CN113322334A - 一种用于鉴定金定鸭品种的snp引物组合及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定金定鸭品种的SNP引物组合及鉴定方法，所述用于鉴定金定鸭品种的引物组合扩增的SNP位点组合选自JD1P位点到JD7P位点中的任1到7种。通过检测这7个SNP位点的基因型来联合判断待测个体是否属于金定鸭。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒金定鸭的泛滥程度。

Description

一种用于鉴定金定鸭品种的SNP引物组合及鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于鉴定金定鸭品种的SNP引物组合及鉴定方法。
背景技术
金定鸭是中国福建省著名的地方蛋鸭品种，金定鸭具有体格大，耐粗饲，抗病力强，是优良的蛋鸭品种，其产蛋期长，产蛋多，蛋大，蛋壳为青色，壳膜厚而结实，蛋不易破损，因而深受人们喜爱，被列入中国家禽品种志贺国家级畜禽遗传资源保护名录。金定鸭中心产区在福建省龙海县，在全国分布广泛，是重要的蛋鸭饲养品种。目前市场上有较多的假冒金定鸭以及金定鸭与其他品种的杂交个体销售，对金定鸭纯种个体市场造成了一定的冲击，严重影响了金定鸭品牌。
目前市场上鉴别金定鸭的方法主要依靠形态学方法，这种鉴定方法主观性较强，很多地方品种形态相似性较高，因此鉴定错误率较高，尤其在鉴定金定鸭与其他品种鸭杂种后代时，容易导致不正确的分类与鉴定。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有位点丰富、分布广泛、遗传稳定性高、具有代表性、检测便捷快速等特点。SNP标记，利用个体基因组DNA中特有的品种差异性较大的SNP位点，通过不同位点组合的基因型进行品种鉴定，鉴定结果更加客观、准确。鉴于此，科研和实践中均急需开发一种能有效准确鉴定金定鸭品种的产品及方法，应用于金定鸭鸭品种鉴定工作。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于鉴定金定鸭品种的SNP引物组合及鉴定方法，通过检测提供的金定鸭7个SNP位点的基因型来联合判断待测个体是否属于金定鸭。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种用于鉴定金定鸭品种的SNP位点组合，选自如下JD1P位点到JD7P位点中的任1到7种：
序号 染色体 位点 参考基因组 突变位点
JD1P NC_040047.1 127643061 T C
JD2P NC_040048.1 112028426 A G
JD3P NC_040052.1 440691 T C
JD4P NC_040053.1 3779408 C T
JD5P NC_040054.1 18797161 T C
JD6P NC_040056.1 8694111 T C
JD7P NC_040060.1 11540267 G A
所述SNP位点组合的筛选方法为：首先确定高邮鸭、绍兴鸭、北京鸭、连城白鸭、建昌鸭、娄门鸭等国内代表性品种的每个位点的不同等位基因频率均值，其次通过该均值与金定鸭每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，优先选择金定鸭某个位点等位基因频率为0或1，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点。
本发明还提供了一种鉴定金定鸭品种的SNP引物组合，所述引物组合包括用于扩增JD1P位点到JD7P位点的引物组；
各SNP位点引物的序列为：
Figure BDA0003173393210000021
本发明还提供了一种上述SNP位点组合在金定鸭品种鉴定中的应用。
本发明提供了一种金定鸭品种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸭基因组总DNA；
(2)根据所选SNP组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
(4)根据基因型结果，判断个体是否属于金定鸭品种。
优选的，所述步骤(1)中待测鸭的基因组DNA由该鸭种的个体翅静脉采血得到。
优选的，所述金定鸭中7个SNP位点JD1P～JD7P的基因型依次为TT、AA、TT、CC、TT、TT、GG。
优选的，所述步骤(4)中，如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合金定鸭对应的基因型，则判定该个体不属于金定鸭；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合金定鸭对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于金定鸭的概率。
优选的，贝叶斯定理计算公式如下：
Figure BDA0003173393210000031
其中，pi表示SNP组合中第i个SNP中其他品种对应基因型的频率。
优选的，所述SNP位点在金定鸭及其他品种中的基因型、基因频率如下表：
Figure BDA0003173393210000032
Figure BDA0003173393210000041
其中，其他品种的基因型频率是指测定的北京鸭，娄门鸭，高邮鸭，建昌鸭，连城白鸭，绍兴鸭等国内代表性品种基因型频率的平均值。
本发明的积极进步效果在于：
根据贝叶斯定理，任意1个SNP位点基因型判定为金定鸭的概率最低78.13％，最高87.72％；任意2个SNP位点联合基因型判定为金定鸭的概率达到92.94％以上；任意3个SNP位点联合基因型判定为金定鸭的概率达到98.06％以上；任意4个SNP位点联合基因型判定为金定鸭的概率达到99.59％以上；任意5个SNP位点联合基因型判定为金定鸭的概率达到99.92以上；任意6个SNP位点的联合基因型判定为金定鸭的概率为达到99.98％以上；全部7个SNP位点的联合基因型判定为金定鸭的概率为达到99.99％以上。任意一个SNP位点基因型排除金定鸭的概率即达到100％。
