CN117051126B - 检测天祝白牦牛fgf5基因snp标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本本发明属于家畜分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测天祝白牦牛FGF5基因g.166858T>A SNP标记的方法及其应用。本发明首先提供了一种与牦牛毛长及产毛量相关的SNP标记，所述SNP标记位于牦牛FGF5基因第166858位碱基处，突变碱基为A或T。其次，本发明还公开了该分子标记的检测方法及其在牦牛毛长及产毛量性状关联分析中的应用，该分子标记可应用于牦牛毛长及产毛量性状辅助选择育种，检测FGF5基因SNP的方法准确可靠、操作简便；FGF5基因位点的检出，为天祝白牦牛的分子标记辅助选择提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于家畜分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测天祝白牦牛FGF5基因SNP标记的方法及其应用。
背景技术
天祝白牦牛是原产于我国甘肃省武威市天祝藏族自治县的地方牦牛品种，其由于具有白色的被毛而深受当地人们的喜爱，同时也作为一种景观动物为天祝当地增添一抹色彩。白色的被毛能够用于当地人们御寒保暖的佳品，尾毛的特殊质感更能够用于胡须、拂尘等产品的制作。因此选育毛性状优良的天祝白牦牛是亟待解决的问题，提高白牦牛产毛量，增加其毛长是天祝白牦牛育种的方向之一。目前，分子标记辅助选择育种是提高育种效率的重要手段，通过各种类型的分子标记的挖掘和探究，能够选育出优良性状的个体，显著缩短育种周期。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是家畜分子标记的一种，指的是基因组水平上的单碱基突变，其在哺乳动物中广泛存在，是影响家畜表型改变的重要因素之一。已经有多项研究表明，家畜SNP效应对表型的影响，例如，MOGAT1、MYO1、ASB-3等基因与中国黄牛生长性状呈显著相关性，绵羊FecB基因SNP显著影响其繁殖性状，发掘家畜基因组中关键SNP位点，找到影响家畜生产性能的关键基因是育种工作的内容之一，它能够有效的加快育种的速度，使人们能够更快的朝着预期的育种方向进行。
SNP的检测方法有许多种，最直接的检测方法是测序法，Sanger测序是DNA序列分析的经典方法，可直接获取核酸序列信息，是SNP检测的“金标准”。而且，Sanger测序可发现未知的SNP位点，确定SNP的突变类型和突变位置，是一种无法替代的最直接、最准确的SNP检测方法，Sanger测序是基于双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)末端终止的方法进行检测的。即在四个单独的反应体系中，分别对应掺入四种带有不同颜色标记的A、T、G、C双脱氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定点开始延伸反应，而延伸过程中若掺入ddNTP，则由于碱基上无3’-OH导致延伸无法继续，从而随机在某一特定碱基处终止，形成相差一个碱基的不同系列长度的核酸片段，再利用毛细管电泳分离这些不同长度的核酸片段，最后通过不同碱基标记的颜色读取待测核酸的碱基序列，由此获得目标区域的核苷酸序列。
成纤维生长因子(fibroblast growth factor 5，FGF5)基因最初在人肿瘤细胞中发现，被认为是一种原癌基因，继而由于其基因序列与FGF家族高度同源被划分为FGF家族的一员。该基因在哺乳动物中广泛表达，但仅在出生后的动物大脑和皮肤组织中有较高的表达。哺乳动物的毛发发育和毛囊的三个时期变化密不可分，不管是初级毛囊还是次级毛囊都遵循，生长期、退行期和休止期的变化，其中FGF5基因被认为是参与退行期发生的重要因子之一，研究表明FGF5的基因敲除导致了退行期的延迟，研究表明猫、狗等哺乳动物FGF5基因的突变能够影响其长短毛型的变化，FGF5基因突变型的个体往往是长毛型，而本发明所述天祝白牦牛中存在的SNP位点为首次发现。
目前，亟需一种新的能够大样本检测FGF5基因SNP在天祝白牦牛的存在情况，并探究其对天祝白牦牛产毛性状的影响；为检测牦牛FGF5基因SNP提供一种新的高效、方便、快捷的检测方法，并且能够快速分析该基因位点对牦牛产毛性状的影响。
发明内容
针对上述技术问题，本发明发现了一种与牦牛毛长及产毛量性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为牦牛FGF5基因g.166858T>A，该分子标记可应用于牦牛毛长及产毛量性状辅助选择育种，检测FGF5基因SNP的方法准确可靠、操作简便；为天祝白牦牛的分子标记辅助选择提供科学依据。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种与牦牛毛长及产毛量性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为牦牛FGF5基因g.166858T>A。
优选地，所所述牦牛FGF5基因的基因登陆号为：NW_005395982.1。
优选地，所述牦牛为天祝白牦牛。
优选地，所述毛长为额部毛长和背部毛长。
第二方面，本发明提供了检测上述第一方面所述SNP分子标记的试剂在检测牦牛毛长及产毛量性状，或在牦牛毛长及产毛量性状早期选育中的应用。
优选地，所述牦牛为天祝白牦牛。
优选地，所述毛长为额部毛长和背部毛长。
优选地，根据所述SNP分子标记，将不同个体基因型分为AA型、AT型和TT型；所述AT型和TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AA型；且所述TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AT型。
优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。
优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第51位。
