CN114686602B - 一种牦牛hsf1基因cnv标记的检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种牦牛HSF1基因CNV标记的检测方法及其应用。本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记：位于牦牛HSF1基因候选区域Chr 15：80601963‑80623735；并提供了检测CNV标记的方法：以牦牛的基因组DNA为模板，以引物对P1和P2分别通过QPCR扩增HSF1基因的CNV区域以及内参基因，定量牦牛HSF1基因的拷贝数变异，所述方法准确可靠、操作简便；本发明可在DNA水平上检测与牦牛生产性状密切相关的CNV标记，用于牦牛的早期选育。

Description

一种牦牛HSF1基因CNV标记的检测方法与应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种牦牛HSF1基因CNV标记的检测方法及其应用。

背景技术

分子育种是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)，作为一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。

CNV常用的检测方法主要分为在全基因组范围内检测未知CNV和用于定点检测或验证已知CNV两类。基因组未知CNV常用的检测方法有芯片法和测序法，但是这两种方法受检测平台的局限，而且价格昂贵。对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。其中，实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。

热休克转录因子1(heat shock factor 1，HSF1)是一种调节应激反应的转录调控因子，通过结合下游靶基因启动子区存在的HSE，促进下游基因转录，调控蛋白表达。HSF1能够调节热休克蛋白基因的诱导表达并发挥重要的作用，通过对HSF1的结构和功能的研究,进而控制热应激反应,使人类和动物表现最佳的生理机能,以及使人类和动物在高温环境下保持正常的生理状态和健康体能,具有重要的理论意义和实际应用价值，但HSF1与牦牛生长性状的相关性研究未将报道。

基于此，本发明提供了一种牦牛HSF1基因CNV标记，并提供了一种方便、准确、大样本量的检测牦牛HSF1-CNV的检测方法，为牦牛的生长性状的早期选育提供了基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记、检测方法及其应用，尤其涉及一种基于QPCR技术检测牦牛HSF1基因CNV标记的方法及其应用。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为位于牦牛HSF1基因候选区域Chr 15：80601963-80623735。

优选地，根据2×2^-ΔΔCt法定量结果，将所述拷贝数变异分为三类：2×2^-ΔΔCt≥2时，为插入型；2×2^-ΔΔCt<1时，为缺失型；1≤2×2^-ΔΔCt<2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

第二方面，本发明提供了一种检测上述第一方面所述CNV标记的试剂在检测牦牛生长性状中的应用。

优选地，根据2×2^-ΔΔCt法，定量结果将所述拷贝数变异分为三类：2×2^-ΔΔCt≥2时，为插入型；2×2^-ΔΔCt<1时，为缺失型；1≤2×2^-ΔΔCt<2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

优选地，所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：TCCGGAGGTGGTCCACAT；

下游引物R1：GAACTCGGTGTCATCCCTCTCT；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：ATTGCCGATGGTGATGAC；

下游引物R2：ACGGAGCGTGGCTACAG。

第三方面，本发明提供了一种检测上述第一方面所述CNV标记的试剂在牦牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选地，根据2×2^-ΔΔCt法定量结果，将所述拷贝数变异分为三类：2×2^-ΔΔCt≥2时，为插入型；2×2^-ΔΔCt<1时，为缺失型；1≤2×2^-ΔΔCt<2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

优选地，所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：TCCGGAGGTGGTCCACAT；

下游引物R1：GAACTCGGTGTCATCCCTCTCT；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：ATTGCCGATGGTGATGAC；

下游引物R2：ACGGAGCGTGGCTACAG。

第四方面，本发明提供了一种用于检测与牦牛生长性状相关的CNV标记的引物对，所述引物对包括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：TCCGGAGGTGGTCCACAT；

下游引物R1：GAACTCGGTGTCATCCCTCTCT；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：ATTGCCGATGGTGATGAC；

