CN102094083A - 单细胞核酸扩增新技术对植入前胚胎的遗传学诊断 - Google Patents

Abstract

本申请的技术主要是，利用mRNA的信号放大作用检测某些染色体片段DNA的倍增或缺失。依据中心法则mRNA是以DNA为模板转录的，DNA模板拷贝数的异常可引起mRNA量的变化，而在转录的过程中，DNA模板的倍增或缺失，在mRNA水平会被放大，相对容易检测。主要技术方法是：人类胚胎的单细胞mRNA经逆转录、加上共用引物后PCR扩增，然后以扩增产物为模板，用96孔板的定量PCR检测单细胞或少量细胞8个基因的表达水平，并与正常的二倍体胚胎相比较，可用于判别，X染色体隐性遗传家族史的胚胎性别、21三体、18和13三体、性染色体的倍增和缺失，对某些常见的染色体异常进行遗传学诊断。

Description

单细胞核酸扩增新技术对植入前胚胎的遗传学诊断

所属技术领域

本新型技术可扩增人类胚胎单细胞中的核酸，通过PCR扩增，放大核酸信号，选择特定的表达基因，检测植入前胚胎特定基因的表达，实现植入前胚胎的遗传学诊断。 

背景技术

胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis，PGD)是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可有效地防止有遗传疾病患儿的出生。植入前遗传学诊断是随着人类辅助生殖技术，即“试管婴儿”技术发展而开展起来的一种新技术，它是产前诊断的延伸，遗传学诊断的又一更有希望的新技术[1，2]。单细胞遗传物质(DNA和RNA)的扩增技术近年来取得很多进展，由于如何人类胚胎检测人类胚胎DNA的完整性，通过PCR(聚合酶链反应)技术对单细胞的DNA进行线性扩增，然后通过CGH(comparative genomic hybridigation)DNA Microarray(微阵列)或定量PCR来检测染色体DNA的拷贝数，判断DNA是否有倍增和缺失，但直接检测染色体的DNA水平判断染色体是否正常有时比较困难，例如唐氏综合症(Down’s Syndrome)21三体病人的DNA与正常人相比，21号染色体的DNA含量也只是正常DNA的1.5倍，用DNA微阵列和定量PCR的方法来检测少量细胞DNA的水平会有一定的误差，由于病人与正常人DNA含量相差太小，对于判断染色体是否正常，有较大的风险。人类基因是定位于染色体上的固定区段DNA，根据遗传学的中心法则，这些基因的双链DNA会以一条链为模板，转录为mRNA，如果某个区段的染色体DNA有倍增和缺失，会反应到mRNA水平上，因此检测mRNA可以反应DNA模板的状况，一般来说DNA在转录的过程中其信号会放大十几至上百倍。本申请专利技术是通过检测人类受精卵发育3天的胚胎，取单细胞的胚胎，提取mRNA，通过线性扩增，检测胚胎的基因表达水平(mRNA)，反映其模板DNA有无倍增和缺失，从而判断易产生倍增或缺失的染色体是否正常，达到植入前胚胎遗传学诊断的目的。由于动物细胞容易获得，人类的受精卵很难得到，而且涉及伦理方面的问题。小鼠的生殖细胞、受精卵二细胞、四细胞、八细胞、囊胚、原肠胚，以及三个胚层的分化等细胞的基因表达数据容易获得，在这方面也有较多的文献。但小鼠和人类在受精卵以后的发育阶段，基因表达是否一致，能否用小鼠的基因表达类推在人类，则不太清楚，小鼠的资料仅作为参考， 主要用人类的文献、基因表达数据和资料。 