因此只要有一个SNP位点基因型不符合金定鸭相应的基因型，即可完全排除该个体属于金定鸭；任选2个SNP位点组合，符合金定鸭基因型的判定概率即可达到92％以上。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒金定鸭的泛滥程度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
一种用于鉴定金定鸭品种的SNP位点组合，选自如下JD1P位点到JD7P位点中的任1到7种：
序号 染色体 位点 参考基因组 突变位点
JD1P NC_040047.1 127643061 T C
JD2P NC_040048.1 112028426 A G
JD3P NC_040052.1 440691 T C
JD4P NC_040053.1 3779408 C T
JD5P NC_040054.1 18797161 T C
JD6P NC_040056.1 8694111 T C
JD7P NC_040060.1 11540267 G A
本发明SNP位点组合的筛选方法为：首先确定高邮鸭、绍兴鸭、北京鸭、连城白鸭、建昌鸭、娄门鸭等国内代表性品种的每个位点的不同等位基因频率均值，其次通过该均值与金定鸭每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，优先选择金定鸭某个位点等位基因频率为0或1，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点。
上述SNP位点组合在在金定鸭品种鉴定中的应用。
本发明提供了一种鉴定金定鸭品种的SNP引物组合，所述引物组合包括用于扩增JD1P位点到JD7P位点的引物组；
各SNP位点引物的序列为：
Figure BDA0003173393210000051
本发明还提供了一种金定鸭品种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸭基因组总DNA；
(2)根据所选SNP组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
(4)根据基因型结果，判断个体是否属于金定鸭品种。
在本发明鉴定方法中，优选从待测鸭的翅静脉采血获得基因组DNA，本发明对基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规提取方法即可，在本发明实施例中，优选酚-氯仿法提取基因组DNA。
本发明中，应用时采用JD1P～JD7P中的一个位点或者几个位点进行金定鸭品种的鉴定，并采用对应的上下游引物进行PCR扩增。本发明对PCR扩增方法没有特殊限定，采用本领域常规PCR扩增方法即可。
本发明中，金定鸭中7个SNP位点JD1P～JD7P的基因型依次为TT、AA、TT、CC、TT、TT、GG。通过对待测鸭PCR扩增产物测序后、判断基因型，与所选SNP组合对应的基因型进行比对，如果有一个不符合金定鸭对应的基因型，则判定该个体不属于金定鸭；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合金定鸭对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于金定鸭的概率。计算公式如下：
Figure BDA0003173393210000061
其中，pi表示SNP组合中第i个SNP中其他品种对应基因型的频率。
所述SNP位点在金定鸭及其他品种中的基因型、基因频率如下表：
Figure BDA0003173393210000062
其中，其他品种的基因型频率是指测定的北京鸭，娄门鸭，高邮鸭，建昌鸭，连城白鸭，绍兴鸭等国内代表性品种基因型频率的平均值。
例如，选择JD1P、JD4P、JD7P三个SNP位点，如果联合基因型为TT CC GG，则该个体属于金定鸭的概率为P＝1/(1+0.2×0.26×0.2711)＝0.9861。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
随机选择金定鸭保种场的金定鸭25只、北京鸭25只、山麻鸭25只，翅静脉采血，酚-氯仿法提取基因组DNA，根据下表中3个SNP位点的引物进行PCR扩增。
Figure BDA0003173393210000071
PCR体系(20μL)为：DNA模板2μL，正反向引物各1.0μL(10ng/μL)，天根PCR试剂盒中2×PCR试剂10μL，其余用超纯水补足。
PCR程序为：首先94℃变性5min，然后94℃30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃后延伸10min，4℃保存。所述PCR仪器为美国伯乐T100梯度PCR仪。
扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司对序列进行多态性检测和基因型判定。根据测序结果，3个位点联合基因型为TT CC TT的25个体判定为金定鸭的概率为98.56％，因此25个个体全部鉴定为金定鸭，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合TTCC TT基因型，因此判定为非金定鸭。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于鉴定金定鸭品种的SNP位点组合，其特征在于，选自如下JD1P位点到JD7P位点中的任1到7种：
JD1P位于NC_040047.1染色体上第127643061位，该位点核苷酸碱基为T或C；
JD2P位于NC_040048.1染色体上第112028426位，该位点核苷酸碱基为A或G；
JD3P位于NC_040052.1染色体上第440691位，该位点核苷酸碱基T或C；
JD4P位于NC_040053.1染色体上第3779408位，该位点核苷酸碱基C或T；
JD5P位于NC_040054.1染色体上第18797161位，该位点核苷酸碱基为T或C；
JD6P位于NC_040056.1染色体上第8694111位，该位点核苷酸碱基为T或C；
JD7P位于NC_040060.1染色体上第11540267位，该位点核苷酸碱基为G或A。
2.一种鉴定金定鸭品种的SNP引物组合，其特征在于，所述引物组合包括用于扩增权利要求1所述SNP位点组合中的全部SNP位点的引物组；
各SNP位点引物的序列为：
JD1F：5’CAGTCTGGAAAGAGGAAATGTGA3’
JD1R：5’ATTATACCTTTCTTGGCATTTTTA3’
