CN112980969A

CN112980969A - 一种山羊cmtm2基因cnv标记的检测方法与应用

Info

Publication number: CN112980969A
Application number: CN202110374309.7A
Authority: CN
Inventors: 蓝贤勇; 何礼邦; 康雨欣; 毕谊; 潘传英; 费攀锋; 赵海谕; 陈宏�; 宋晓越; 朱海鲸; 屈雷
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2041-04-07
Also published as: CN112980969B

Abstract

本发明公开了一种山羊CMTM2基因CNV标记的检测方法与应用：以山羊基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增山羊CMTM2基因CNV区域和内参基因MC1R的部分片段，根据2×2^‑ΔΔCt将定量结果分为插入型、缺失型和正常型，从而鉴定山羊CMTM2基因候选区域Chr18:35601201bp‑35603200bp的CNV类型。根据CMTM2基因的CNV类型与山羊生长性状的关联分析结果，本发明可在DNA水平上检测与山羊生长性状密切相关的CNV标记，从而通过山羊生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的山羊种群。

Description

一种山羊CMTM2基因CNV标记的检测方法与应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种检测山羊CMTM2基因CNV标记的方法及其应用。

背景技术

拷贝数变异(copy number variations，CNVs)是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象。CNVs是基因组上一种亚显微水平的结构变异，涉及的片段大小在50bp到多个Mb之间，包括拷贝数增加(copy number gain)和拷贝数减少(copy number loss)。有些拷贝数变异属于多态性范畴，并不对动植物的表型造成影响，而有些拷贝数变异则可以通过改变基因序列和基因含量来影响基因表达，从而造成表型差异和表型适应。

目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：(1)比较基因组杂交(CGH)：CGH可在全部染色体或染色体亚带水平上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测。但是该技术的分辨率在Mb水平，如果拷贝数片段太小则不易检出。同时该技术存在着操作繁琐、通量低、耗时长和成本昂贵等缺点。(2)多重连接探针扩增(MLPA)：MLPA是2002年发展起来的一种拷贝数检测方法。该技术具有较准确的相对定量功能，但是探针制备较为复杂，同时操作步骤繁琐、耗时长。(3)高分辨溶解曲线分析(HRM)：HRM是基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异。该技术具有快速、廉价、高通量等优点，但同时存在着设计难度大以及单个核苷酸的差异小易造成检测灵敏度较低等缺陷。(4)实时荧光定量PCR(qPCR)：在PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底几乎不发光，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。qPCR的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。(5)高通量测序技术：通过重测序来检测基因组结构变异，但成本较高。

分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection，MAS)借助DNA标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

CMTM2基因(CKLF like Marvel transmembrane domain containing 2)是趋化素样因子超家族中的一员，其蛋白的结构与功能是介于趋化因子与TM4SF家族成员之间，存在着跨膜与分泌两种形式，具有极强的疏水性。此外，还含有可以与雄激素受体(AndrogenReceptor，AR)相结合的模体结构，如LXXLL、FXXLY和FXXFF等。CMTM2基因广泛表达于睾丸、骨骼、外周血细胞、卵巢等正常组织或细胞中，相比于家族的其他成员，在睾丸中的表达量较高。通过体外实验可知，其能够通过影响雄激素受体的转录影响雄性动物生殖发育的过程。

已有研究报道山羊CMTM2基因存在潜在遗传位点可以显著影响生长性状，但尚未见有关CMTM2基因CNV对山羊生长性状影响的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊CMTM2基因CNV标记的检测方法与应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以山羊(例如，陕北白绒山羊个体)基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增CMTM2基因的拷贝数变异区域的部分片段和作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊个体CMTM2基因的拷贝数变异类型；