目前从常染色体异常的发病率来看，唐氏综合症(21三体)最常见[3]，发病率约为1/800，而且发病率随着孕妇年龄的增长而升高，据流行病学调查，25岁的孕妇唐氏综合症约为1/1300，35岁的孕妇约为1/400，40岁的孕妇约为1/100。其次为18三体(Edwards综合症)和13三体(Patau综合症)，发生率分别为1/5000和1/16000，这两种染色体异常虽然较为少见，但十分严重，大多数流产。性染色体异常方面：XXY(Klinefelter综合症)，男性，发生率约为1/750，Xx(Turner综合症)女性，一条X染色体完全或部分缺失，发生率约1/2500，XYY男性，发生率约为1/1000；XXX女性，发生率约1/1000，这类性染色体异常病，性激素异常，生长异常(过高或过矮)，大多数情况下导致下一代不育。伴性遗传疾病的方面，X染色体隐性遗传病(X)比较常见，如血友病、色盲和进行性肌营养不良；X连锁隐性遗传在患病系中常表现为女性携带，男性患病。男性的致病基因只能随着X染色体传给女儿，不能传给儿子，此类患者与健康女性结婚生完全健康的儿子；对女性携带者来说，生儿子有50％风险发病，生女儿有50％的可能为携带者，因此生女孩为较佳选择。 

检测染色体的倍增或缺失经典的方法是荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)，该方法将DNA探针用不同颜色荧光染料标记，与固定在玻璃片上的卵裂球细胞不同染色体杂交后，在荧光显微镜下被杂交的部分呈现不同颜色的荧光，从而对染色体异常进行筛查，每一种探针都比较昂贵。对采用FISH的方法来说，探针是由国外大医药垄断，而且他们用于FISH检测的探针是有专利保护的，国内在这方面没有自主的知识产权；每种荧光染料只能染一个靶点，受荧光染料的限制，每个卵裂球只能用2～5种探针，临床上用的通常是3种荧光染料检测三个靶点。因此在临床和科研上需要开发新的方法检测植入前胚胎的单细胞的方法，进行遗传学诊断，在此临床应用领域拥有自主知识产权的技术。 

参考文献： 

1.MunnéS，Magli C，Cohen J，et al.(1999).″Positive outcome after preimplantation diagnosis of aneuploidy in human embryos″.Hum.Reprod.14(9)：2191-9. 

2.Platteau P，Staessen C，Michiels A，Van Steirteghem A，Liebaers I，Devroey P(2005).″Preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in women older than 37 years″.Fertil.Steril.84(2)：319-24. 

3.Roizen NJ，Patterson D(2003).″Down′s syndrome″(Review).Lancet 361(9365)：1281-9. 

发明内容[

要解决的技术问题 

检测染色体的倍增或缺失经典的方法是荧光原位杂交(FISH)，FISH的关键是有效的荧光探针，目前荧光探针由世界上几个医药大公司垄断，这些有效的探针均有专利，解决这个问题有两种解决手段，一种是直接的方法，开发自身的有效FISH探针，直接检测染色体DNA，这件工作我们正在进行中，如果成功，我们会申报专利。 

另外一个方法就是用间接的方法，根据细胞的转录本来推断其模板DNA有无扩增或缺失，依据遗传学的中心法则，人类基因是定位于染色体上的一定区段上，这些基因(双链DNA)会以一条链(正链)为模板，转录为mRNA，如果某个区段的染色体DNA有倍增和缺失，会反应到mRNA水平上，因此检测mRNA可以反映DNA模板的状况，而且DNA在转录的过程中其信号会放大十多倍，使检测相对容易。单细胞mRNA的扩增方法已经有文献报道，申请者借用这种扩增方法，并加以改进，不像文献那样做高通量的测序，而用定量PCR检测特异性表达基因的相对含量，定量PCR的方法十分成熟。这样看来，选择哪些基因作为判别指标，就非常关键。 

