CN113265476B - 分析绵羊产奶性能的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种分析绵羊产奶性能的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用，涉及生物技术领域，本发明提供能够分析绵羊产奶性能特征的2030个SNP位点组合，其物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定，利用2030个SNP位点组合以及基于该位点组合形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒能够对绵羊个体进行遗传评估，对早期难以度量的产奶性能性状进行个体选择，控制育种进程，节约育种成本。

Description

分析绵羊产奶性能的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物检测技术领域，更具体的涉及绵羊产奶性能SNP位点组合及其应用。

背景技术

多胎绵羊通常不能分泌足够的奶满足羔羊生长发育的需求，导致羔羊的存活率降低，尽管使用代乳料可以在一定程度上缓解母羊产奶不足的困境，但实际上解决的根本途径仍是提高母羊的产奶量。此外，绵羊奶与山羊奶、牛奶相比，总脂肪、乳蛋白、乳糖含量更高，且羊奶的营养成分臂架接近人奶，是生产婴儿代乳粉的理想奶源，也是人类重要的膳食来源之一，然而我国存栏量在1.58亿只左右绵羊中，奶绵羊的存栏量几乎为零，因此发展肉乳兼用型绵羊，是我们养羊行业发展的方向，对于肉乳兼用型绵羊品种的选育也愈来愈迫切。

传统的品种选择方法值基于对动物或其亲缘动物的表型直接测定，因此完成育种策略需要保持广泛的表型记录，然而一些表型只能在绵羊发育到一定程度才能够显现，而且还不易观察到，养殖周期长，养殖投入成本高。随着科技的发展，已经有越来越多的科研工作者利用基因分析研究绵羊的性能，而分子标记技术由于其准确度高、可操作性强等优点越来越受到重视，尤其是基于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)的分子标记技术应用得越来越广泛。

SNP作为生物基因组中的一种遗传分子标记，在动植物遗传进化分析、重要经济形状筛选、分子育种等方面起着越来越重要的作用。基于SNP的SNP芯片是进行现代遗传育种便捷高效的工具，由于其容易实现SNP高通量、自动化检测，可以检测出基因组DNA上每个碱基对的变化，包括插入、缺失、颠倒、转换等，已经成为非常理想的SNP检测技术，在绵羊育种领域中的运用也越来越多。

绵羊现有的商业化SNP芯片有Illumina Ovine SNP50 Beadchip(50K)、IlluminaSheep HD Genotyping Beadchip(680K)和Illumina Ovine LD(5K)，前两者是在学术生产研究中最为常用的。其中Illumina Ovine SNP50 Beadchip是Illumina公司与UCSC、CSIRO、USDA及Agresearch等研究团队和机构共同研制，包括覆盖绵羊全基因组的超过54K个SNP位点，可用于遗传育种、全基因组关联分析、数量性状基因座定位、基因优选及比较基因组学等研究。而Illumina Sheep HD Genotyping Beadchip(680K)同为Illumina公司生产的SNP芯片，是由国际绵羊基因组协会(ISGC)在Ovine SNP50的基础上进行扩增的高密度芯片。但是现有的绵羊SNP芯片主要依据西方品种绵羊的数据，缺乏中国绵羊品种与国外绵羊品种结合的SNP数据，存在位点均匀性不足、对功能性位点和区域的体现不足、超过10％的位点在中国绵羊群体为极低频位点等诸多问题，设计一款适用于中国绵羊群体且能对产奶性能进行快速有效检测SNP芯片，有着十分重要的意义。

发明内容

为满足我国当前绵羊品种研究以及农业生产和市场上对绵羊产奶性能上的检测需求，本发明基于产奶性能的SNP位点集合提供分析羊产奶性能的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用，利用本发明提供的位点信息，能够快速准确的实现绵羊产奶性能评价、品种筛选、品种鉴定、品种溯源、绵羊育种，有利于种质资源保护以及种质资源改良，耗时短、成本低、市场效益广阔。

为实现本发明的技术目的，本发明通过以下方式实现：

a、分析绵羊产奶性能的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的2030个SNP位点组合：

表1 2030个SNP位点位置信息

所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。

2、分析绵羊产奶性能的方法，将待测绵羊的基因组DNA的2030个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述2030个SNP位点基因型进行比较；所述2030个SNP位点为表1所示的2030个SNP位点。

3、分析绵羊产奶性能的分子探针组合，其检测待测样品中表1所述的SNP位点组合。

4、分析绵羊产奶性能的基因芯片，其负载有上述3的分子探针组合。

5、分析绵羊产奶性能的试剂盒，其具有上述3的分子探针组合或上述4的基因芯片。

6、分析绵羊产奶性能的方法，应用上述3的分子探针组合或上述4的基因芯片或上述5的试剂盒对待测样品进行检测。

7、上述3的分子探针组合或上述4的基因芯片或上述5的试剂盒具有如下任一所述的用途：(1)在绵羊产奶性能评价中的应用；(2)在绵羊品种筛选的应用；(3)在绵羊品种鉴定中的应用；(4)在绵羊品种溯源中的应用；(5)在绵羊育种中的应用；(6)在种质资源保护中的应用；(7)在种质资源改良中的应用；(8)在绵羊系谱重构中的应用。