JD2F：5’CAAGGGGGGATATGAGGTT3’
JD2R：5’GCAAGGCAGTCAAGGGAGC3’
JD3F：5’CCTGAATGGTGCTTTGTTTAC3’
JD3R：5’GCCTTCTGCCACTGCTGCTA3’
JD4F：5’TTCTGTCCCTTTTGCTCTTTG3’
JD4R：5’GCTGTTCTTCGGCATTCTCTT3’
JD5F：5’AGCCTTACGCTCTGCTTACAT3’
JD5R：5’ACTTCGCTTTTTTCTTTCCAT3’
JD6F：5’CAGAGAAGTGACCGGAGAAGA3’
JD6R：5’GGCAAAGTGGAGGTATGAGAA3’
JD7F：5’AATCTTCCAAGGATGGGGTCAAT3’
JD7R：5’TGATGAAAGCCAGGAGCAGAACT3’。
3.权利要求1所述SNP位点组合在金定鸭品种鉴定中的应用。
4.一种金定鸭品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测鸭基因组总DNA；
(2)根据所选SNP组合，利用权利要求2对应的引物对分别进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
(4)根据基因型结果，判断个体是否属于金定鸭品种。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中待测鸭的基因组DNA由该鸭种的个体翅静脉采血得到。
6.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述金定鸭中7个SNP位点JD1P～JD7P的基因型依次为TT、AA、TT、CC、TT、TT、GG。
7.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(4)中，如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合金定鸭对应的基因型，则判定该个体不属于金定鸭；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合金定鸭对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于金定鸭的概率。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，所述贝叶斯定理计算公式如下：
Figure FDA0003173393200000021
其中，pi表示SNP组合中第i个SNP中其他品种对应基因型的频率。
9.根据权利要求8所述的鉴定方法，其特征在于，所述SNP位点在金定鸭及其他品种中的基因型、基因型频率如下所示：
JD1P位点：当基因型为TT时，金定鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.2；当基因型为TC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.4124；当基因型为CC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.3876；
JD2P位点：当基因型为AA时，金定鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.1622；当基因型为AG时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.3083；当基因型为GG时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.5295；
JD3P位点：当基因型为TT时，金定鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.2067；当基因型为TC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.3367；当基因型为CC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.4567；
JD4P位点：当基因型为CC时，金定鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.26；当基因型为CT时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.38；当基因型为TT时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.36；
JD5P位点：当基因型为TT时，金定鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.14；当基因型为TC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.5；当基因型为CC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.36；
JD6P位点：当基因型为TT时，金定鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.2800；当基因型为TC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.2978；当基因型为CC时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.4222；
JD7P位点：当基因型为GG时，金定鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.2711；当基因型为GA时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.2622；当基因型为AA时，金定鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.4667。
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