会导致生长的受阻、产生肿瘤和其他一些疾病。作为影响生长和分化的重要因子，IGF1R基因的研究在人、老鼠等物种中均有报道，但在牛上的报道较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法，包括以下步骤：

以晋南牛基因组DNA为模板，以引物对IGF1R-CNV及引物对BTF3-CNV为引物，通过实时荧光定量PCR扩增IGF1R基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定晋南牛IGF1R基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对IGF1R-CNV为：

上游引物F1：5’-GACTATGGCACCAGTGTTTGT-3’

下游引物R1：5’-CCTTGAGGCTATCGCTGTATT-3’；

所述的引物对BTF3-CNV为：

上游引物F2：5’-CAAGAAGACTCATTCCTT-3’

下游引物R2：5’-CACAAGCACATTATTCAC-3’。

所述的IGF1R基因的拷贝数变异位于牛IGF1R基因参考基因组序列AC_000178.1的8170001bp位至8180000bp，共10000bp。

所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，2*2^-ΔCt＝1.5～2.5。

所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系包括：25ng/μL模板DNA1μL、10pmol/L的引物对IGF1R-CNV、引物对BTF3-CNV所对应的上、下游引物各0.5μL、2×SYBR Green qPCRMix 6.25μL和ddH₂O 4.25μL。

所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序包括以下步骤：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

基于引物对IGF1R-CNV扩增的PCR产物片段大小为171bp，基于引物对BTF3-CNV扩增的PCR产物片段大小为109bp。

上述检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法在晋南牛分子标记辅助选择育种中的应用。

所述拷贝数变异类型中，具有缺失型和正常型拷贝数变异类型的晋南牛个体在生长性状上优于插入型拷贝数变异类型的晋南牛个体。

本发明的有益效果体现在：

本发明以待测晋南牛的基因组DNA为模板，利用实时荧光定量PCR检测基因组CNV，根据晋南牛基因组CNV的检测结果，以及晋南牛群体中的拷贝数变异情况与其体高、体斜长、十字部高、胸围等重要经济性状进行的关联分析，表明本发明所检测的IGF1R基因CNV可以作为分子标记，用于快速建立晋南牛生长性状优势种群。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

(1)本发明提供的晋南牛IGF1R基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于母牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择；

(2)检测晋南牛IGF1R基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；

(3)晋南牛IGF1R基因拷贝数变异位点的检出，为晋南牛生长发育性状的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为IGF1R基因及内参基因BTF3的PCR扩增产物电泳图；图1中：泳道1为IGF1R-CNV引物扩增结果，泳道2为BTF3-CNV引物扩增结果，泳道3为MarkerⅠ。

图2为本发明中进行qPCR绘制的扩增曲线图。

图3是本发明中进行qPCR绘制的溶解曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

本发明利用实时荧光定量PCR对晋南牛IGF1R基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)根据NCBI数据库的牛IGF1R基因序列，利用Primer 5.0软件进行引物设计，并用普通PCR检测引物；

(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况，筛选到与晋南牛生长性状相关的CNV标记；

(3)利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与牛生长性状等进行关联分析；

(4)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的晋南牛选育。

1、牛样本采集

本发明具体以晋南牛122头作为检测对象，其中122头晋南牛的耳组织样本采集自山西省运城市黄牛场(采样时间：2013年9月)。

2、组织样DNA的提取

1)取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。

2)用1.5mL的离心管装组织样，然后加入600μL的SE。

3)向各个离心管中加入30μL的蛋白酶K，再加入15μL的SDS，充分混匀。

4)消化过夜，65℃水浴12～16h。

5)向各个离心管中加入200μL 65℃预热的6mol/L NaCl，充分混匀。

6)样品放在冰上，加入600μL氯仿。

7)将含样品的离心管包埋在冰里，摇动20min，注意动作要轻柔，以避免DNA断裂，然后12000r/min离心15min。

8)将上层清液用移液器小心的移入新的灭菌的离心管。

9)加入1倍体积无变性的冰冷的无水乙醇，轻扣底部摇动多次，直到DNA析出，然后-20℃放置10-30min。

10)加入500μL冰冷的体积分数70％无水乙醇，并摇动，注意动作要轻柔。

11)10min后，15000r/min离心10min，倾倒出体积分数70％的乙醇，15min真空干燥或空气干燥3-4h。

12)根据DNA的量，加入50～100μL水，保存于4℃过夜，使其完全溶解。

13)第二天，用1％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，待分光光度计测定其浓度后，-80℃保存。

