CN113388686B - 一种鉴定高邮鸭品种的snp位点组合及其应用 - Google Patents

一种鉴定高邮鸭品种的snp位点组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定高邮鸭品种的SNP位点组合及其应用，所述SNP位点组合选自GY1P位点到GY7P位点中的任1到7种。本发明还公开了用于鉴定高邮鸭品种的SNP位点的引物组合。通过检测这7个SNP位点的基因型来联合判断待测个体是否属于高邮鸭。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒高邮鸭的泛滥程度。

Description

一种鉴定高邮鸭品种的SNP位点组合及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种鉴定高邮鸭品种的SNP位点组合及其应用。
背景技术
高邮鸭是中国著名的肉蛋兼用型地方品种，以肉质鲜美、善产双黄蛋著称。中心产区位于江苏省扬州市，端午时节本地民众有吃咸鸭蛋的习惯，其中双黄蛋尤得市场青睐。目前市场上有较多的假冒高邮鸭以及高邮鸭与其他品种的杂交个体冒充销售，对高邮鸭纯种个体市场造成了一定的冲击，严重影响了高邮鸭品牌。
目前市场上鉴别高邮鸭的方法主要依靠外观观察。这种观察主观性较强，鉴定错误率较高，尤其在鉴定高邮鸭与其他品种鸭杂种后代时，容易导致不正确的分类与鉴定。而且地方品种鸭刚出雏时较为相似，鉴定错误率也较高。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有位点丰富、分布广泛、遗传稳定性高、具有代表性、检测便捷快速等特点。SNP标记，利用个体基因组DNA中特有的品种差异性较大的SNP位点，通过不同位点组合的基因型进行品种鉴定，鉴定结果更加客观、准确。鉴于此，科研和实践中均急需开发一种能有效准确鉴定高邮鸭品种的产品及方法，应用于高邮鸭品种鉴定工作。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鉴定高邮鸭品种的SNP位点组合及其应用，通过检测提供的高邮鸭7个SNP位点的基因型来联合判断待测个体是否属于高邮鸭。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种用于鉴定高邮鸭品种的SNP位点组合，选自如下GY1P位点到GY7P位点中的任1到7种：
序号 染色体 位点 参考基因组 突变位点
GY1P NC_040046.1 192979743 G A
GY2P NC_040047.1 37795046 C T
GY3P NC_040047.1 80480437 A C
GY4P NC_040048.1 47452708 G C
GY5P NC_040049.1 23369926 C T
GY6P NC_040049.1 44007676 T G
GY7P NC_040056.1 8694111 T C
所述SNP位点组合的筛选方法为：首先确定金定鸭、绍兴鸭、北京鸭、连城白鸭、建昌鸭、娄门鸭等国内代表性品种的每个位点的不同等位基因频率均值，其次通过该均值与高邮鸭每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，优先选择高邮鸭某个位点等位基因频率为0或1，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点。
本发明还提供了一种鉴定高邮鸭品种的SNP引物组合，所述引物组合包括用于扩增GY1P位点到GY7P位点的引物组；
各SNP位点引物的序列为：
Figure BDA0003173423360000021
本发明还提供了一种上述SNP位点组合在高邮鸭品种鉴定中的应用。
本发明提供了一种高邮鸭品种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸭基因组总DNA；
(2)根据所选SNP组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
(4)根据基因型结果，判断个体是否属于高邮鸭品种。
优选的，所述步骤(1)中待测鸭的基因组DNA由该鸭种的个体翅静脉采血得到。
优选的，所述高邮鸭中7个SNP位点GY1P～GY7P的基因型依次为AA、TT、AA、CC、TT、GG、CC。
优选的，所述步骤(4)中，如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合高邮鸭对应的基因型，则判定该个体不属于高邮鸭；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合高邮鸭对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于高邮鸭的概率。
优选的，贝叶斯定理计算公式如下：
Figure BDA0003173423360000031
其中，pi表示SNP组合中第i个SNP中其他品种对应基因型的频率。
优选的，所述SNP位点在高邮鸭及其他品种中的基因型、基因频率如下表：
Figure BDA0003173423360000032
Figure BDA0003173423360000041
其中，其他品种的基因型频率是指选择金定鸭、绍兴鸭、北京鸭、连城白鸭、建昌鸭、娄门鸭等国内代表性品种，不同品种合并计算得到的每个位点的基因型频率均值。
本发明的积极进步效果在于：
根据贝叶斯定理，任意1个SNP位点基因型判定为高邮鸭的概率最低72.46％，最高86.96％；任意2个SNP位点联合基因型判定为高邮鸭的概率达到91.01％以上；任意3个SNP位点联合基因型判定为高邮鸭的概率达到97.68％以上；任意4个SNP位点联合基因型判定为高邮鸭的概率达到99.43％以上；任意5个SNP位点联合基因型判定为高邮鸭的概率达到99.87以上；任意6个SNP位点联合基因型判定为高邮鸭的概率达到99.98％以上；全部7个SNP位点的联合基因型判定为高邮鸭的概率为达到99.99％以上。任意一个SNP位点基因型排除高邮鸭的概率即达到100％。
因此只要有一个SNP位点基因型不符合高邮鸭相应的基因型，即可完全排除该个体属于高邮鸭；任选2个SNP位点组合，符合高邮鸭基因型的判定概率即可达到90％以上。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒高邮鸭的泛滥程度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
