CN102162013B - 绵羊bmpr-1b基因a746g多态性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因分析检测产品，更具体的说是适用于绵羊BMPR-1B基因A746G多态性检测试剂盒及检测方法。公开的绵羊BMPR-1B基因A746G多态性检测试剂盒，主要包含扩增液、至少1张基因芯片、杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ、预杂交液、Taq酶、杂交显色试剂；另外公开了利用该试剂盒进行检测的方法步骤：制备多个绵羊的染色体DNA备用；试剂盒组装；用PCR方法扩增；变性处理；预杂交及杂交；杂交信号检测。该试剂盒是一种灵敏度高、操作简便、准确率高，可有效提高工作效率、经济实用的适用于检测绵羊BMPR-1B基因A746G多态性，所提供的检测方法可实施规模检测、简便实用、大大提高了工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因分析检测产品，更具体的说是适用于绵羊BMPR-1B基因A746G多态性检测试剂盒及检测方法。
背景技术
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应，只需一次实验，就可高通量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在基因表达、基因多态性检测等方面的应用受到广泛重视。
绵羊多胎性状是绵羊业多产，高产的基础。绵羊的多胎性状已经引起国际动物遗传育种界的普遍重视。对于绵羊多胎基因突变位点的检测国内外也做了大量的工作，多采用检测单个碱基的差异（或突变）来标示其多态性，该工作重复劳动多，消耗高，自动化程度低，该手段目前已经不适应大规模、低消耗和自动化的要求，应用基因芯片方法检测可以克服这些不足，而且随着芯片技术的发展，其检测速度、特异性和敏感性也不断提高，尤其是第三代遗传标记单核苷酸多态（SNP）的出现，使得可以更方便快捷地应用基因芯片进行大规模多态性检测。
研究表明，BMPR-1B基因A746G为控制绵羊多胎性状的基因位点。
绵羊是季节性发情的动物，排卵率和产羔率低，反映绵羊繁殖力的主要指标产羔数的遗传力平均仅为0.10左右。但是有些品种的绵羊却有很高的排卵率，通过研究发现，BMPR-1B基因为中国美利奴羊、小尾寒羊、湖羊等绵羊品种的高繁殖率和高产羔数主效基因，由于BMPR-1B基因B等位基因在绵羊群体中存在，使得这些羊群的繁殖率比较高。即BMPR-1B基因的不同基因型能够决定绵羊的产羔数。BMPR-1B基因在中国美利奴羊群中存在3种基因型，分别为AA、AB、BB三种基因型，三种基因型的存在是由于BMPR-1B基因在746位点处A-G的碱基置换所致。其中其效应表现为：BB突变型即：BMPR-1B基因746位双链的A碱基均置换为G碱基，所述BB突变型绵羊平均排卵数增加3枚，每只母羊平均每胎能多产1.5只羔羊，一胎可以产3-5只羔羊；AB杂合型即：BMPR-1B基因746位点处一条链的A碱基置换为G碱基，所述AB杂合型羊与地方品种羊相比，平均排卵数增加1.5枚，每只母羊平均每胎能多产1.0只羔羊，一胎可以产2-3只羔羊；AA野生型即：BMPR-1B基因746位点处的碱基均没有发生突变，所述AA野生型羊产羔数与地方品种羊接近，一胎可以产1-2只羔羊。因此，通过对母羊BMPR-1B基因的检测，开展BMPR-1B基因标记辅助选择，组建BB基因型绵羊群体，是快速提高绵羊繁殖力的一个有效方法，能够使群体平均产羔数达到230%以上，极大的增加羔羊数量，增加养羊的经济效益。
前期研究表明：小尾寒羊大部分为BMPR-1B基因突变纯合子，湖羊全部为BMPR-1B基因突变纯合子，而湖羊的杂交后代以杂合子AB为主。而在中国美利奴羊群体中存在BMPR-1B基因的三种基因型。
目前，针对BMPR-1B基因的检测，大多数研究人员采用PCR-RFLP技术，而PCR-RFLP技术存在检测速度慢，不能适应在绵羊群体中开展大规模、并行的检测目的基因的要求。而利用基因芯片技术高通量地检测绵羊BMPR-1B-746的基因型，将可以为畜牧业育种提供一种准确、快速、价廉的基因检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简便、准确率高，可有效提高工作效率、经济实用的适用于检测绵羊BMPR-1B基因A746G多态性的试剂盒以及提供一种可规模检测、简便实用、大大提高工作效率的检测方法。
本发明公开了一种绵羊BMPR-1B基因A746G多态性检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要包括下列扩增液、至少1张基因芯片、杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ、预杂交液、Taq酶、杂交显色试剂；
所述的扩增液中的每种扩增液中分别包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP：
SP1：<210>1、SP2: <210>2、SP3:
