CN104087677B - Bmpr-1b或prlr基因snp位点预测小尾寒羊泌乳量的方法 - Google Patents

Bmpr-1b或prlr基因snp位点预测小尾寒羊泌乳量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及畜牧领域，公开了BMPR-1B或PRLR基因SNP位点预测小尾寒羊泌乳量的方法。本发明所述方法包括：抽提小尾寒羊基因组DNA；扩增含SNP位点BMPR-IB？A746G的序列或含SNP位点PRLR基因E2-C34T的序列；判定BMPR-IB？A746G或PRLR基因E2-C34T突变基因型。应用本发明可根据泌乳控制基因型的不同进行饲养管理，提高泌乳量，保证羔羊有足够的乳汁摄入，提高成活率，减少养殖经济损失。本发明为预测和分子选育小尾寒羊泌乳量提供了分子水平的技术支撑，应用本发明将大幅度提高羔羊成活率和发育速度，产生更好的养殖经济效益，具有良好的应用前景。

Description

BMPR-1B或PRLR基因SNP位点预测小尾寒羊泌乳量的方法
技术领域
本发明涉及畜牧领域，具体涉及BMPR-1B或PRLR基因SNP位点预测小尾寒羊泌乳量的方法。
背景技术
小尾寒羊是肉裘兼用型绵羊品种，长发育快、早熟、繁殖力强、性能遗传稳定、适应性强，早熟、多胎、多羔：生长快、体格大肉多、肉质好：小尾寒羊4月龄即可育肥出栏，年出栏率400％以上；体重6月龄可达50千克，周岁时可达100千克，成年羊可达130～190千克。周岁育肥羊屠宰率55.6％，净肉率45.89％。
小尾寒羊繁殖力极强，两年三产，不少是一年两产。据统计小尾寒羊平均产羔率为281.9％，最多一胎可产9羔。由于产羔较多，存在因母乳不够或者质量较差，造成羔羊死亡，成活率很低的问题，造成较大损失；同时，母羊的泌乳存在个体差异，同样饲养条件下，同一群体中，同样的产羔数，有的母羊泌乳量很多，羔羊全部成活，有的母羊泌乳量较少，造成羔羊因饥饿，营养不良、抗病力下降，进而造成死亡或者发育缓慢，达不到断奶体重，造成羔羊断奶后营养缺乏死亡，造成较大的经济损失，在饲养管理水平较低的羊场损失更加严重。
在断奶前三个月，由于产羔较多，母羊的泌乳量成为羔羊成活的最为重要的因素之一。关于家畜的泌乳量的测定及预测，传统的方法是通过母畜产仔后，通过1-2个泌乳期泌乳量测定和后裔测定来实现的，如奶牛和奶山羊的泌乳测定，通过一个泌乳期每天的泌乳量测定来确定其泌乳能力，以及通过女儿的泌乳量的测定来预测父本的泌乳能力大小。但传统的方法测定泌乳量，费时费力，只能对过去的选育进行评价，不能很好地预测未来或者刚出生的家畜。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种BMPR-1B或PRLR基因SNP位点预测小尾寒羊泌乳量的方法，包括以下步骤：抽提小尾寒羊基因组DNA；扩增含SNP位点BMPR-IBA746G的序列或含SNP位点PRLR基因E2-C34T的序列；判定BMPR-IBA746G或PRLR基因E2-C34T突变基因型。
BMPR-IB基因(bonemorphogeneticproteinreceptor1BBMPR-1B)骨形态蛋白受体1B基因是属于BMP家族的Ⅰ型受体,存在于许多细胞类型中,主要调节细胞生长和分化。BMPR-1B蛋白首先合成无生物活性的前体蛋白，蛋白水解后形成活性二聚体。活性二聚体再与受体复合物结合导致I型受体磷酸化，I型受体再作用于受体细胞内的Smad1和Smad5并使其磷酸化。Smad1和Smad5被激活后再结合Smad4，该复合物进入细胞核后与PDRII-BF1结合形成一个有活性的转录调节复合体，其与特异的启动基元结合，再作用于下游的因子，从而影响特定基因的转录，进而达到参与细胞生理活动的目的。
