CN111172295A - 一种检测黄牛vamp7基因cnv标记的方法及专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法及专用试剂盒：以黄牛的血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增黄牛VAMP7基因CNV区域和参考基因BTF3的部分片段，根据2*2^‑ΔΔCt将定量结果分为插入型、缺失型和正常型，从而鉴定黄牛VAMP7基因的拷贝数变异类型。与云岭牛、夏南牛、皮南牛和郏县红牛生产数据的关联分析显示，正常型个体的十字部高显著高于插入型和正常型个体。本发明通过在DNA水平上检测与云岭牛生长性状密切相关的CNV标记，可用于快速建立云岭牛等地方黄牛品种的遗传资源优势种群，有利于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法及专用试剂盒

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及利用QPCR检测黄牛VAMP7基因的拷贝数变异位点的基因型及VAMP7基因CNV标记在分子标记辅助选择中的应用。

背景技术

自20世纪80年代以来，随着信息技术和分子生物技术的迅猛发展，动物育种技术的研究已逐渐从宏观的群体水平进入微观的分子水平，与传统的育种方法相比，动物分子育种是直接在分子水平上对性状的基因进行选择，因此选种和育种的准确性都更高。随着动物分子育种理论及应用技术不断成熟完善，肉牛分子育种工作取得了突飞猛进的发展。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)是指与参考基因组序列相比，所发生的长度在50bp到数Mb范围内的变异，包括重复、缺失、插入、易位和衍生出的染色体结构变异，是影响动物表型多样性和进化适应的主要因素之一，可通过多种机制对机体进行调节，如基因剂量和转录结构的改变。自首次构建出人类(Homo sapiens)基因组第一代CNV图谱后，CNV在人类和动物中的研究越来越多。研究表明，CNV与动物的遗传变异以及家畜的重要经济特征有关。

对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如QPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。其中，实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。根据QPCR所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子后，当它结合到双链DNA小沟部位时，会发出很强的荧光，在PCR延伸阶段能够被检测到，具有较强的敏感性，相对于荧光探针类来说价格较低，因此被广泛应用。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2^-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。

VAMP7(Vesicle Associated Membrane Protein 7)基因一种蛋白质编码基因，该蛋白是N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)家族的成员。VAMP7蛋白定位于晚期内体和溶酶体，参与囊泡介导的转运和网格蛋白衍生的囊泡出芽。目前揭示VAMP7的功能主要与钙对溶酶体胞吐作用调节、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的脱粒过程以及自然杀伤细胞杀死靶细胞有关。

云岭牛是通过婆罗门牛(Brahman)、莫累灰(Murray Grey)和云南黄牛(YunnanYellow)杂交选育出来的肉用地方黄牛品种。目前，尚未见有关VAMP7基因CNV对云岭牛生长性状影响的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法及专用试剂盒，从而加快黄牛的选育进程。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法，包括以下步骤：

以黄牛(例如，云岭牛、夏南牛、皮南牛、郏县红牛)的血液全基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增VAMP7基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛VAMP7基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-GCTAGCGTGTACTTTTGGTGT-3’

下游引物R1：5’-ACTTAGCTAAACAGTGGCTAGG-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

优选的，所述的VAMP7基因的拷贝数变异区域位于牛VAMP7基因参考基因组序列AC_000170.1的14678001bp-14686000bp。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据拷贝数(即2*2^-ΔΔCt)将定量结果分为的三类：插入型，拷贝数大于2；缺失型，拷贝数小于2；正常型，拷贝数等于2。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计为：10ng/μL模板DNA1μL、10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×SYBR GreenQPCR Mix 6.25μL，加ddH₂O至12.5μL。

优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性5～10min；(2)95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共39个循环。

优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为166bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用，具有正常型拷贝数变异类型的黄牛(例如，云岭牛)个体在生长性状(例如，十字部高)上较优。

一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物对P1及引物对P2。

本发明的有益效果体现在：

本发明以牛VAMP7基因候选区域Chr 13：14678001-14686000为候选位点，通过检测该位点在四个不同黄牛品种群体中的拷贝数变异情况，并与体高、体重、十字部高等重要经济性状进行关联分析，发现了在DNA水平上与黄牛(例如，云岭牛)生长性状(例如，十字部高)密切相关的CNV标记，可作为云岭牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，快速建立遗传资源优良的黄牛种群，便于黄牛生长性状的标记辅助选择。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的黄牛VAMP7基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于母牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择。

(2)检测VAMP7基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便，便于推广应用。

(3)VAMP7基因拷贝数变异位点的检出，为黄牛的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为VAMP7基因CNV检测引物PCR扩增产物电泳图；图1中：最右侧泳道为DNAmarker I，条带自下而上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp，其余泳道为VAMP7基因特异性引物(引物对P1)PCR产物，片段大小为166bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明提出了一种基于QPCR技术检测黄牛VAMP7基因的CNV标记方法，其中的CNV是指牛VAMP7基因候选区域(Chr 13：14678001-14686000)的拷贝数变异。

