CN116287288A - 鉴定屯昌猪及其肉制品的snp标记组合和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定屯昌猪及其肉制品的SNP标记组合和鉴定方法，所述SNP标记组合选择以下的一种或多种：sus2‑146656783位于猪2号染色体第146656783位，sus9‑19255607位于猪9号染色体第19255607位，sus11‑62342546位于猪11号染色体第62342546位，sus13‑194860942位于猪13号染色体第194860942位，sus19‑45525420位于猪19号染色体第45525420位。本发明以屯昌猪品种特有SNP位点为鉴定依据，能够将屯昌猪与其他猪品种(品系)相互鉴定区分，并能将屯昌猪与常见西方猪种鉴定区分。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种食品安全检测领域，具体涉及一种鉴定屯昌猪及其肉制品的SNP标记组合和鉴定方法。
背景技术
屯昌猪是海南省屯昌县特有的黑猪品种，以皮薄、肉嫩、味香而闻名海南。但因为生长速度和体型与市场常见的杜洛克、长白、大白猪等外来杂交后代猪种有一定差距，而且为了获取更高的利益市场上出现杂交猪肉冒充屯昌猪的现象。为了有效地鉴别屯昌猪品种以开展保种和开发利用工作，急需一种快捷高效低成本的检测方法。
核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有位点丰富、分布广泛、遗传稳定性高、具有代表性、检测便捷快速等特点。而其中，在一定的品种(群体)范围内，只在一个群体中出现的SNP被称作品种特异SNP。品种特异SNP位点筛选和位点组合方法研究是开展品种和制品鉴定的关键。第三代分子标记SNP相对于前两代分子标记具有变异丰富、对DNA样本要求低、稳定性高、测定准确、检测方法简便且通量高等优点。目前，第三代分子标记SNP已广泛应用于亲子鉴定、动植物品种(品系)鉴定、遗传育种等领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种鉴定屯昌猪及其肉制品的SNP标记组合和鉴定方法。
本发明的技术方案为：一种SNP标记组合在鉴定屯昌猪及其肉制品上的应用，所述SNP标记组合选择以下的一种或多种：
sus2-146656783位于猪2号染色体第146656783位，具有A或G多态；
sus9-19255607位于猪9号染色体第19255607位，具有G或A多态；
sus11-62342546位于猪11号染色体第62342546位，具有G或A多态；
sus13-194860942位于猪13号染色体第194860942位，具有C或T多态；
sus19-45525420位于猪19号染色体第45525420位，具有G或C多态。
本发明的点位是以猪基因组数据GCF_000003025.6_Sscrofa11.1_genomic为参考，数据地址为https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/003/025/GCF_000003025.6_Sscrofa11.1。
进一步地，所述SNP标记组合为以下组合的一种或多种：
组合1：sus2-146656783、sus9-19255607、sus11-62342546；
组合2：sus2-146656783、sus9-19255607、sus13-194860942；
组合3：sus2-146656783、sus9-19255607、sus19-45525420；
组合4：sus2-146656783、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合5：sus2-146656783、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合6：sus2-146656783、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合7：sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合8：sus9-19255607、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合9：sus9-19255607、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合10：sus11-62342546、sus13-194860942、sus19-45525420。
本发明还公开了一种屯昌猪或其肉制品的鉴定方法，通过检测试剂检测待测样品基因组DNA中SNP位点的基因型，当任意三个位点出现突变型时，可鉴定为屯昌猪或其肉制品；所述SNP位点如下：
sus2-146656783位于猪2号染色体第146656783位，具有A或G多态，G为突变型；
sus9-19255607位于猪9号染色体第19255607位，具有G或A多态，A为突变型；
sus11-62342546位于猪11号染色体第62342546位，具有G或A多态，A为突变型；
sus13-194860942位于猪13号染色体第194860942位，具有C或T多态，T为突变型；
sus19-45525420位于猪19号染色体第45525420位，具有G或C多态，C为突变型。
进一步地，所述鉴定方法为：提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后以SEQ ID No.1～SEQ ID No.10所示的引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP位点的信息，当任意三个SNP位点处同时出现突变型时，即可鉴定为屯昌猪或其肉制品。
进一步地，所述任意三个SNP位点是指以下10个组合中的一种或多种：
组合1：sus2-146656783、sus9-19255607、sus11-62342546；
组合2：sus2-146656783、sus9-19255607、sus13-194860942；
组合3：sus2-146656783、sus9-19255607、sus19-45525420；
组合4：sus2-146656783、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合5：sus2-146656783、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合6：sus2-146656783、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合7：sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合8：sus9-19255607、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合9：sus9-19255607、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合10：sus11-62342546、sus13-194860942、sus19-45525420。
本发明还公开了一种检测SNP位点多态性的试剂，所述SNP位点为sus2-146656783、sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942或sus19-45525420中的一种或多种；