催乳素受体(prolactinreceptor，PRLR)是催乳素行使功能所必需的。催乳素基因的主要功能是促进哺乳动物个体的乳腺发育、乳汁生成、发动和维持泌乳方面发挥重要作用。例如，PRLR在垂体PRL与乳蛋白基因的信号转导过程中起核心作用。两分子PRLR与一分子PRL结合，启动JAK2/STAT5信号传导途径，最终激活反式作用因子STAT5，使其作用于乳蛋白基因启动子区的靶序列，启动或增强以乳蛋白基因启动子为作用元件的靶基因的表达。
发明人对小尾寒羊的BMPR-1B基因研究表明，小尾寒羊中存在BMPR-1B基因A746G突变，并与2个月抽样8次的泌乳量关联性研究表明，该突变与小尾寒羊的泌乳量密切相关，小尾寒羊泌乳量呈AA>AG>GG。
对小尾寒羊PRLR基因的研究表明，小尾寒羊PRLR基因第二外显子34位存在一个C-T突变(记为E2-C34T)，与2个月抽样8次的泌乳量进行相关性分析，表明该突变与小尾寒羊的泌乳量密切相关，泌乳量呈CT>TT。
同样饲养条件下，个体泌乳量分泌的差异从根本上讲是由控制泌乳的基因造成的，因此，通过我们通过基因与泌乳性能相关性的研究，确定BMPR-1B基因A746G突变和PRLR基因E2-C34T位点与泌乳量大小密切相关，本发明可通过两个基因两个SNP检测就可以预测小尾寒羊的泌乳量大小，从而为生产和育种提供技术支撑。
本发明还提供一种预测小尾寒羊泌乳量的方法，包括以下步骤：抽提小尾寒羊基因组DNA；分别扩增含SNP位点PRLR基因E2-C34T和PRLR基因E2-C34T的序列；判定PRLR基因E2-C34T及PRLR基因E2-C34T突变基因型。
综合BMPR-1B基因A746G位点，PRLR基因E2-C34T位点及两个位点基因型组合与平均总泌乳量的分析，得出结论，BMPR-1B基因A746G位点和PRLR基因E2-C34T位点显著影响了小尾寒羊母羊的泌乳量，由此我们可以通过检测BMPR-1B基因A746G位点和PRLR基因E2-C34T位点的基因型，就可以准确地预测小尾寒羊的泌乳量大小。
通过BMPR-1B基因和PRLR基因2个SNP位点不同基因型组合分析表明，小尾寒羊泌乳量呈CT/++>TT/++>CT/B+>TT/B+>CT/BB>TT/BB。通过两个基因两个SNP位点的检测获得基因型，就可以预测小尾寒羊的泌乳量大小，也可以通过分子育种选育小尾寒羊高泌乳量种群。
本发明还提供预测小尾寒羊泌乳量的试剂盒，包括基因组DNA抽提试剂、用于扩增含SNP位点BMPR-IBA746G序列的引物对和或用于扩增含SNP位点PRLR基因E2-C34T序列的引物对以及PCR体系反应试剂。
本发明的另一个目的是提供检测SNP位点BMPR-IBA746G的物质或检测SNP位点PRLR基因E2-C34T的物质在制备预测小尾寒羊泌乳量的试剂盒中的应用。
基因的选择是遗传基础上的直接选择，家畜出生即可进行基因的鉴别，从而可以达到精确选择和缩短育种进程，在生产中应用本发明，根据泌乳控制基因型的不同，进行饲养管理，进行后天的补救，提高泌乳量量，保证了羔羊有足够的乳汁摄入，提高成活率，减少养殖经济损失。
本发明为预测和分子选育小尾寒羊泌乳量提供了分子水平的技术支撑，应用本发明将大幅度提高羔羊成活率和发育速度，产生更好的养殖经济效益，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为PRLR基因E2-C34T位点的测序结果判定。
具体实施方式
本发明公开了BMPR-1B基因或PRLR基因SNP位点预测小尾寒羊泌乳量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：BMPR-1B基因A746G位点检测方法
1.样品采集和DNA提取
小尾寒羊颈静脉采血，所采血样为2-5mL/只绵羊，用肝素钠抗凝，-20℃冻存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于超纯水，4℃保存待用。
2.引物序列
