CN110157810A

CN110157810A - 一种与夏南牛生长性状相关的cnv标记的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN110157810A
Application number: CN201910398624.6A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 彭术军; 曹修凯; 刘梅; 郝丹; 祁兴磊; 黄永震; 雷初朝; 蓝贤勇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-05-14
Also published as: CN110157810B

Abstract

本发明公开了一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法及其应用：以夏南牛血液基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增夏南牛APOL3基因拷贝数变异区域和内参基因BTF3部分片段，根据2*2^‑ΔΔCt将定量结果划分为增加型、减少型、正常型，从而鉴定夏南牛APOL3基因的拷贝数变异类型。本发明所检测的夏南牛APOL3基因的不同拷贝数类型与个体生长性状差异存在显著关联，通过在DNA水平上检测与夏南牛生长性状相关的CNV标记，可用于夏南牛生长性状的标记辅助选择，加快建立优质夏南牛资源群体。

Description

一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种检测与夏南牛生长性状相关的APOL3基因CNV标记的方法与应用。

背景技术

随着牛基因组的组装和功能元件被注释，在动物育种中，越来越多的遗传变异被用作提高肉牛肉质和生长性状的分子标记，如单核苷酸多态性(SNP)和Indels。虽然SNP在牛生长性状变异中发生的频率更高，但是大部分SNP仅代表一个点突变，对于基因表达调控的影响并不是十分的显著，不能完全反映表型变化。因此，寻找全基因组范围内的更有效的遗传变异分子标记便显得十分迫切。

拷贝数变异(copy number variations,CNVs)是由基因组发生重排而导致的结构变异，变异片段从50bp到几个Mb不等，主要表现为基因组大片段的减少(copy numberloss)，增加(copy number gain)，重组以及多位点的复杂变异等。有些拷贝数变异属于多态性范畴，并不对动植物的表型造成影响，而有些拷贝数变异则通过剂量效应来影响基因表达，继而造成表型上的差异。

目前，拷贝数变异的检测方法主要分为两种，一种是芯片技术，另一种是测序技术。其中芯片技术包括：(1)微阵列比较基因杂交芯片(aCGH，array-based comparativegenomic hybridization)：是在全基因组范围内扫描拷贝数变异区的高分辨率分子核型技术，在全部染色体上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测，从而发现拷贝数变异。但也具有明显的技术缺陷，该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广；(2)单核苷酸多态性芯片(SNP Array)：是利用芯片探针的平均信号强度和最小等位基因频率，并结合统计模型进行拷贝数的推断。然而利用SNP芯片推断拷贝数变异的准确性并不比aCGH芯片高，而且不同算法检测的结果差异较大。随着测序技术的不断发展，直接通过重测序检测基因组结构变异成为了目前最为有效的检测方法。近年来，二代测序成为检测拷贝数变异最为常用的方法之一。另外，实时荧光定量PCR(qPCR)已经成为快速验证测序结果和检测拷贝数的常规手段，根据qPCR所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。荧光染料嵌入法在PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2*2^-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。该方法的优点是成本低、无需设计探针、操作简便；其缺点是检测目的片段是绝对拷贝数，并不适用于大样本的高通量检测。

APOL3基因在胆固醇转运和细胞过程(如调节基因转录和信号转导)中起重要的调控作用。研究表明，在癌细胞中超表达APOL3可诱导细胞凋亡，提示其可能抑制细胞增殖。此外，APOL3蛋白可能参与免疫调控，并与一些疾病有关，如乳腺癌和骨关节炎等。目前，关于APOL3基因的CNV对夏南牛生长性状影响的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法及其应用，为夏南牛分子育种提供理论依据，便于夏南牛生长性状的标记辅助选择，加快建立生长性状优异的夏南牛种群。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，包括以下步骤：以夏南牛血液全基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增夏南牛APOL3基因拷贝数变异区域及内参基因BTF3部分片段，然后根据定量结果鉴定夏南牛个体APOL3基因的拷贝数变异类型；所述的拷贝数变异区域位于牛APOL3基因候选区域Chr5:75043324-75084996内(参考序列为AC_000162)。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2*2^-ΔΔCt>2.5；减少型，2*2^-ΔΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^-ΔΔCt≤2.5(例如，2*2^-ΔΔCt≈2)。

优选的，所述的引物对P1为：

上游引物F1：5′-TGATGTTGGGTTGAGAAGAGA-3′；

下游引物R1：5′-CAGATGATGAAGCAGAGAGTAGTT-3′；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5′-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3′；

下游引物R2：5′-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3′。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序包括以下步骤：(1)95℃预变性30s；(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环。

上述与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法在夏南牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述APOL3基因拷贝数变异区域的不同拷贝数变异类型与夏南牛的生长性状显著相关，其中具有增加型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，体高、十字部高、管围)上显著优于具有减少型和正常型拷贝数变异类型的个体。

一种检测与夏南牛生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物对P1及引物对P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据夏南牛基因组CNVs的筛查结果，以夏南牛APOL3基因候选区域Chr5:75043324-75084996内的拷贝数变异区域为检测位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在夏南牛群体中的拷贝数变异情况，该检测位点作为CNV标记，与夏南牛体高、十字部高、管围等重要经济性状显著关联。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的夏南牛APOL3基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于母牛的早期选育，甚至在个体刚出生时就可进行选择；