<210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6:
<210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9:
<210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12:
<210>12、QP: <210>13；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的编码序列和3’端21nt的特异序列组成；
所述的基因芯片是将5’端带氨基修饰和16聚脱氧胸苷酸的捕获探针P1-P12分A、B二个反应区顺序固定于醛基修饰的载玻片上制成，所述P1-P12的序列如下：
P1: <210>14、P2:
<210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5:
<210>18、P6: <210>19、P7: <210>20、P8:
<210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11:
<210>24、P12: <210>25；
以上捕获探针的序列与相对应的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的编码序列一致；
所述基因芯片的A、B两个反应区分别设有标志列探针，所述标志列探针序列为：<210>26；
所述的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中分别含有5’端带有生物素或荧光基团标记的识别探针a和b，所述的生物素或荧光基团用X表示，识别探针a和b的序列如下：识别探针a：<210>27、识别探针b：<210>28。
一种绵羊BMPR-1B基因A746G多态性的检测方法，其特征在于主要包括以下步骤：
（1）制备多个绵羊的染色体DNA备用；
（2）试剂盒组装，其中主要包括：分别装有12种扩增液的扩增管，至少1张基因芯片，杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ，预杂交液、Taq酶，杂交显色试剂；
所述的12种扩增液的每种扩增液中分别包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP：
SP1：<210>1、SP2: <210>2、SP3:
<210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6:
<210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9:
<210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12:
<210>12、QP: <210>13；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的编码序列和3’端21nt的特异序列组成；
所述的基因芯片是将5’端带氨基修饰和16聚脱氧胸苷酸的捕获探针P1-P12分A、B二个反应区顺序固定于醛基修饰的载玻片上制成，所述P1-P12的序列如下：
P1: <210>14、P2:
<210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5:
<210>18、P6: <210>19、P7: <210>20、P8:
<210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11:
<210>24、P12: <210>25；
以上捕获探针的序列与相对应的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的编码序列一致；
所述基因芯片的A、B两个反应区分别设有标志列探针，所述标志列探针序列为：<210>26；
所述的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中分别含有5’端带有生物素或荧光基团标记的识别探针a和b，所述的生物素或荧光基团用X表示，识别探针a和b的序列如下：识别探针a：<210>27、识别探针b：<210>28。
（3）用PCR方法扩增：在试剂盒中的每个扩增管中加入一个绵羊的染色体DNA作为扩增模板，用聚合酶链式反应PCR方法扩增多个绵羊的BMPR-1B基因包含A746G的基因片段，得到PCR扩增产物；
（4）变性处理： 将所得到的各个扩增管的PCR扩增产物变性处理，之后分别取一定体积的变性后扩增产物，分别加入杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中，混匀备用；
（5）预杂交及杂交：先将基因芯片与预杂交液进行预杂交、然后将上述备用的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ分别与基因芯片的A和B反应区域的捕获探针P1-P12阵列杂交；