有益效果:

1、本发明基于对国内外绵羊的遗传资源研究，提供一种仅由2030个SNP位点组成的能够体现绵羊产奶性能的SNP位点组合，上述SNP位点组合能快速从基因水平上对绵羊个体的产奶性能进行评价，以获得更准确的育种评估信息，对早期难以度量的产奶性能性状进行选择，缩短世代间隔，加速育种进程，节约大量的育种成本；此外，利用本发明提供的产奶性能SNP位点组合，还能够从产奶性能的角度实现绵羊品种的鉴定和溯源，为我国绵羊的种质资源保护和种质资源的改良提供技术支持。

2、本发明基于上述SNP位点组合，提供的绵羊产奶性能SNP位点形成的探针组合、基因芯片、试剂盒与现有的高密度芯片相比，通量小、成本低，分析更容易，普适性广，市场前景广阔。

附图说明

图1是东弗里生羊Vs芬兰羊(EFR versus FIN)组的曼哈顿图；

图2为东弗里生羊Vs萨福克羊(EFR versus SFK)组的曼哈顿图；

图3为东弗里生羊Vs杜泊绵羊(EFR versus DPS)组的曼哈顿图；

图4是本申请对群体阈值分析的判定结果进行了显著性检验的结果图。

具体实施方式

下面参考具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《生物信息学与功能基因组学》原著第三版或者相关书籍进行，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用材料来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

此外，还需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。

需要说明的是，本发明所称的生物产品包括但不限于基于本发明提供的位点组合制成的引物、探针、基因芯片、试剂盒等。

在本文前述的位点组合部分中所描述的特征和优点，同样适用于基于位点组合制成的引物、分子探针组合、基因芯片、试剂盒以及其应用，在此不再赘述。

需要说明的是，本发明所称的绵羊产奶性能是从产奶量、乳脂率、乳蛋白率、泌乳期四个角度体现其产奶性能，根据实际生产需要，本领域技术人员可自行设置产奶阈值，从而判断产奶性能的优劣。

本发明的所称的SNP是指单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，所述单个核苷酸的变异包括由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失所导致的变异。

需要说明的是，本发明所称的分子标记为一切可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，包括但不限于基于分子杂交的分子标记，如RFLP、MinisatelliteDNA；基于PCR技术的分子标记，如RAPD、STS、SSR和SCAR；基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记；基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP；基于EST数据库发展的分析标记技术等。本发明提供的分子标记可以用于基因组作图、和基因定位研究、基于图谱的基因克隆、物种亲缘关系和系统分类等。

需要说明的是，本发明所称的探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)，例如Taqman-MGB探针。

需要说明的是，本发明所称的试剂盒为本领域常规使用的任意一种包含检测或实验所用试剂，便于操作人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程的盒子。在本发明的一个实施例中，其中包含有扩增本发明提供的位点信息的引物、检测本发明提供的位点信息的分子标记或探针或基因芯片，还包括扩增所用的酶和缓冲液，或者还检测用的荧光标记。

实施例1产奶性能性状SNP位点组合的获得

1、绵羊个体的选择

为了实现国内外绵羊品种的更加全面的覆盖，申请人对遍布于亚洲、欧洲、非洲和中东的248个绵羊个体进行遗传信息采集，其中包括16个野羊亚洲摩弗伦品种、172个地方品种和60个培育品种，具体涉及到中国山东的小尾寒羊、泗水裘皮羊、大尾寒羊、洼地绵羊，中国江苏的湖羊，中国宁夏的滩羊，中国新疆的阿勒泰羊、巴什拜羊、杜泊绵羊、中国美利奴羊(细毛羊)、中国美利奴羊(超细毛羊)、萨福克羊、策勒黑羊、多浪羊、Waggir Sheep羊，芬兰的芬兰羊(Finnsheep)、荷兰的威桑岛羊(Ouessant)、设德兰羊(Shetland)、索洛格诺羊(Solognote)、哥特兰岛羊(Gotland)、德伦特希思羊(Drente Heathen)，埃塞俄比亚的邦加羊(Bonga Sheep)、阿法尔羊(Afar Sheep)，尼日尔的姆博罗罗羊(Mbororo Sheep)，尼日利亚的扬卡羊(Yankasa Sheep)，非洲乍得的西非矮羊(West African Dwarf Sheep)、乌达羊(Uda Sheep)，非洲布基纳法索的贾隆凯羊(DjallonkéSheep)、摩西羊(Mossi Sheep)、萨赫勒羊(Sahelian Sheep)，西非喀麦隆的喀麦隆羊(Cameroon Sheep)，伊拉克的阿华西绵羊(Awassi Sheep)、哈姆达尼羊(Hamdani Sheep)，阿塞拜疆的马泽克羊(Mazekh Sheep)，伊朗的灰设拉子羊(Grey-Shiraz Sheep)、盖泽尔羊(Ghezel Sheep)、阿夫沙里羊(AfshariSheep)、沙尔羊(Shal Sheep)、马奎羊(Makui Sheep)、莫哈尼羊(Moghani Sheep)，巴基斯坦的卡拉库尔羊(Karakul Sheep)，伊朗舍赫尔科德的亚洲摩弗伦(Asiatic mouflon)。