根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB(bonemorphogeneticproteinreceptorIB,BMPR-IB)基因(GenBank登陆号AF357007和AF298885)包含A746G突变位点的序列设计引物，扩增长度为140bp，引物序列为：
Forward:5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3’；
Reverse:5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3’。
3.PCR-RFLP
PCR20μl反应体系组成：TaqDNA聚合酶(5u/μl)0.12μl；10×PCR缓冲液2μl；MgCl2(25mmol/L)2μl；dNTP(2.5mmol/L)2μl；基因组DNA1ul(50ng左右)；上游引物(10pmol/ml)1.0μl；下游引物(10pmol/ml)1.0μl；最后加水至20μl混匀进行PCR扩增。
采用PCR反应程序如下：94℃,4分钟；94℃,30秒，62℃,30秒，72℃,30秒共35个循环，72℃,4分钟；4℃下保存。
PCR扩增产物用AvaII酶进行酶切，反应总体积为20uL：内切酶(10u/μl)0.8μl；10×Buffer2μl；PCR产物.4μl；加水至20μl，37℃反应6h。
4.结果判定
用AvaII内切酶对BMPR-IBA746G突变引物的PCR扩增产物(140bp)进行酶切，琼脂糖电泳对酶切产物进行检测。突变纯合子切为110和30bp，杂合子140、110、30bp三条带，未突变个体不能被切开。突变纯合子命名为BB，杂合子为B+，正常个体为++。
实施例2、PRLR基因E2-C34T位点检测方法
1.样品采集和DNA提取
小尾寒羊颈静脉采血，所采血样为2-5mL/只绵羊，用肝素钠抗凝，-20。C冻存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于超纯水，4℃保存待用。
2.E2-C34T突变位点测序引物序列
根据绵羊催乳素受体基因PRLR第二外显子序列设计引物，引物序列为：
Forward:5'-GACGTTTCCTCCACCACAGAT-3'
Reverse:5'-CCAACACACACGTGCTCAGA-3'
PCR产物长度为270bp，将PCR产物送上海生工生物有限公司进行序列测定。依据测序图谱，判定SNP位点。
3.依据测序图谱判定测序结果见图1。
实施例3、BMPR-1B基因和PRLR基因SNP位点与泌乳量相关性分析
1.小尾寒羊泌乳量测定
在同一羊场同一饲养条件下，48只小尾寒羊产羔后进行每周一次泌乳量的抽样测定，连续测定2个月即8次，测定时母羊和羔羊隔离24小时，母羊在挤奶前天晚20.00点挤干净奶隔离，在次日上午8.00，中午14.00，晚20.00进行三次挤奶，并进行称量和记录，三次合并作为该母羊一天的泌乳量，乳汁称量后反哺给羔羊。
2.BMPR-1B基因A746G位点与泌乳量相关性分析
利用SPSS13.0统计分析软件，采用最小二乘方差分析BMPR-IBA746G位点不同基因型个体与泌乳量的相关性，结果见下表1。
表1小尾寒羊产泌乳量与BMPR-IBA746G位点的相关性
单位：g
注：上标大写字母表示差异极显著p<0.01。
上表结果表明，小尾寒羊BMPR-IBA746G突变位点3种基因型个体间的平均泌乳量差异极显著(P<0.01)。泌乳量呈++>B+>BB
2.PRLR基因E2-C34T位点与泌乳量相关性分析
用SPSS13.0统计分析软件，采用最小二乘方差分析PRLR基因E2-C34T位点不同基因型个体与泌乳量的相关性,结果见下表2。
表2小尾寒羊PRLR基因E2-C34T位点与乳量的相关性
注：上标小写字母不同表示差异显著p<0.05