特异性基因选择：受精卵发育3天的胚胎有哪些基因表达与性染色体或染色体异常相关，这方面的资料很少，申请者通过查阅最新的文献，并用EST(Expression Sequence Tag)来分析从受精卵开始的各个发育阶段的基因表达情况，选取含有STS(Sequence Tagged Sites)的序列，已知基因的序列用Unigene的组织表达工具检索在各发育阶段或各组织中的表达情况；若是假基因，则在的序列在美国生物技术信息中心(NCBI)的dbEST数据库中寻找其同源序列，采用的标准是：核酸长度≥100bp，同源性50％以上；采用的程序为NCBI的ESTBlast检索工具。通过搜索，然后将检出序列组装为重叠群(contig)，以此重叠群为被检序列，搜索该核酸序列在各发育阶段的表达情况和组织分布。 

本申请专利计划用8个基因的表达情况来判断常染色体21、18和13三体，以及性染色体倍增或缺失，这些基因是初步的，将来可能用更为合适的基因来代替，这种技术不仅可以检测胚胎的单细胞，也可以检测羊水细胞；不仅可以检测染色体数量的异常，而且可以特定染色体的大片段缺失、扩增或某些基因遗传病，进行遗传学诊断，并应用于临床，拥有自主的知识产权。 

解决其技术问题所采用的技术方案 

需要解决的技术问题有这几个方面：取受精卵发育3天胚胎的单细胞；单细胞mRNA的扩增；选择染色体异常的特异性基因和特异性基因表达水平的检测。人受精卵发育3天胚胎 取单细胞的方法现在非常成熟，多采用激光打孔或Tyrode酸化打孔后吸出单细胞的方法取材，方法在图1中展示，下面将其他的几个方面在技术方案中详细描述。 

一、mRNA扩增方法 

单细胞mRNA扩增的技术，申请者依据Kurimoto K.和Tang F.的RNA-array及RNA-Seq方法[1，2，3]改进，由于现在胚胎阶段特异性的标记基因不是很多(本申请专利采用8个)，不需要用高通量的技术对少数基因测序或做基因表达芯片，因为对于少量基因来说，高通量测序和费用较高。以将mRNA逆转录为cDNA，加上共用引物，以共用引物做第一轮PCR扩增(18-20个循环)，其扩增产物作为定量PCR的模板，采用基因特异性的定量PCR引物，用96孔板做定量PCR(30-35个循环)，以正常的男性和女性单胚胎细胞作为对照，将待测的单细胞胚胎的定量PCR结果与对照进行比较，判断待检测的染色体是否正常，达到植入前胚胎遗传学诊断的目的。 

二、用于检测的特异性基因 

1，X染色体隐性遗传病的性别鉴定：女性的两个X染色体，在发育的过程中有一条失活，是通过X染色体失活中心(X inactivation center，XIC)实现的，XIC中的关键基因XIST(Xinactive-specific transcript)是一个非编码蛋白(non-protein coding)的基因，其功能是诱导女性(XX)胚胎两条X染色体中的一条失活，在母体细胞、胚胎四细胞、八细胞和囊胚期高表达，而XIST基因在男性(XY)胚胎期是不表达的[4]，因此通过检测对性染色体隐性遗传病，XIST的启动子区序列的突变会引起家族性的X染色体失活异常(familial skewed X inactivation)，由于该基因的RNA有19K，选取有特征性的两段序列。 

2，常染色体倍增 

21三体：人类正常染色体为二倍体，唐氏综合症(Down’s syndrome)是21号染色体多出一条，称为21三体(ch21 trisomy)，这是一种最常见的染色体异常，DSCR1(Down syndrome critical region gene 1)和DYRK1A(dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1A)是21三体染色体异常时表达较高的两个基因，而在21号染色体正常时，该基因的表达不高，且该基因在八细胞和囊胚期表达，通过检测21号染色体上基因DSCR1和DYRK1A的表达水平，早期对可能是21三体的胚胎进行筛选[5，6]。 