sus2-146656783位于猪2号染色体第146656783位，具有A或G多态；
sus9-19255607位于猪9号染色体第19255607位，具有G或A多态；
sus11-62342546位于猪11号染色体第62342546位，具有G或A多态；
sus13-194860942位于猪13号染色体第194860942位，具有C或T多态；
sus19-45525420位于猪19号染色体第45525420位，具有G或C多态。
进一步地，所述试剂为以下SNP分子标记引物对中的一对或多对：
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；
引物对sus9-19255607：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
本发明还公开了一种含有上述所述的试剂的试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以屯昌猪品种特有SNP位点为鉴定依据，从分子层面研究鉴别屯昌猪的方法，并以Sanger测序为主要分子鉴定方法，能够将屯昌猪与其他猪品种(品系)相互鉴定区分，并能将屯昌猪与常见西方猪种鉴定区分，例如：梅山猪、荣昌猪、金华猪、长白猪、大白猪、杜洛克、皮特兰、巴克夏等。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1、SNP的发现
基于群体分化系数法(Fst)提取并通过进一步筛选获得到屯昌猪特有的SNP信息，包括：sus2-146656783、sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942和sus19-45525420，所述sus2-146656783表示猪2号染色体第146656783位位点，sus9-19255607表示猪9号染色体第19255607位位点，sus11-62342546表示猪11号染色体第62342546位位点，sus13-194860942表示猪13号染色体第194860942位位点，sus19-45525420表示猪19号染色体第45525420位位点。上述点位是以猪基因组数据GCF_000003025.6_Sscrofa11.1_genomic为参考，数据地址为https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/003/025/GCF_000003025.6_Sscrof a11.1。
表1 5个SNP点位的碱基多态性情况
| SNP | Ref | Alt |
| sus2-146656783 | A | G |
| sus9-19255607 | G | A |
| sus11-62342546 | G | A |
| sus13-194860942 | C | T |
| sus19-45525420 | G | C |
表中Ref代表参考基因型，Alt代表突变基因型。
2、基于上述SNP标记的屯昌猪及生肉制品鉴定
首先提取待鉴定的生猪肉或其肉制品的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记各个检测位点的信息，当SNP位点处出现特异突变，即可鉴定为屯昌猪及其肉质制品。
所述的PCR扩增，其中涉及的引物如表2所示：
表2 扩增位点引物及产物信息
表中F代表上游引物，R代表下游引物，length代表标准产物长度，F'-position代表SNP位点在扩增产物的位置。
所述的PCR扩增，反应体系为模板DNA 1ng/uL、上下游引物各1uL、H2O 17uL、2×Taq PCR Master MixⅡ20uL；和/或，所述PCR反应的反应程序为94℃预变性3min，94℃预变性30s，58℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸5min。
所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5％。
所述的凝胶电泳，其条带长度要求为如表2所示。
测序产物鉴定位点对比信息如表1所示：
各个检测位点的突变基因型与参考基因型见表1所示，当待测猪检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测猪检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义，例如一头待测猪A在sus2-146656783位点，如果测序数据为A，则认为待测猪A在sus2-146656783位点不具备鉴定意义；如果测序数据为G，则认为待测猪A在sus2-146656783位点具有鉴定意义。
3、SNP标记组合
由于单个位点作为鉴定依据可能存在假阳性错判，为了提高准确性，可以使用任意三个点位同时存在突变来作为判断依据，这样可以大幅度的提高准确性。
本发明利用位点组合作为鉴定Marker，各个鉴定位点组合鉴定Marker信息如表3所示。
表3 鉴定标记组合信息
如表3所示，Marker1-10为屯昌猪鉴定标记组合，例如当待测猪A具备10个Marker组合中的任意一种位点突变组合的时候，则认为待测猪A为屯昌猪。
所述的屯昌猪肉制品是指屯昌猪分割肉及以屯昌猪为原料加工制备的腌制品和熟食制品。
随机选取待测猪种耳组织样本5份，采用SDS法提取组织DNA。
利用引物对DNA样品进行PCR反应扩增。
PCR反应的反应体系为40uL体系：模板DNA 1ng/uL、上下游引物各1uL、H2O 17uL、2×Taq PCR Master MixⅡ20uL；和/或，PCR反应的反应程序为94℃预变性3min，94℃预变性30s，58℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸5min。
用1.5％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，凝胶电泳条件为电流200mA，电压120伏，时间20～25分钟。不同引物的扩增产物与表2中的标准产物长度进行比对，产物长度在误差范围内且与标准产物长度一致，则认为扩增结果合格。
将合格的样本PCR扩增产物进行Sanger测序，得到各个检测位点的信息，对测序结果进行分析：
表4 样本测序结果SNP多态性分析表
| 样品/SNP | Ref | Alt | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| sus2-146656783 | A | G | √ | √ | |||
| sus9-19255607 | G | A | √ | √ | √ | ||
| sus11-62342546 | G | A | √ | √ | √ | ||
| sus13-194860942 | C | T | √ | √ | √ | ||
| sus19-45525420 | G | C | √ | √ | √ | √ |
表中Ref参考基因型，Alt突变基因型，√代表检测到突变基因型。
表4所示，由测序数据可得，若只采用单一位点作为鉴定依据，一头待测猪同时归属于多个品种。