下游引物R2：ACGGAGCGTGGCTACAG。

第五方面，本发明提供了一种用于QPCR检测上述第一方面所述CNV标记的试剂盒，所述试剂盒含有上述第四方面所述的引物对。

优选地，所述试剂盒还包括2×SYBR Green qPCRMix、去离子水、对照样本中的一种或几种。

第六方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，所述方法包括以下步骤：

以牦牛的基因组DNA为模板，通过QPCR分别利用上述第四方面所述的引物对扩增牦牛HSF1基因的CNV区域和参照基因β-actin；

根据2×2^-ΔΔCt法将定量结果分为三类：2×2^-ΔΔCt≥2时，为插入型；2×2^-ΔΔCt<1时，为缺失型；1≤2×2^-ΔΔCt<2为正常型；其中正常型和缺失型的个体生长性状显著优于插入型个体。

优选地，所述QPCR扩增体系包括：50ng/μL模板DNA1μL，10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各1μL，SYBR Premix Ex Taq II 10μL以及ddH₂O 7μL。

优选地，所述QPCR所用的反应程序为：

(1)预变性：95℃，30s；

(2)扩增反应：95℃变性30s，58℃退火30s，45个循环。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记，所述CNV标记为位于牦牛HSF1基因候选区域Chr 15：80601963-80623735；

本发明提供了检测CNV标记的方法，以牦牛的血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增牦牛HSF1基因CNV区域并将β-actin基因作为参照，根据2×2^-ΔΔCt法可以将牦牛结果分为插入型、缺失型和正常型，鉴定牦牛HSF1基因的拷贝数变异；所述拷贝数变异与牦牛生长性状相关，其中正常型和缺失型牦牛具有更好的生长性能；本发明在DNA水平上检测与牦牛生产性状密切相关的CNV标记，可作为牦牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记；

本发明以牦牛HSF1基因的CNV为候选位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在牦牛群体中的拷贝数变异情况，并与18月龄体重、体高等重要经济性状进行关联分析；如果检测HSF1基因候选位点的拷贝数变异类型为正常型和缺失型，则正常型和缺失型牦牛具有更好生长性能；研究该基因CNV并将其与牦牛重要生长性状关联分析至关重要，可以为我国牦牛分子育种提供理论依据，便于牦牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的牦牛种群。

本发明提供的牦牛基因的拷贝数变异检测方法，可用于牦牛的早期选育；检测HSF1基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；HSF1基因拷贝数变异位点的检出，为牦牛的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明实施例提供的检测牦牛HSF1基因CNV标记的方法流程图；

图2本发明实施例提供的检测牦牛HSF1基因CNV标记的QPCR试验的扩增曲线示意图；

图3本发明实施例提供的检测牦牛HSF1基因CNV标记的QPCR试验的溶解峰示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明利用QPCR对牦牛HSF1基因的拷贝数变异进行检测，具体流程如图1所示。

本发明所涉及的一种基于QPCR技术检测的CNV标记(位于牦牛HSF1基因候选区域Chr 15：80601963-80623735)。根据2×2^-ΔΔCt将结果分为三类：2×2^-ΔΔCt≥2为插入型；2×2^-ΔΔCt<1为缺失型；1≤2×2^-ΔΔCt<2为正常型。

实施例1检测阿什旦牦牛HSF1基因CNV标记

1.检测方法

(1)阿什旦牦牛样本采集

本发明以阿什旦牦牛品种作为检测对象，从青海省大通种牛场采集了274头生长数据资料完善的阿什旦牦牛的血液样本。

(2)基因组DNA的分离、提取、纯化

使用Easy Pure Blood Genomic DNAkit试剂盒从阿什旦牦牛血液样本中提取基因组DNA。采用1.2％琼脂糖凝胶电泳和Thermo Scientific Nano Drop 2000c检测DNA的质量和浓度。

(3)目标基因及参考基因扩增

以NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛HSF1基因(目的基因)序列为参考序列，利用primer-BLAST工具设计QPCR引物对(引物对P1)检测HSF1基因拷贝数变异，同时，以β-actin为参考基因，采用相同的方法设计扩增参考基因(β-actin基因)。引物对序列信息如表1所示。

表1实时荧光定量PCR的引物信息

注：F表示上游引物，R表示下游引物。

通过绘制扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于QPCR分析。扩增曲线平滑，表明QPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适(见图2)；绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(见图3)。