Edward’s综合症：多了一条18号染色体，为18三体(Trisomys 18)，18三体虽然不太常见，但危害极大，胎儿通常流产或在出生时死亡，偶有成活者，也是严重畸形。有报道认为，金属肽酶ADAM12(ADAM metallopeptidase domain 12)和GATA6(GATA binding protein 6)表达量 的异常升高提示有18三体的可能[7，8]。从基因表达芯片和EST发育表达谱分析的结果来看，这两个基因也胚胎的早期阶段也是广泛表达。可以用这两个基因作为18三体的筛选指标。Patau’s综合症：多了一条13号染色体，为13三体(Trisomy 13)，胎儿通常流产或在出生时死亡，偶有成活的胎儿，也是严重畸形。有报道认为，金属肽酶ADAM12和FAM48A(family with sequence similarity 48，member A)表达量的异常升高与13三体相关[7，8]，从基因表达芯片和EST发育表达谱分析的结果来看，这两个基因也胚胎的早期阶段也是广泛表达。可以用这两个基因作为13三体的筛选指标。 

3，性染色体倍增或缺失： 

通常X和Y染色体的假显性区域(pseudoautosomal regions，PAR1 and PAR2)检测X和Y染色体有无扩增或缺失，即使X染色体的失活时，PAR区域也表现为显性表达。PAR1和PAR2区段在X和Y染色体有时也进行交换(Crossover)这里采用PAR1和PAR2各一个基因CD99(MIC2)前体和SYBL1(VAMP7)的mRNA来检测X和Y染色体的倍增或缺失[9]。由于这两个区域是显性表达的，根据遗传学法则，X和Y染色体的倍增或缺失会引起PAR1和PAR2基因表达的变化。CD99(MIC2)前体是位于PAR1区域的基因，与细胞表面粘附有关，在胚胎发育的早期阶段表达。SYBL1(synaptobrevin-like 1)编码一个跨膜蛋白，功能是涉及物质转运，在发育的各阶段均表达。 

Klinefelter综合症(47，XXY)：表现为男性，发生率约为1/500到1/1000，有些患儿的智力较正常低，不育。与正常的二倍体相比，CD99(MIC2)前体和SYBL1表达升高。 

Turner综合症(45，X或46，Xx)：表现为女性，发生率约为1/2500，雌激素水平低，CD99(MIC2)前体和SYBL1表达降低。 

Triple X(47，XXX)：表现为女性，发生率约为1/1000，表现为身材高，CD99(MIC2)前体和SYBL1表达升高。 

XYY(47，XYY)：表现为男性，发生率约为1/1000，表现为身材高，可能智力问题，CD99(MIC2)前体和SYBL1表达升高。 

采用的8个特异性基因中，XIST、DSCR1和DYRK1A直接来源于文献，其他的5个基因是通过EST表达谱分析、基因表达芯片和文献检索中选出的，EST表达谱分析的结果详见图2。 

三、定量PCR检测 

本申请专利设计用96孔板的定量PCR检测受精卵第三天的胚胎单细胞8个基因的表达 水平，并与正常的二倍体胚胎(46，XX和46，XY)相比较，可用于判别：胚胎性别、21三体、18和13三体、性染色体的倍增和缺失。定量PCR仪在临床和科研机构已普遍采用，SYBR Green荧光染料因价格便宜，使用方便得到广泛的应用。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。XIST取不同转录本的特异性序列，每种染色体的倍增采用两个基因共同判断DSCR1和DYRK1A表示21三体；ADAM12和GATA6表示18三体；ADAM12和FAM48A表示13三体，以CD99前体、SYBL1以及XIST表示性染色体的倍增或缺失，详见表1。定量PCR引物的设计用美国ABI公司的专用软件设计，内对照用能量代谢基因GAPDH和胚胎发育重要的转录因子OCT4(POU5f1)作为参照基因，因为这两个基因在胚胎发育早期均高水平稳定地表达。 