第三方面，本发明提供了一种扩增含有上述第一方面所述SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛毛长及产毛量性状中的应用；所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2-3所示。
优选地，所述牦牛为天祝白牦牛。
优选地，所述毛长为额部毛长和背部毛长。
优选地，实现检测牦牛毛长及产毛量性状的方法包括：
(1)提取牦牛血液基因组DNA为模板，利用特异性引物对，通过PCR扩增获得PCR扩增产物；
(2)利用一代测序技术检测上述扩增产物的序列，根据测序峰图和参考基因组上g.166858T>A SNP的位置，将不同个体基因型分为AA型、AT型、和TT型；所述AT型和TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AA型，且所述TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AT型。
优选地，所述PCR所用的扩增体系包括：50ng/μL模板DNA1μL、0.5pM的引物对P1所对应的上、下游引物各0.5μL，15μL的2X Accurate Taq预混液(含染料)以及13μL的RNaseFree Water。
优选地，所述PCR所用的反应程序为：(1)预变性：90℃，30s；(2)扩增反应：95℃，5s，之后52℃30s，这一步经历45个循环；(3)结束反应：95℃，5s，之后65℃，60s。
第四方面，本发明提供了一种扩增含有上述第一方面所述SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于牦牛毛长及产毛量性状早期育种中的应用；所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2-3所示。
优选地，所述牦牛为天祝白牦牛。
优选地，所述毛长为牛额部毛长和背部毛长。
优选地，用于牦牛毛长及产毛量性状早期育种的方法包括：
(1)提取牦牛血液基因组DNA为模板，利用特异性引物对，通过PCR扩增获得PCR扩增产物；
(2)利用一代测序技术检测上述扩增产物的序列，根据测序峰图和参考基因组上g.166858T>A SNP的位置，将不同个体基因型分为AA型、AT型、和TT型；所述AT型和TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AA型，且所述TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AT型；选取AT型和TT型牦牛个体进行牦牛毛长及产毛量性状的早期育种。
优选地，所述PCR所用的扩增体系包括：50ng/μL模板DNA1μL、0.5pM的引物对P1所对应的上、下游引物各0.5μL，15μL的2X Accurate Taq预混液(含染料)以及13μL的RNaseFree Water。
优选地，所述PCR所用的反应程序为：(1)预变性：90℃，30s；(2)扩增反应：95℃，5s，之后52℃30s，这一步经历45个循环；(3)结束反应：95℃，5s，之后65℃，60s。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明提供的检测天祝白牦牛FGF5基因SNP标记的方法，以天祝白牦牛的血液全基因组DNA为模板，通过一代测序技术的峰图将天祝白牦牛群体分为三种基因型(AA、AT、TT)，从而鉴定牦牛FGF5基因SNP情况。与天祝白牦牛毛性状的关联分析表明，FGF5基因SNP的不同基因型与天祝白牦牛的毛性状具有显著影响。具有TT型的天祝白牦牛相较于AT型和AA型的毛性状较差。本发明在DNA水平上检测与天祝白牦牛生长性状密切相关的SNP标记，可作为天祝白牦牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记。
本发明以天祝白牦牛FGF5基因的SNP为候选位点，通过一代测序技术检测该位点在天祝白牦牛群体中的SNP情况，并与毛长、毛重性状等重要经济性状进行关联分析；如果检测FGF5基因候选位点的SNP类型为TT，则表明该牦牛成年后极有可能出现毛长较长的性状，其产毛量也很可能较高；研究该基因SNP并将其与天祝白牦牛相关生长性状关联分析至关重要，可以为我国牦牛遗传育种提供理论依据，便于天祝白牦牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的天祝白牦牛群体。
本发明提供的天祝白牦牛FGF5基因SNP检测方法，不受牦牛年龄限制，可用于早期选育，甚至在牛犊刚出生时就可以进行选择；检测FGF5基因SNP的方法准确可靠、操作便捷；FGF5基因SNP位点的检出，为牦牛的分子标记辅助选择提供科学的理论依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的检测天祝白牦牛FGF5基因SNP标记的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的天祝白牦牛FGF5基因SNP标记的测序峰图，用于对不同个体牦牛SNP进行基因分型，图中红框表示双峰为AT基因型；
图3是本发明实施例提供的天祝白牦牛FGF5基因SNP标记的测序峰图，该图显示的是具有AA型个体的测序峰图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测天祝白牦牛FGF5基因SNP标记的方法及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明利用一代测序技术对天祝白牦牛FGF5基因的SNP进行检测，下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明所涉及的一种基于一代测序技术检测的SNP标记，是指牦牛FGF5基因SNP(NW_005395982.1g.166858T>A)，位于FGF5基因第二外显子前2bp，是哺乳动物保守区段的可变剪切位点，是基于天祝白牦牛重测序检测所得，根据测序峰图将结果分为三类单峰AA型和TT型，双峰AT型。
如图1所示，本发明实施例提供的检测天祝白牦牛FGF5基因SNP标记的方法包括以下步骤：
S101，以天祝白牦牛的血液中提取的基因组DNA为模板，以引物P1为模板，通过PCR扩增FGF5基因的g.166858T>A SNP前后约100bp的区域；