其中，进行QPCR所用的扩增体系以20μL计为：50ng/μL模板DNA 1μL，10pM的上、下游引物各1μL、SYBR Premix Ex Taq II 10μL，ddH₂O 7μL。

PCR扩增的反应程序为

预变性：95℃，30s；

扩增反应：95℃变性30s，58℃退火30s，45个循环；

绘制熔解曲线：95℃5s，从65℃到95℃，+0.5℃5s。

(4)拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和参考序列的引物(引物对P1和P2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2×2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(CT_目的基因-CT_参考基因)_实验组-(CT_目的基因-CT_参考基因)_对照组；2^-ΔΔCt表示的是实验组目标序列的拷贝数相对于对照组的倍数，进行方差齐性检验后，统计检验个组间的差异。根据2×2^-ΔΔCt将结果分为三类：2×2^-ΔΔCt≥2为插入型；2×2^-ΔΔCt<1为缺失型；1≤2×2^-ΔΔCt<2为正常型。

(5)阿什旦牦牛HSF1基因CNV位点与18月龄生长性状的关联分析

生长性状数据：18月龄体重、体高、体长胸围。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 24软件分析各基因型间的生产性状效应。

在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：Y_j＝μ+CNV_j+e_j；其中Y_j表示观察到的生长性状值；CNV_j代表HSF1-CNV类型的影响；_μ代表每个性状的总平均值；e_j表示第j个CNV类型的随机剩余误差。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE表示。

关联分析结果如表2所示，表明(HSF1-CNV与18月龄阿什旦牦牛体长(p<0.05)和体高(p<0.01)之间存在明显的相关性。同时，在上述方差分析的基础上，进行了多重比较，发现各种HSF1-CNV对经济性状有显著影响。正常/插入型与缺失型之间无明显差异(P>0.05)。18个月龄时，正常型和缺失型个体的体高和体长与插入型相比差异极显著(p<0.01)，表明HSF1基因的CNV会影响阿什旦牦牛的生长发育。

表2 HSF1基因CNV与阿什旦牦牛18月龄生长性状的关联分析

注：不同字母表示类型间差异显著(p<0.05或p<0.01)

(6)上述CNV标记在阿什旦牦牛选育中的应用

获得的CNV可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牦牛生长性状的数量性状基因座，以对阿什旦牦牛进行分子标记辅助选择，从而加快阿什旦牦牛品种改良的选育进程。

综上所述，本发明对阿什旦牦牛的HSF1基因的拷贝数进行检测，并对该基因的拷贝数与阿什旦牦牛生长性状进行关联分析，通过SPSS22.0等软件的统计分析，发现阿什旦牦牛的HSF1基因的拷贝数显著影响阿什旦牦牛生长性状，即阿什旦牦牛的HSF1基因的拷贝数与阿什旦牦牛生长性状显著相关，具有缺失型和正常型的个体生长性状最优。该拷贝数变异的检出为阿什旦牦牛生长性状的分子辅助选育提供了科学依据。本发明提供的CNV标记为提高阿什旦牦牛选育提供了理论基础，可用于阿什旦牦牛的早期选育，可加快阿什旦牦牛的种质资源改良。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.检测牦牛HSF1基因CNV标记的试剂在检测阿什旦牦牛体长和/或体高生长性状中的应用。

2.检测牦牛HSF1基因CNV标记的试剂在阿什旦牦牛早期育种中的应用；其特征在于，所述试剂用于阿什旦牦牛体长和/或体高生长性状早期育种。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，根据2×2^-ΔΔCt法定量结果，将拷贝数变异分为三类：2×2^-ΔΔCt≥2时，为插入型；2×2^-ΔΔCt<1时，为缺失型；1≤2×2^-ΔΔCt<2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插入型。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括目标基因HSF1引物对P1和参照基因引物对P2；

所述目标基因引物对P1为：

上游引物F1：TCCGGAGGTGGTCCACAT；

下游引物R1：GAACTCGGTGTCATCCCTCTCT；

所述参照基因引物对P2为：

上游引物F2：ATTGCCGATGGTGATGAC；

下游引物R2：ACGGAGCGTGGCTACAG。

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