一种用于鉴定高邮鸭品种的SNP位点组合，选自如下GY1P位点到GY7P位点中的任1到7种：
序号 染色体 位点 参考基因组 突变位点
GY1P NC_040046.1 192979743 G A
GY2P NC_040047.1 37795046 C T
GY3P NC_040047.1 80480437 A C
GY4P NC_040048.1 47452708 G C
GY5P NC_040049.1 23369926 C T
GY6P NC_040049.1 44007676 T G
GY7P NC_040056.1 8694111 T C
本发明SNP位点组合的筛选方法为：首先确定金定鸭、绍兴鸭、北京鸭、连城白鸭、建昌鸭、娄门鸭等国内代表性品种的每个位点的不同等位基因频率均值，然后通过该均值与高邮鸭每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，优先选择高邮鸭某个位点等位基因频率为0或1，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点。
上述SNP位点组合在在高邮鸭品种鉴定中的应用。
本发明提供了一种鉴定高邮鸭品种的SNP引物组合，所述引物组合包括用于扩增GY1P位点到GY7P位点的引物组；
各SNP位点引物的序列为：
Figure BDA0003173423360000051
本发明还提供了一种高邮鸭品种的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸭基因组总DNA；
(2)根据所选SNP组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
(4)根据基因型结果，判断个体是否属于高邮鸭品种。
在本发明鉴定方法中，优选从待测鸭的翅静脉采血获得基因组DNA，本发明对基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规提取方法即可，在本发明实施例中，优选酚-氯仿法提取基因组DNA。
本发明中，应用时采用GY1P～GY7P中的一个位点或者几个位点进行高邮鸭品种的鉴定，并采用对应的上下游引物进行PCR扩增。本发明对PCR扩增方法没有特殊限定，采用本领域常规PCR扩增方法即可。
本发明中，高邮鸭中7个SNP位点GY1P～GY7P的基因型依次为AA、TT、AA、CC、TT、GG、CC。通过对待测鸭PCR扩增产物测序后、判断基因型，与所选SNP组合对应的基因型进行比对，如果有一个不符合高邮鸭对应的基因型，则判定该个体不属于高邮鸭；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合高邮鸭对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于高邮鸭的概率。计算公式如下：
Figure BDA0003173423360000061
其中，pi表示SNP组合中第i个SNP中其他品种对应基因型的频率。
所述SNP位点在高邮鸭及其他品种中的基因型、基因频率如下表：
Figure BDA0003173423360000062
例如，选择GY3P、GY5P、GY7P三个SNP位点，如果联合基因型为AA TT CC，则该个体属于高邮鸭的概率为P＝1/(1+0.24×0.17×0.22)＝0.9911。
其中，其他品种的基因型频率是指选择金定鸭、绍兴鸭、北京鸭、连城白鸭、建昌鸭、娄门鸭等国内代表性品种，不同品种合并计算得到的每个位点的基因型频率均值。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
随机选择江苏高邮鸭集团高邮鸭保种场的高邮鸭20只、金定鸭20只、山麻鸭20只，翅静脉采血，酚-氯仿法提取基因组DNA，根据下表中4个SNP位点的引物进行PCR扩增。
Figure BDA0003173423360000071
PCR体系(20μL)为：DNA模板2μL，正反向引物各1.5μL(10ng/μL)，天根PCR试剂盒中2×PCR试剂10μL，其余用超纯水补足。
PCR程序为：首先94℃变性1min，然后94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃后延伸5min，4℃保存。所述PCR仪器为美国伯乐T100梯度PCR仪。
扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司对序列进行多态性检测和基因型判定。根据测序结果，4个位点联合基因型为AA TT TT CC的20个个体判定为高邮鸭的概率为99.63％，因此20个个体全部鉴定为高邮鸭，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合AATT TT CC基因型，因此判定为非高邮鸭。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于鉴定高邮鸭品种的SNP引物组合，其特征在于，所述引物组合可以扩增选自如下GY1P位点到GY7P位点中的3到7种：
GY1P位于NC_040046.1染色体上第192979743位，该SNP为G或A多态；
GY2P位于NC_040047.1染色体上第37795046位，该SNP为C或T多态；
GY3P位于NC_040047.1染色体上第80480437位，该SNP为A或C多态；
GY4P位于NC_040048.1染色体上第47452708位，该SNP为G或C多态；
GY5P位于NC_040049.1染色体上第23369926位，该SNP为C或T多态；
GY6P位于NC_040049.1染色体上第44007676位，该SNP为T或G多态；
GY7P位于NC_040056.1染色体上第8694111位，该SNP为T或C多态。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定高邮鸭品种的SNP引物组合，各SNP位点引物的序列为：
GY1F：5’AGTGCACCCTCAGCAAGTTT3’