所述引物对P1为：

上游引物F1：5′-TCTGAAAGAGTTGGGAATACAAGA-3′

下游引物R1：5′-CATAGAAGTTAAATAAGCAGGGTGA-3′；

所述引物对P2为：

上游引物F2：5′-GGCCTGAGAGGGGAATCACA-3′

下游引物R2：5′-AGTGGGTCTCTGGATGGAGG-3′。

优选的，所述CMTM2基因的拷贝数变异区域位于山羊CMTM2基因(GenBank Oar_v4.0)候选区域Chr18:35601201bp-35603200bp。

优选的，所述拷贝数变异类型是根据2×2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2×2^-ΔΔCt≥3；缺失型，2×2^-ΔΔCt<2；正常型，2×2^-ΔΔCt＝2。

优选的，所述实时荧光定量PCR所用的扩增体系包括50ng/μL模板DNA 1μL以及10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

优选的，所述实时荧光定量PCR所用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火15s，35个循环。

上述检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法在山羊分子育种中的应用，所述方法检测得到的DNA标记(具体为CNV标记)可以应用在对山羊种群的优良生长性状的早期分子标记辅助选择中。

优选的，所述CMTM2基因的拷贝数变异区域的不同拷贝数类型与山羊的生长性状显著相关，例如在陕北白绒山羊中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体的生长性状体高、十字部高显著优于拷贝数变异类型为正常型的个体，而具有插入型拷贝数变异类型的个体的生长性状胸宽显著优于拷贝数变异类型为缺失型的个体。

本发明的有益效果体现在：

本发明以山羊CMTM2基因候选区域Chr18:35601201bp-35603200bp为CNV位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在山羊群体中的拷贝数变异情况，依据所述CNV位点的不同拷贝数变异类型与体高等重要经济性状进行关联分析的结果，本发明能够检测山羊CMTM2基因上存在的CNV标记，可以用于山羊生长性状的标记辅助选择，并快速建立遗传资源优良的山羊种群，从而加快山羊良种选育进程。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的山羊CMTM2基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于山羊的早期选育，甚至在个体刚出生时就可进行选择；

(2)检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；

(3)山羊CMTM2基因CNV位点的检出，为山羊生长性状的分子标记辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1为本发明实施例中进行qPCR绘制的扩增曲线。

图2为本发明实施例中进行qPCR绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明利用实时荧光定量PCR对山羊CMTM2基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选CNV位点，即山羊CMTM2基因(GenBank Oar_v4.0)序列的Chr18:35601201bp-35603200bp区域在山羊群体中的拷贝数变异情况；(2)将拷贝数变异类型与山羊生长性状进行关联分析，筛选到与山羊生长性状相关的CNV标记；(3)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的山羊品种选育。具体说明如下。

1、山羊样本采集

本发明具体以地方山羊品种陕北白绒山羊(n＝244)作为检测对象，从陕西榆林市横山县养殖基地采取山羊耳组织样本，采样时间为：2017年6月-2017年9月。

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)及参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D].西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3、目标序列及内参序列的扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的山羊CMTM2基因(GenBankOar_v4.0)序列为参考序列，利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR引物对检测CMTM2基因拷贝数变异，扩增的目标序列为167bp。内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即MC1R基因中的一段126bp的序列。各引物对序列信息如表1所示。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

qPCR所用的扩增体系以13μL计为：50ng/μL模板DNA(山羊基因组DNA)1μL、10pmol/L的上、下游引物各0.5μL、2×SYBR Green qPCR Mix 6.5μL，以及去离子水4.5μL。

qPCR扩增的反应程序为：(1)预变性：95℃10min；(2)扩增反应：95℃变性15s，60℃退火15s，35个循环；(3)绘制溶解曲线：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

参见图1、图2，通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰。

4、拷贝数变异类型的推断

每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2×2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目的基因}-C_{T内参基因})_实验组-(C_{T目的基因}-C_{T内参基因})_对照组。实验组即为待检测有无CNVs的样本。对照组即为已知无拷贝数变异的样本，可以采用重测序试验中所选择的山羊个体。C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