2、绵羊全基因的总SNP集合的获得

采用本领域常规方法采集步骤1中绵羊个体中载有遗传信息的样本，该样本包括但不限于血液、细胞、组织、皮肤、毛发、排泄物等。提取样本中的遗传信息(例如DNA)进行高深度测序，利用SAMtools和GATK两种方式与2015年发布的绵羊4.0参考基因组(从NCBI获得)进行对比，并将两种方式获得共同结果形成一个SNP集合，共计2836万个SNP位点，作为绵羊全基因的总SNP集合。

需要说明的是，本发明所称的遗传信息(genetic information)是指生物为复制与自己相同的东西、由亲代传递给子代、或各细胞每次分裂时由细胞传递给细胞的信息。

需要说明的是，提取样本中的遗传信息(例如DNA)进行高深度测序可以由生物公司完成，例如华大基因公司，illumina公司等，高深度测序方法采用本领域常规方法或生物公司的方法，在本发明的一个实施例中，采用平均测序深度为～25.7×，应用重测序分析流程进行高深度测序。

3、候选基因及所在功能区域的筛选

3.1对不同产奶性能的绵羊遗传信息样本处理

筛选不同产奶性能的绵羊品种，并根据不同绵羊品种在产奶性能性状上表现出来的显著差异，对相应的遗传信息样本进行分组，在本发明的一个实施例中，将东弗里生羊Vs芬兰羊(EFR versus FIN)的遗传信息分为一组、东弗里生羊Vs萨福克羊(EFR versus SFK)的遗传信息分为一组、东弗里生羊Vs杜泊绵羊(EFR versus DPS)的遗传信息分为一组。

3.2对分组后不同产奶性能的绵羊遗传信息的处理

应用XP-CLR扫荡每个绵羊组之间的多基因座等位基因频率差异，扫描出与产奶性能相关的功能区域(扫描得到的曼哈顿图如图1-3所示，同时利用πratio(即π值)挖掘每组中的绵羊品种中与产奶性能相关的功能区域，然后取两种结果的交集，筛选出产奶性能相关的功能区域。

参照已公开的基因研究成果对区域内的基因进行筛选，最终确定8个与产奶性能相关的、功能十分确定的候选基因ALDH9A1、ARL4A、ATF6、NSMAF、PPP1R12A、SLC16A10、SLC40A1、SND1，进而通过perl脚本确定上述候选基因对应的功能区域。

4、产奶性能SNP位点组合的获得

利用bedtools在总的SNP集合中寻找步骤3中确定的候选基因所在功能区域对应的SNP位点，得到与ALDH9A1、ARL4A、ATF6、NSMAF、PPP1R12A、SLC16A10、SLC40A1、SND1共8个产奶性能相关的功能基因相关联，且仅包含2030个snp位点的产奶性能位点组合。

实施例2分析绵羊产奶性能的引物组合及探针组合

本领域技术人员根据本发明提供的产奶性能SNP位点组合中的每一个位点的序列信息设计引物，并将设计得到的引物利进行二级结构评估和Tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下实现检测目的的引物。

其中，二级结构评估及Tm值评估可以采用本领域常用的任一一种方式进行，例如采用DNA folding form评估其二级结构，具体参见(http://unafold.ma.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)，然后采用软件RaW-Probe评估其Tm值。

上述方法均为常规方法，根据本申请提供的产奶性能SNP位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本申请提供的产奶性能SNP位点组合获得引物也属于本发明的保护范围。

同样的，利用本发明提供的产奶性能SNP位点组合制备探针，例如tanqman探针也属于本发明的保护范围。

实施例3分析绵羊产奶性能的基因芯片

本申请的SNP基因芯片是采用常规方法将实施例2获得的引物或探针固定在聚合物基片上，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成实施例2获得的引物或探针，本申请的SNP基因芯片的使用方法与常规方法相同。