(2)检测牛APOL3基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；

(3)可大规模检测CNV。

附图说明

图1为本发明实施例中进行qPCR(APOL3基因)绘制的扩增曲线。

图2是本发明实施例中进行qPCR(APOL3基因)绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明利用实时荧光定量PCR对夏南牛APOL3基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(2)利用SPSS20.0和Grapd7.01软件将拷贝数变异类型与牛生长性状进行关联分析，筛选到一个与夏南牛生长性状相关的CNV标记(定位于APOL3基因候选区域Chr5:75043324-75084996内的CNV，参考基因组序列为AC_000162)；

(3)根据个体拷贝数变异类型进行生长性状优异的夏南牛选育。

本发明具体包括以下步骤：

1、夏南牛样本采集

本发明具体以夏南牛这一中国肉牛品种作为检测对象，150头夏南牛的血样样本采集自河南省驻马店市泌阳县夏南牛良种繁育中心(采集时间2016年6月)。

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Müllenbach et al(1989)方法。

3、目标序列及内参序列的扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛APOL3基因序列(GenBank Accession No.AC_000162)为参考序列，利用NCBI数据库设计扩增夏南牛APOL3基因拷贝数变异区域(目标序列，定位于APOL3基因候选区域Chr5:75043324-75084996内)的实时荧光定量PCR引物对，扩增的内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即BTF3基因中的一段166bp的序列，扩增引物具体参见表1(引物设计完成时间为2016年9月)。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

进行实时荧光定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计为：25ng/μL模板DNA(提取自夏南牛血样的基因组DNA)1μL、10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及Premix Ex Taq TM II6.25μL和ddH₂O4.25μL。

进行实时荧光定量PCR所用的反应程序为：(1)预变性：95℃30s；(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环；(3)绘制溶解曲线：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

通过绘制扩增曲线(图1)和溶解峰来确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2*2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目标序列}-C_{T内参序列})_实验组-(C_{T目标序列}-C_{T内参序列})_对照组。实验组为待检测CNV的个体样本，对照组为已知无拷贝数变异的个体样本。2*2^-ΔΔCt表示的是实验组目标序列的拷贝数相对于对照组的倍数，C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-ΔΔCt的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

根据2*2^-ΔΔCt计算出归一化值。当目标序列为减少型时，计算出归一化值2*2^-ΔΔCt<1.5。当目标序列为增加型时，计算出归一化值2*2^-ΔΔCt>2.5。当目标序列为正常型时，计算出归一化值2*2^-ΔΔCt≈2。

5、夏南牛APOL3基因CNV位点与生长性状的关联分析

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS20.0和Grapd7.01软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+A_i+CNV_j+e_ijk

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i头个体的年龄，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示，参见表2。

表2.夏南牛APOL3基因CNV与生长性状的关联分析

注：同一性状均值肩上字母不同表示差异显著；*P<0.05；**P<0.01

关联分析结果表明(见表2)：夏南牛APOL3基因CNV位点可显著影响成年个体的体高、十字部高和管围。并且，优势拷贝数变异类型均为增加型，表明APOL3基因的CNV位点(定位于APOL3基因候选区域Chr5:75043324-75084996内)可作为一个提高夏南牛生长性状的候选分子遗传标记(CNV标记)。

6、CNV标记在夏南牛选育中的应用

利用以上获得的候选分子遗传标记，可以对夏南牛进行相关生长性状的分子标记辅助选择，从而加快夏南牛品种改良的选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

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tgatgttggg ttgagaagag a 21

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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Claims

1.一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以夏南牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增夏南牛APOL3基因拷贝数变异区域和内参基因BTF3部分片段，然后根据定量结果鉴定夏南牛APOL3基因的拷贝数变异类型；所述的拷贝数变异区域位于APOL3基因候选区域Chr5:75043324-75084996内。

2.如权利要求1所述一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2*2^-ΔΔCt>2.5；减少型，2*2^-ΔΔCt<1.5；正常型，1.5≤2*2^-ΔΔCt≤2.5。

3.如权利要求1所述一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的APOL3基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5′-TGATGTTGGGTTGAGAAGAGA-3′；

下游引物R1：5′-CAGATGATGAAGCAGAGAGTAGTT-3′；

所述的内参基因BTF3部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5′-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3′；

下游引物R2：5′-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3′。

4.如权利要求1所述一种与夏南牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环。

5.如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在夏南牛分子标记辅助选择育种中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：具有增加型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有减少型和正常型拷贝数变异类型的个体。

7.一种检测与夏南牛生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增夏南牛APOL3基因拷贝数变异区域的引物对；所述的拷贝数变异区域位于APOL3基因候选区域Chr5:75043324-75084996内。

8.如权利要求7所述一种检测与夏南牛生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的APOL3基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：

上游引物F1：5′-TGATGTTGGGTTGAGAAGAGA-3′；

下游引物R1：5′-CAGATGATGAAGCAGAGAGTAGTT-3′。

9.如权利要求7所述一种检测与夏南牛生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增内参序列的引物对，内参序列为夏南牛BTF3基因部分片段。

10.如权利要求9所述一种检测与夏南牛生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的BTF3基因部分片段的扩增引物对为：

上游引物F2：5′-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3′；

下游引物R2：5′-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3′。