从上表结果得知，PRLR基因E2-C34T位点两种基因型个体之间平均总泌乳量差异显著(P<0.05)，泌乳量C/T>TT。
3.BMPR-1B基因A746G位点和PRLR基因SNP位点与泌乳量的相关性联合分析
BMPR-1B基因A746G位点和PRLR基因SNP位点在群体中存在六种组合基因型，分析它们与平均总泌乳量的相关性，结果见下表3。
表3小尾寒羊泌乳量与BMPR-1B基因A746G和PRLR基因E2-C34T位点相关性联合分析
单位：g
注：大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。
由上表分析结果得知，小尾寒羊群体中BMPR-1B基因A746G和PRLR基因E2-C34T位点两个位点的6种基因型，CT/++基因型个体平均泌乳总量最高，TT/BB基因型最低，泌乳量呈CT/++>TT/++>CT/B+>TT/B+>CT/BB>TT/BB。CT/++基因型个体平均泌乳总量与TT/BB基因型之间差异极显著(P<0.01)。
综合BMPR-1B基因A746G位点，PRLR基因E2-C34T位点及两个位点基因型组合与平均总泌乳量的分析，得出结论，BMPR-1B基因A746G位点和PRLR基因E2-C34T位点显著影响了小尾寒羊母羊的泌乳量，由此我们可以通过检测BMPR-1B基因A746G位点和PRLR基因E2-C34T位点的基因型，就可以准确地预测小尾寒羊的泌乳量大小，根据基因型不同，可以进行差异化管理，可以大幅度提高小尾寒羊羔羊的成活率，为生产保驾护航。或者进行分子育种，通过基因型的直接选择，选育泌乳量大的种群，为后代羔羊成活和生长发育打好基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种预测小尾寒羊泌乳量的方法，其特征在于，包括以下步骤：抽提小尾寒羊基因组DNA；扩增含SNP位点BMPR-IBA746G的序列；判定BMPR-IBA746G突变基因型。
2.一种预测小尾寒羊泌乳量的方法，其特征在于，包括以下步骤：抽提小尾寒羊基因组DNA；扩增含SNP位点PRLR基因E2-C34T的序列；判定PRLR基因E2-C34T突变基因型。
3.一种预测小尾寒羊泌乳量的方法，其特征在于，包括以下步骤：抽提小尾寒羊基因组DNA；分别扩增含SNP位点BMPR-IBA746G和PRLR基因E2-C34T的序列；判定上述扩增序列的突变基因型。
4.一种预测小尾寒羊泌乳量的试剂盒，其特征在于，包括基因组DNA抽提试剂、用于扩增含SNP位点PRLR基因E2-C34T序列的引物对及PCR体系反应试剂；
所述引物对为：5'-GACGTTTCCTCCACCACAGAT-3'，
5'-CCAACACACACGTGCTCAGA-3'。
5.一种预测小尾寒羊泌乳量的试剂盒，其特征在于，包括基因组DNA抽提试剂、用于扩增含SNP位点BMPR-IBA746G序列的引物对、用于扩增含SNP位点PRLR基因E2-C34T序列的引物对以及PCR体系反应试剂；
所述用于扩增含SNP位点BMPR-IBA746G序列的引物对为：
5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3'，
5'-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3'；
所述用于扩增含SNP位点PRLR基因E2-C34T序列的引物对为：
5'-GACGTTTCCTCCACCACAGAT-3'，
5'-CCAACACACACGTGCTCAGA-3'。
6.检测SNP位点BMPR-IBA746G的物质在制备预测小尾寒羊泌乳量的试剂盒中的应用。
7.检测SNP位点PRLR基因E2-C34T的物质在制备预测小尾寒羊泌乳量的试剂盒中的应用。
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