需要说明的是，本领域技术人员可以采用任一一种方式制备检测绵羊产奶性能的SNP基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，但是基于本申请提供的产奶性能SNP位点组合制备的SNP基因芯片均属于本发明的保护范围。

实施例4绵羊产奶性能的分析试剂盒

本申请的提供的产奶性能SNP检测试剂盒包括基于实施例1获得的SNP位点组合获得的引物或探针或基因芯片。根据使用类型的不同，还包括相应的检测试剂，例如当基于实施例1获得的SNP位点组合获得的为Taqman探针时，还包括荧光定量PCR反应常规使用的缓冲液、连接酶、AceQUniversal U+Probe Master Mix V2，TaqMan Probe等。

本领域技术人员根据使用方式的不同配置不同的绵羊产奶性能检测的SNP试剂盒，但是基于本申请提供的产奶性能SNP位点组合配置的绵羊产奶性能SNP检测试剂盒均属于本发明的保护范围。

实施例5绵羊产奶性能的分析

基于本申请的实施例1提供的绵羊产奶性能SNP位点组合对中国内蒙古某牧场养殖的18只母羊羔进行产奶性能分析，具体为：

采用本领域常规方法采集18只羊羔的外周血，该外周血是从羊羔体内取出的离体生物样品，并采用常规的DNA提取试剂盒提取样本中的全基因组DNA，获得全基因组DNA样本，利用Thermo Scientific NanoDrop 2000紫外分光光度计测量DNA样本浓度，并稀释至20ng/μl，备用；

采用常规方法利用本发明提供的SNP位点组合中的位点信息设计引物，对18只母羊羔的全基因组DNA进行检测，获得每只母羊羔中每个位点的分型结果(即每个位点是否为纯合子、杂合子、突变型纯合子或碱基缺失的结果)，计算每个位点的分型结果的频率值，并与群体阈值进行比较，比较结果显示，72.2％的母羊羔具有较佳的产奶性能，即样本号M01、M03、M04、M05、M06、M09、M10、M11、M12、M13、M15、M16、M18，其他产奶性能较弱。

采用常规方法对18只羊羔进行养殖，当母羊分娩后，观测18只母绵羊的产奶量、乳脂率、乳蛋白率、泌乳期，观测结果显示，样本号M01、M03、M04、M05、M06、M09、M10、M11、M12、M13、M15、M16、M18绵羊的泌乳期产奶可达200kg以上，最高可达800kg，乳脂率达5.8％以上，最高可达7.5％，乳蛋白率达58％以上，泌乳期在82-300天。而其他样本号的母绵羊产奶量最高仅为164kg，这与基因分析结果一致。

需要说明的是，本申请的所述群体阈值是通过对产奶性能较佳的群体和产奶性能弱的群体进行分析获得，方法同上。

本申请对产奶性能较佳的群体和产奶性能弱的群体进行分析的判定结果进行了显著性检验(独立样本曼惠特尼U检验)，结果如图4所示，根据图中结果可以看出，P<0.01，差异极显著，可见采用本发明方法进行判定的结果具有准确性和有效性。

工业应用

本领域技术人员基于本申请提供的仅由2030个SNP位点组成的绵羊产奶性能SNP位点组合可以制成的绵羊产奶性能SNP分子标记、检测绵羊产奶性能的SNP探针组合及SNP芯片，在基因组水平上对绵羊个体的产奶性能进行评价，或遗传评估或品种筛选或品种鉴定，以获得更高的育种值估计准确性。对早期难以度量的产奶性状进行选择，缩短世代间隔，加速育种进程，从而节约大量的育种成本，还能够应用于绵羊品种溯源、绵羊种质资源保护和绵羊种质资源改良中。

以上所述仅为帮助理解本发明的优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。

Claims (7)

1.2030个SNP位点组合在分析绵羊产奶性能中的应用，所述2030个SNP位点组合如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。

2.分析绵羊产奶性能的方法，将待测绵羊的基因组DNA的2030个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述2030个SNP位点基因型进行比较；

其中，所述2030个SNP位点为表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。

3.分析绵羊产奶性能的分子探针组合，其检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。

4.分析绵羊产奶性能的基因芯片，所述基因芯片负载有权利要求3所述的分子探针组合。

5.分析绵羊产奶性能的试剂盒，其具有权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片。

6.分析绵羊产奶性能的方法，应用权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行检测。

7.权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒的用途，所述用途为如下任一所述：

(1)在绵羊产奶性能评价中的应用；

(2)在产奶绵羊品种筛选的应用；

(3)在产奶绵羊品种鉴定中的应用；

(4)在产奶绵羊品种溯源中的应用；

(5)在产奶绵羊育种中的应用；

(6)在产奶绵羊种质资源保护中的应用；

(7)在产奶绵羊种质资源改良中的应用；

(8)在产奶绵羊系谱重构中的应用。

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