GY1R：5’AAGCACACACTGCTAGCTCA3’
GY2F：5’GCTCTCTTAGTGTCTCCATCTCC3’
GY2R：5’CATTCAACCCTTCAGATCCCCA3’
GY3F：5’AAAAGAGAAGAATCAAGCTCCAC3’
GY3R：5’AGGAATGCAAAATTCCTTTGTTCT3’
GY4F：5’CCAGAATCCACAAACAGAGGC3’
GY4R：5’CATCGAGCCCAACCTCTGAC3’
GY5F：5’GCAGTCAGGCAACACACAAG3’
GY5R：5’ACTAGGAAGACTGAAGCCACA3’
GY6F：5’TCCCTGAGACAGGGGTTCTT3’
GY6R：5’TCTGGACAGCTTAGCACACC3’
GY7F：5’TTTACTGCTGGCTGGCTACC3’
GY7R：5’CCAGTAAGCAGGACAGGCAA3’。
3.权利要求1或2任一项所述SNP引物组合在高邮鸭品种鉴定中的应用。
4.一种高邮鸭品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测鸭基因组总DNA;
（2）根据所选SNP组合，利用权利要求2对应的引物对分别进行PCR扩增；
（3）将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
（4）根据基因型结果，判断个体是否属于高邮鸭品种，如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合高邮鸭对应的基因型，则判定该个体不属于高邮鸭；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合高邮鸭对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于高邮鸭的概率。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤（1）中待测鸭的基因组DNA由该鸭种的个体翅静脉采血得到。
6.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述高邮鸭中7个SNP位点GY1P~GY7P的基因型依次为AA、TT、AA、CC、TT、GG、CC。
7.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述贝叶斯定理计算公式如下：
Figure 499783DEST_PATH_IMAGE001
其中，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表示SNP组合中第
Figure 479240DEST_PATH_IMAGE003
个SNP中其他品种对应基因型的频率。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，所述SNP位点在高邮鸭及其他品种中的基因型、基因型频率如下所示：
GY1P位点：当基因型为GG时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.32；当基因型为GA时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.30；当基因型为AA时，高邮鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.38；
GY2P位点：当基因型为CC时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.42；当基因型为CT时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.32；当基因型为TT时，高邮鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.26；
GY3P位点：当基因型为AA时，高邮鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.24；当基因型为AC时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.40；当基因型为CC时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.36；
GY4P位点：当基因型为GG时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.40；当基因型为GC时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.36；当基因型为CC时，高邮鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.24；
GY5P位点：当基因型为CC时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.38；当基因型为CT时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.45；当基因型为TT时，高邮鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.17；
GY6P位点：当基因型为TT时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.34；当基因型为TG时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.51；当基因型为GG时，高邮鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.15；
GY7P位点：当基因型为TT时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.48；当基因型为TC时，高邮鸭的基因型频率为0，其他品种的基因型频率为0.30；当基因型为CC时，高邮鸭的基因型频率为1，其他品种的基因型频率为0.22。
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