表1 用8个基因的表达水平对受孕第三天胚胎单细胞的遗传学判断 

XIST基因用两个转录本的特异序列，其他的情况用两个基因的表达共同判断一种染色体的倍增或缺失结果。 

参考文献： 

1.Tang F，Barbacioru C，Wang Y，et al.(2009)mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.Nat Methods.6(5)：377-82 

2.Kurimoto K.，abuta Y.，Ohinata Y.et al.(2007)Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.Nature Protocols.2，739-752 

3.Tang F，Barbacioru C，Nordman E，et al.(2010)RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell。Nat Protoc；5(3)：516-35 

4.Ganesan，Shridar；Silver Daniel P，et al.(2002)″BRCA1 supports XIST RNA concentration on the inactive X chromosome″.Cell.111(3)：393-405 

5.Fuentes JJ，GenescàL，Kingsbury TJ，et al.(2000).″DSCR1，overexpressed in Down syndrome，is an inhibitor of calcineurin-mediated signaling pathways.″Hum.Mol.Genet.9(11)：1681-90. 

6.Joseph R.Arron，Monte M.Winslow，Alberto Polleri，et al.(2006)NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21.Nature 441，595-600 

7.Wortelboer EJ，Linskens IH，Koster MP，et al.(2009)ADAM 12s as a first-trimester screening marker of trisomy.Prenat Diagn，29(9)：866-9. 

8.Altug-Teber O.Bonin M.Walter M.et al.(2007)Specific transcriptional changes in human fetuses with autosomal trisomies.Cytogenet Genome Res 119：171-184 

9 Mangs A.H.& Morris J.B.(2007)，The Human Pseudoautosomal Region(PAR)：Origin，Function and Future.Current Genomics，8，129-136 

有益效果 

[有益效果：是发明和现有技术相比所具有的优点及积极效果，它是由技术特征直接带来的、或者是由技术特征产生的必然的技术效果。] 

胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可有效地防止有遗传疾病患儿的出生。植入前遗传学诊断是随着人类辅助生殖技术，即“试管婴儿”技术发展而开展起来的一种新技术，它是产前诊断的延伸，遗传学诊断的又一更有希望的新技术，对有遗传性病史、高龄孕妇和高危妇女进行PGD可以有效地避免遗传病患儿的出生。 

附图说明

图1是吸取受精卵发育第三天胚胎单细胞的过程图；图示用Tyrode酸化打孔，去透明带，用嘴吸管吸取胚胎的单细胞。 

图2是基因在发育阶段表达谱的分析图；这些基因均在胚胎发育的早期Embryoid body(类胚体)，Blastocyst(囊胚)，Fetus(胎儿)表达。图示中椭圆形的黑圈表示表达序列标签(EST)在各发育阶段的表达情况，黑圈的颜色愈深，表示EST代表的基因表达愈强，来源于黑圈后面的数字，这个数字表示从总的克隆序列中含有某个基因的比率。 

图3是单细胞mRNA扩增和检测的流程图；从胚胎的单细胞裂解开始，经过逆转录，cDNA第一链合成、第二链合成、PCR扩增、以单细胞cDNA的PCR产物为模板，设计特异基因的引物，定量PCR，然后对这些结果进行数据分析。 

图4是检测样品在96孔板中的布局图；将待检样品放在96孔板的中间，两边分别是正常的女性和男性对照，96孔板的第一行为参考基因OCT4，最后一行是参考基因GAPDH，中间为8 个特异性基因。 