S102，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增后片段的质量和大小是否符合预期；
S103，利用一代测序技术检测上述片段的序列，根据测序峰图和参考基因组上g.166858T>A SNP的位置，将不同个体基因型分为AA型、AT型、和TT型。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
1.天祝白牦牛生长性状测量和血样采集
本发明以天祝白牦牛品种作为检测对象，从甘肃省天祝藏族自治县采集了318头牦牛的血液样品、并且测量了这些牦牛的额部毛长、背部毛长、裙毛长、体侧毛长并且对剪毛量进行了称重。
2.基因组DNA的分离、提取、纯化
参考文献Sambrock et al(2002)方法对基因组DNA进行分离、提取、纯化。
3.目标基因以及参考基因扩增
以NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牦牛FGF5基因(登录号为NW_005395982.1)序列为参考序列，利用Primer 5.0设计能够扩增SNP位点附近100bp左右的引物对(引物对P1)对检测FGF5基因SNP。引物对序列信息如表1所示。
表1 PCR扩增的引物信息
注：F表示上游引物，R表示下游引物
利用PCR仪器扩增目的片段，PCR所用的扩增体系包括：50ng/μL模板DNA1μL、0.5pM的引物对P1所对应的上、下游引物各0.5μL，15μL的2×Accurate Taq预混液(含染料)(湖南艾科瑞生物工程有限公司)以及13μL的RNase Free Water。
PCR扩增的反应程序为：
(1)预变性：90℃，30s；
(2)扩增反应：95℃，5s，之后52℃，30s，这一步经历45个循环；
(3)结束反应：95℃，5s，之后65℃，60s。
4.目的片段的验证。
将PCR扩增后的DNA样品进行电泳验证，电泳的条件为：1％琼脂糖凝胶，电泳仪电压100V，电泳时间20min，上样量5μL。
电泳后利用照胶仪进行检测，条带大小需在278bp左右，单一条带，无杂带即可进行下一步测序。
5.目的片段测序及SNP分型。
将目的片段送往西安擎科公司进行一代测序。
测序结果得到后利用Geneious Prime软件对结果进行分析，测序峰图中首先找到SNP位点所处位置，再将双峰类型的个体找出，即为AT基因型个体(如图2所示)；测序A单峰为AA基因型个体，测序T单峰为TT基因型个体(如图3所示)。
将分型结果与表型信息整理到一张表格中，以便于关联分析。
6.天祝白牦牛FGF5基因SNP位点与生长性状的关联分析
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析数据校正；根据数据特征，应用SPSS19软件分析个基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：Yijk＝μ+SNPj+eijk；
其中，Yijk为性状观察值，μ为总体均值，SNPj为第j个SNP类型的固定效应，eijk为随机误差，各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以均值±方差形式表示。
关联分析结果如表2所示：在天祝白牦牛中，FGF5基因SNP能够影响牦牛的毛性状，其中具有TT基因型的牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量均极显著高于AT型，并且AT型极显著高于AA型，也就是说，具有T突变数量越多的牦牛个体，毛越长，产毛量越多。
表2天祝白牦牛FGF5基因SNP位点与生长性状的关联分析
注：*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。
7.上述SNP标记在天祝白牦牛选育中的应用
TT基因型的天祝白牦牛往往具有较长的毛长和具有较多的剪毛量，可以作为分子标记辅助选择的备选位点之一寻找与其相关或紧密连锁的影响牦牛生长性状的数量性状基因座，以对天祝白牦牛进行分子标记辅助选择，从而加快天祝白牦牛品种改良育种进程。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.扩增含有与牦牛毛长及产毛量性状相关的SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛毛长及产毛量性状，或用于牦牛毛长及产毛量性状早期育种中的应用；所述SNP分子标记为牦牛FGF5基因g.166858T>A；所述牦牛FGF5基因的基因登陆号为：NW_005395982.1；所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2-3所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，实现检测牦牛毛长及产毛量性状的方法包括：
(1)提取牦牛血液基因组DNA为模板，利用特异性引物对，通过PCR扩增获得PCR扩增产物；
(2)利用一代测序技术检测上述扩增产物的序列，根据测序峰图和参考基因组上g.166858T>A SNP的位置，将不同个体基因型分为AA型、AT型、和TT型；所述AT型和TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AA型，且所述TT型牦牛额部毛长、背部毛长、产毛量显著高于AT型。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR所用的扩增体系包括：50ng/μL模板DNA 1μL、0.5pM的引物对P1所对应的上、下游引物各0.5μL，15μL的2×Accurate Taq预混液(含染料)以及13μL的RNase Free Water。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR所用的反应程序为：(1)预变性：90℃，30s；(2)扩增反应：95℃，5s，之后52℃30s，这一步经历45个循环；(3)结束反应：95℃，5s，之后65℃，60s。
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