利用位点组合Marker的方式来进行鉴定：1号猪在所有待测位点检测到突变，符合Marker1-10的鉴定信息，鉴定1号猪为屯昌猪；2号猪在所有待测位点检测到突变符合Marker1-10的鉴定信息，鉴定2号猪为屯昌猪；3号猪在sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942、sus19-45525420位点检测到突变，符合Marker7、Marker8、Marker9、Marker10，鉴定3号猪为屯昌猪；4号猪在所有位点都检测不到突变，不符合Marker信息，鉴定4号猪不是屯昌猪；5号猪在sus19-45525420位点检测到突变，不符合Marker信息，鉴定5号猪不是屯昌猪。
目前国内外没有关于屯昌猪种及其肉制品品种(品系)鉴定的相关专利，将第三代分子标记运用于屯昌猪及其肉制品品种(品系)鉴定，填补了市场的空缺，有效解决了屯昌猪(品系)的鉴伪问题。该鉴定方法相对于现有利用第一代分子标记(RFLP)和第二代分子标记(SSR)做猪种鉴定的专利，具有操作更加简单、结果更加准确、快速高效的优点。同时本发明利用第三代分子标记SNP克服了前两代分子标记可使用位点少的缺点，相对前两代分子标记的鉴别技术来说，也简化了鉴别方法。
Claims (8)
1.一种SNP标记组合在鉴定屯昌猪及其肉制品上的应用，其特征在于，所述SNP标记组合选自以下5个SNP标记的一种或多种：
sus2-146656783位于猪2号染色体第146656783位，具有A或G多态；
sus9-19255607位于猪9号染色体第19255607位，具有G或A多态；
sus11-62342546位于猪11号染色体第62342546位，具有G或A多态；
sus13-194860942位于猪13号染色体第194860942位，具有C或T多态；
sus19-45525420位于猪19号染色体第45525420位，具有G或C多态。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNP标记组合为以下组合的一种或多种：
组合1：sus2-146656783、sus9-19255607、sus11-62342546；
组合2：sus2-146656783、sus9-19255607、sus13-194860942；
组合3：sus2-146656783、sus9-19255607、sus19-45525420；
组合4：sus2-146656783、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合5：sus2-146656783、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合6：sus2-146656783、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合7：sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合8：sus9-19255607、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合9：sus9-19255607、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合10：sus11-62342546、sus13-194860942、sus19-45525420。
3.一种屯昌猪或其肉制品的鉴定方法，其特征在于，通过检测试剂检测待测样品基因组DNA中SNP位点的基因型，当任意三个位点出现突变型时，可鉴定为屯昌猪或其肉制品；所述SNP位点如下：
sus2-146656783位于猪2号染色体第146656783位，具有A或G多态，G为突变型；
sus9-19255607位于猪9号染色体第19255607位，具有G或A多态，A为突变型；
sus11-62342546位于猪11号染色体第62342546位，具有G或A多态，A为突变型；
sus13-194860942位于猪13号染色体第194860942位，具有C或T多态，T为突变型；
sus19-45525420位于猪19号染色体第45525420位，具有G或C多态，C为突变型。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法为：提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后以SEQ ID No.1～SEQ ID No.10所示的引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP位点的信息，当任意三个SNP位点处同时出现突变型时，即可鉴定为屯昌猪或其肉制品。
5.根据权利要求3或4所述的鉴定方法，其特征在于，所述任意三个SNP位点是指以下10个组合中的一种或多种：
组合1：sus2-146656783、sus9-19255607、sus11-62342546；
组合2：sus2-146656783、sus9-19255607、sus13-194860942；
组合3：sus2-146656783、sus9-19255607、sus19-45525420；
组合4：sus2-146656783、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合5：sus2-146656783、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合6：sus2-146656783、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合7：sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942；
组合8：sus9-19255607、sus11-62342546、sus19-45525420；
组合9：sus9-19255607、sus13-194860942、sus19-45525420；
组合10：sus11-62342546、sus13-194860942、sus19-45525420。
6.一种检测SNP位点多态性的试剂，其特征在于，所述SNP位点为sus2-146656783、sus9-19255607、sus11-62342546、sus13-194860942或sus19-45525420中的一种或多种；
sus2-146656783位于猪2号染色体第146656783位，具有A或G多态；
sus9-19255607位于猪9号染色体第19255607位，具有G或A多态；
sus11-62342546位于猪11号染色体第62342546位，具有G或A多态；
sus13-194860942位于猪13号染色体第194860942位，具有C或T多态；
sus19-45525420位于猪19号染色体第45525420位，具有G或C多态。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述试剂为以下SNP分子标记引物对中的一对或多对：
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；
引物对sus9-19255607：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；
引物对sus2-146656783：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
8.含有权利要求6或7所述的试剂的试剂盒。
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