具体实施方式

用胚胎植入前单细胞mRNA的表达水平来反应DNA模板有无倍增或缺失，涉及两个相关技术，一是用稳定可靠的方法将单细胞mRNA扩增，二是选择植入前胚胎特异性的标记物(基因)，其mRNA的表达水平可以反映模板DNA的状况。申请者用改进的单细胞mRNA扩增技术来高效而准确地扩增胚胎植入前胚胎的mRNA，通过分析精子、卵子、受精卵、卵裂、二细胞、四细胞、八细胞和囊胚的基因表达谱，并通过查询相关文献，选用一些特异性基因的mRNA来体现DNA的倍增或缺失，具体在这个申请专利中，胚胎性别、21三体、18和13三体、性染色体的倍增和缺失。利用女生胚胎和男性胚胎XIST基因的表达产物显著的差异， 对植入前胚胎的遗传学诊断，对于X连锁隐性遗传病，可通过该技术鉴定性别，防止后代相应遗传病的发生。整个技术方法的流程请见附图3。 

具体的实施方式： 

1.Tyrode酸化打孔后吸出胚胎第三天的单细胞； 

2.用单细胞mRNA扩增的技术：申请者依据Kurimoto K.和Tang F.的RNA-array及RNA-Seq方法改进，由于现在胚胎阶段特异性的标记基因不是很多(8个特异性基因和2个对照基因)，采用96孔板的定量PCR检测。将mRNA逆转录为cDNA，加上共用引物UP1逆转录，以共用引物做第一轮PCR扩增(18-20个循环)，其扩增产物作为定量PCR的模板。 

3.特异性基因选择：特异性基因选择的方法详见发明内容，按表1中所示基因从核酸专业数据库中获得核酸序列，序列中含有表达标签序列(STS)，用ABI公司的引物设计软件设计引物。采用的各基因特异性的核酸序列请见说明书的后面部分。 

4.以SYBR为荧光染料，当然也可以用TaqMan探针的定量PCR，这里主要SYBR便宜、方便，精度也符合要求。用96孔板做定量PCR(30-35个循环)，以GAPDH和OCT4作为参考基因；以正常的男性和女性单胚胎作为对照，将待测的单细胞胚胎的定量PCR结果与对照进行比较，判断待检测的染色体是否正常，达到植入前胚胎遗传学诊断的目的。定量PCR中各基因布局请见附图4。 

5.检测范围的拓展 

该申请专利也可用于穿刺羊水的单细胞或少量细胞检测，由于羊水细胞基本上胎儿脱落的细胞，可以在怀孕早、中期检测羊水细胞，发现遗传性疾病。对异常胚胎进行治疗性流产，避免中期妊娠遗传诊断及终止妊娠所致的危险及痛苦。 

另外，核酸的序列请见附后的文件。 

Claims (4)

1.一种根据单细胞的mRNA的相对含量检测受精第3天胚胎的染色体DNA有无扩增或缺失的技术方法。

2.根据权利要求1所述的技术方法，其特征是：对人类的单细胞进行mRNA逆转录、加上共用引物后PCR扩增，然后以扩增产物为模板，用96孔板的定量PCR检测单细胞或少量细胞8个基因的表达水平，并与正常的二倍体胚胎(46，XX和46，XY)相比较，可用于判别：X染色体隐性遗传家族史的胚胎性别、21三体、18和13三体、性染色体的倍增和缺失，对某些常见的染色体异常进行遗传学(PGD)诊断。

3.根据权利要求1和2所述的技术方法，其特征是：通过对单细胞mRNA扩增后，用检测8个特异性基因的表达水平对染色体模板DNA的异常进行判断。要求这8个基因的名称和特征性核酸序列的进行保护，即：采用XIST的两个转录本基因表达水平判断胚胎性别；用DSCR1和DYRK1A的表达水平判断21三体；ADAM12和GATA6的表达水平判断18三体；ADAM12和FAM48A的表达水平判断13三体，以CD99前体、SYBL1以及XIST的表达水平判断性染色体的倍增或缺失。

4.根据权利要求1、2和3所述的技术方法和特异性基因，以早期发现遗传性疾病为目的，对其他类型单细胞(胎儿羊水细胞、孕妇上皮细胞、绒毛细胞)或其他少量细胞的mRNA扩增后进行检测，以其结果反映染色体DNA的扩增或缺失。

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