3、目标序列及参考序列的扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛IGF1R基因序列(GenBank Accession No.AC_000178.1)为参考序列，根据牛IGF1R基因候选区域Chr 21:7967701-8268340的拷贝数变异，具体地，所述的CNV标记位于牛IGF1R基因(GenBankAccession No.AC_000178.1)序列的8170001bp-8180000bp区域内。利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR引物对检测IGF1R基因拷贝数变异，其引物对序列信息如表1所示。IGF1R基因候选区域扩增片段的大小为177bp，内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即BTF3基因中的一段109bp的序列(图1)。通过绘制扩增曲线(图2)和溶解峰来确定引物是否适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图3)。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

其中，进行实时荧光定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计为：25ng/μL模板DNA(提取自耳组织样本的基因组DNA)1μL，10pmol/L的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCRMix 6.25μL，及ddH₂O 4.25μL。

qPCR扩增的反应程序为：1)预变性：95℃10min；2)扩增反应：95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环；3)绘制溶解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和参考序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-ΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔCt＝Ct_目的基因–Ct_内参基因。2^-ΔCt表示的是拷贝数。C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

根据2*2^-ΔCt将定量结果分为三类：插入型，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，2*2^-ΔCt＝1.5～2.5。

5、IGF1R基因CNV位点与生长性状的关联分析

生产数据：体高、十字部高、体斜长、胸围。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23.0软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+A_i+CNV_j+e_ijk

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i头个体的年龄，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。

关联分析结果表明(见表2)：晋南牛IGF1R基因上CNV为缺失型和正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状(体高，体斜长、胸围)上优于插入型拷贝数变异类型的个体。说明IGF1R基因CNV位点可以作为一个提高晋南牛生长性状的候选分子遗传标记。

表2.晋南牛IGF1R基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。括号里面的数值表示拷贝数类型的频率。

6、上述CNV标记在牛选育中的应用

获得的CNV候选分子遗传标记，可以用于寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性状的数量性状基因座，以对晋南牛进行分子标记辅助选择。本方法可以通过对晋南牛IGF1R基因CNV位点不同基因型的检测，然后选择缺失型和正常型拷贝数变异类型的个体留种并扩繁，从而能够加快晋南牛品种改良的选育进程。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

gactatggca ccagtgtttg t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

ccttgaggct atcgctgtat t 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

caagaagact cattcctt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

cacaagcaca ttattcac 18

Claims

1.一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：

利用实时荧光定量PCR，以晋南牛的基因组DNA为模板，以引物对IGF1R-CNV为引物，扩增IGF1R基因的拷贝数变异区域，同时以引物对BTF3-CNV为引物扩增作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定晋南牛IGF1R基因上CNV标记的拷贝数变异类型；

所述的引物对IGF1R-CNV为：

上游引物F1：5’-GACTATGGCACCAGTGTTTGT-3’

下游引物R1：5’-CCTTGAGGCTATCGCTGTATT-3’；

所述的引物对BTF3-CNV为：

上游引物F2：5’-CAAGAAGACTCATTCCTT-3’

下游引物R2：5’-CACAAGCACATTATTCAC-3’。

2.如权利要求1所述一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的IGF1R基因的拷贝数变异位于牛IGF1R基因参考基因组序列AC_000178.1的8170001bp至8180000bp。

3.如权利要求1所述一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔCt将定量结果分为三类：插入型，2*2^-ΔCt>2.5；缺失型，2*2^-ΔCt<1.5；正常型，2*2^-ΔCt＝1.5～2.5。

4.如权利要求1所述一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR采用的扩增体系包括25ng/μL模板DNA1μL及10pmol/L的引物对IGF1R-CNV、引物对BTF3-CNV所对应的上、下游引物各0.5μL。

5.如权利要求1所述一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR采用的反应程序包括以下步骤：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

6.如权利要求1所述一种检测晋南牛IGF1R基因CNV标记的方法，其特征在于：基于引物对IGF1R-CNV扩增的PCR产物片段大小为171bp，基于引物对BTF3-CNV扩增的PCR产物片段大小为109bp。

7.如权利要求1-6中任意一项权利要求所述的方法在晋南牛分子标记辅助选择育种中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述CNV标记为缺失型和正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于插入型拷贝数变异类型的个体。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述生长性状为体高、体斜长、胸围。