基因型判定：当目标序列属于正常型序列时，2×2^-ΔΔCt＝2；当目标序列属于缺失型序列时，2×2^-ΔΔCt<2；当目标序列属于插入型序列时，2×2^-ΔΔCt≥3。

5、山羊CMTM2基因CNV位点与生长性状的关联分析

基因型：缺失型、正常型、插入型。

生长性状数据：体长、体高、十字部高、胸围、胸宽、胸深等。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 24软件分析各基因型间的生产性状效应。

具体在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_i＝μ+CNV_i+e_i

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，CNV_j为第i个拷贝数变异类型的固定效应，e_i为随机误差。

各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示，参见表2。

表2.CMTM2基因CNV与陕北白绒山羊生长性状的关联分析

注：同一行数据均值肩上字母不同，表示具有统计学差异

关联分析结果表明(见表2)：在陕北白绒山羊群体中，所检测的CMTM2基因的拷贝数变异可显著影响体高、十字部高和胸宽，揭示了CMTM2基因CNV位点存在作为提高山羊生长性状的候选分子遗传标记(具体为CNV标记)，并且优势拷贝数变异类型为缺失型。例如，如果检测得到CMTM2基因候选位点的拷贝数变异类型为缺失型，则待测山羊个体表型(体高、十字部高)更优异；如果拷贝数变异类型为正常型，则待测个体表型较差。

6、上述CNV标记在山羊选育中的应用

根据获得的CNV标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响山羊生长性状的数量性状基因座。或者直接以CNV标记对山羊个体进行分子标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的山羊种群，从而加快山羊品种改良的选育进程。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种山羊CMTM2基因CNV标记的检测方法与应用

<160> 4

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> F1

<400> 1

tctgaaagag ttgggaatac aaga 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> R1

<400> 2

catagaagtt aaataagcag ggtga 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> F2

<400> 3

ggcctgagag gggaatcaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> R2

<400> 4

agtgggtctc tggatggagg 20

Claims

1.一种检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增CMTM2基因的拷贝数变异区域和作为内参的MC1R基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定山羊CMTM2基因的拷贝数变异类型；

所述引物对P1为：

上游引物F1：5′-TCTGAAAGAGTTGGGAATACAAGA-3′

下游引物R1：5′-CATAGAAGTTAAATAAGCAGGGTGA-3′；

所述引物对P2为：

上游引物F2：5′-GGCCTGAGAGGGGAATCACA-3′

下游引物R2：5′-AGTGGGTCTCTGGATGGAGG-3′。

2.权利要求1所述一种检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述CMTM2基因的拷贝数变异区域位于山羊CMTM2基因候选区域Chr18:35601201bp-35603200bp。

3.权利要求1所述一种检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述拷贝数变异类型是根据2×2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2×2^-ΔΔCt≥3；缺失型，2×2^-ΔΔCt<2；正常型，2×2^-ΔΔCt＝2。

4.权利要求1所述一种检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的扩增体系包括50ng/μL模板DNA 1μL以及10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。

5.权利要求1所述一种检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火15s，35个循环。

6.如权利要求1-5中任意一项权利要求所述的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于：所述CMTM2基因的拷贝数变异区域存在与山羊生长性状显著相关的DNA标记。

8.权利要求7所述的应用，其特征在于：所述生长性状选自体高、十字部高、胸宽中的一种或多种。

9.山羊CMTM2基因候选区域Chr18:35601201bp-35603200bp在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

10.一种检测山羊CMTM2基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于通过实时荧光定量PCR分别扩增山羊CMTM2基因的拷贝数变异区域和作为内参的MC1R基因的部分片段的引物对P1和引物对P2；

所述引物对P1为：

上游引物F1：5′-TCTGAAAGAGTTGGGAATACAAGA-3′

下游引物R1：5′-CATAGAAGTTAAATAAGCAGGGTGA-3′；

所述引物对P2为：

上游引物F2：5′-GGCCTGAGAGGGGAATCACA-3′

下游引物R2：5′-AGTGGGTCTCTGGATGGAGG-3′。