1、黄牛样本采集

本发明以云岭牛、夏南牛、皮南牛和郏县红牛作为检测对象，分别从云南省昆明市草地动物科学研究院、河南省驻马店市泌阳县夏南牛科技有限公司、河南省南阳市新野县以及河南省平顶山市郏县红牛良种繁育中心采集414头生长数据资料相对完善的地方黄牛个体的血液样本(见表1)。

表1.样品信息

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管；重复本步骤1次。

⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩DNA中加入80～100μL的TE，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。

3、目的基因及参考基因扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛VAMP7基因(目的基因)序列(GenBank Accession No.AC_000170.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计QPCR引物(引物对P1)，扩增VAMP7基因拷贝数变异区域的一段166bp的序列；以NCBI所公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增参考基因(BTF3基因)中一段166bp的序列的QPCR引物(引物对P2)。引物对序列信息如表2所示。

表2.实时荧光定量PCR的引物信息

注明：F表示上游引物，R表示下游引物。

进行QPCR所用的扩增体系以12.5μL计为：10ng/μL模板DNA(血液基因组DNA)1μL、10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×SYBR Green QPCR Mix6.25μL，加ddH₂O补足12.5μL。

QPCR扩增的反应程序为：(1)预变性：95℃，5min；(2)扩增反应：95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，39个循环。

绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到95℃，+0.5℃5s。

通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于QPCR分析。扩增曲线平滑，表明QPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好。引物的特异性经PCR验证，参见图1。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目的基因和参考基因的引物(引物对P1和P2)进行扩增，并且每个样本3个重复。根据2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_实验组-(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_对照组。实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本，可以采用重测序试验中所选择的对照组黄牛个体，Ct即Cycle threshold，为扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。2^-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的拷贝数相对于对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-ΔΔCt的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

具体地，针对所述VAMP7基因(GenBank Accession No.AC_000170.1)14678001bp-14686000bp区域，根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为三类：插入型，拷贝数大于2；缺失型，拷贝数小于2；正常型，拷贝数等于2。

5、黄牛VAMP7基因CNV位点与生长性状的关联分析

生长性状数据：云岭牛、夏南牛、皮南牛、郏县红牛的体高、体重、十字部高等。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 20软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_jk＝μ+CNV_j+e_jk，

其中：Y_jk为性状观察值，μ为总体均值，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_jk为随机误差。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以均值±标准误形式表示，参见表3。

表3.VAMP7基因CNV与黄牛生长性状的关联分析

注：a和b表示数据差异显著(P<0.05)

关联分析结果表明(见表3)：云岭牛VAMP7基因CNV位点可显著影响十字部高。并且，优势拷贝数变异类型为正常型，说明VAMP7基因该CNV位点可以作为一个提高云岭牛生长性状的候选分子遗传标记(CNV标记)位点。

6、CNV标记在黄牛选育中的应用

获得的候选分子遗传标记，可以用于寻找与其相关或紧密连锁的影响黄牛生长性状的数量性状基因座。还可以用于黄牛的分子标记辅助选择，通过快速建立云岭牛等黄牛品种的遗传资源优势种群，从而加快云岭牛等黄牛品种的选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法及专用试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctagcgtgt acttttggtg t 21

<210> 2

<211>22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

acttagctaa acagtggcta gg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (10)

1.一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增VAMP7基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛VAMP7基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-GCTAGCGTGTACTTTTGGTGT-3’

下游引物R1：5’-ACTTAGCTAAACAGTGGCTAGG-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

2.如权利要求1所述一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的VAMP7基因的拷贝数变异区域位于VAMP7基因参考基因组序列AC_000170.1的14678001bp-14686000bp。

3.如权利要求1所述一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔΔCt大于2；缺失型，2*2^-ΔΔCt小于2；正常型，2*2^-ΔΔCt等于2。

4.如权利要求1所述一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的扩增体系包括10ng/μL模板DNA1μL以及10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

5.如权利要求1所述一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性5～10min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共39个循环。

6.如权利要求1所述一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的方法，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为166bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

7.如权利要求1-6中任意一项权利要求所述的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述生长性状为十字部高。

10.一种检测黄牛VAMP7基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增VAMP7基因拷贝数变异区域的部分片段的引物对P1以及用于扩增作为内参的BTF3基因的部分片段的引物对P2；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-GCTAGCGTGTACTTTTGGTGT-3’

下游引物R1：5’-ACTTAGCTAAACAGTGGCTAGG-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

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