（6）杂交信号检测：进行显色处理后检测基因芯片A和B反应区域阵列的杂交信号。
所述试剂盒的组装包括预杂交液，在检测过程中的杂交步骤之前进行预杂交。
所述的用PCR方法扩增步骤中的退火温度最好设置为53℃。
所述的杂交步骤中的杂交温度最好设置为46℃。
制备用于PCR扩增的绵羊染色体DNA的方法有很多，可以从全血中制备、也可以从组织样本中制备。具体方法可参阅文献(丁振诺，苏明权主编.《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司.1998年第一版)。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域公知技术。其中本发明涉及的扩增体系和扩增程序可根据有关文献(KB穆里斯，F.费里，R.吉布斯等主编《PCR聚合酶链式反应》，科学出版社.1998年)方法由使用者独立完成。
所述识别探针a和b的5’端带有生物素或荧光基团的标记，所述标记包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年；马立人，蒋中华 主编，《生物芯片》，北京：化学工业出版社，2000，1-130。
扩增产物的变性可采用常规变性方法，如加热至94～98℃，并保温2～10min，然后迅速置于冰上。
所述基因芯片设计原理：
控制绵羊多胎性状的BMPR-1B基因在746处有一个单核苷酸多态性（A-G突变），所以要遵循突变基因的引物和探针设计原理。另外考虑到每张芯片要检测多只羊（暂定为12羊份/张），以减少芯片制作及检测成本。
在本发明的基因芯片设计时采用了夹心杂交原理：针对BMPR-1B基因A746G突变位点设计识别探针（识别探针a和b），当识别探针带Biotin标记时，其中识别探针a识别AA基因型，识别探针b识别BB基因型。将羊的BMPR-1B基因特异性探针（编号：P1-P12，其中，P1-P12序列不同，用来区别12只绵羊个体）作为检测探针P，检测探针P点在基因芯片A区域反应区和B区域反应区上制成阵列，检测时将识别探针a、识别探针b分别与样品的扩增产物（不带标记）一起加入到杂交缓冲溶液中与基因芯片杂交。
此时基因芯片上将发生如图1所示的夹心杂交即：扩增产物M位于捕获探针P和识别探针A/B的中间。①捕获探针P1-P12（每一样品对应不同的捕获探针，用于区别不同样品的扩增产物）按照图2的点阵模式固定在芯片L上；②用含编码序列的下游引物（SP1-SP12）与公用上游引物(QP)对模板DNA进行PCR特异扩增后，产生的扩增产物M；③将12个样品的扩增产物混合后变性（平行做A、B两管），然后分别加入含有用Biotin（X）标记的识别探针a和b的杂交缓冲液中混匀，标记为A、B两管混合液，将两管混合液分别加入同一张芯片上A、B两个反应区中进行杂交反应；④12个样品的扩增产物M的3’端的编码序列C与固定在芯片L上的特异性捕获探针P1-P12互补（每一样品对应不同的捕获探针，用于区别不同样品的扩增产物），在适合的温度下，扩增产物与捕获探针进行杂交。从而形成芯片-捕获探针P-扩增产物M的模式；⑤同时，12个样品的扩增产物M的检测位点序列（包含BMPR-1B-746位点的25bp序列）与识别探针a或b（带Biotin标记，用于区分BMPR-1B-746位点的基因型）互补。在适合的杂交温度下，若扩增片段中含有与杂交缓冲液A或B中带Biotin标记的识别探针a或b互补的序列，则与该Biotin标记的识别探针a或b杂交，使扩增产物带上Biotin标记；⑥将Biotin标记进行显色处理，如果扩增产物M的检测位点序列与识别探针a或b互补，即可检测到信号。否则检测不到信号。根据芯片上同一样品对应的A和B两个阵列上检测位点的信号强度来判断每一样品的基因型。
若检测样品的BMPR-1B基因型为AA型，则扩增产物M的一端将与野生型的识别探针a杂交而带上Biotin标记，将Biotin标记进行显色处理，即可检测到信号。同理，如果羊的BMPR-1B基因型为AB型，经PCR扩增，其扩增产物M为AA型和BB型的混合物，该扩增产物M会同时和AA型以及BB型的识别探针a和识别探针b杂交，因而在探针的这两个位置均会有杂交信号出现。如果羊的BMPR-1B基因型为BB型，则其扩增产物的一端会与BB型识别探针b杂交，因而经显色处理，即可检测到信号。
所述基因芯片的杂交与显色方法:
杂交缓冲液与基因芯片杂交时，可以先将基因芯片与预杂交液进行预杂交。
本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交可以按照本领域的常规方法进行。
本发明所述检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲合素或链亲合素复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)或四甲基联苯胺(TMB)的显色反应。
本发明实施例中的检测识别探针采用Biotin标记，Biotin标记的检测目前大多采用显色检测。显色方法主要有碱性磷酸酶（AP）催化的NBT/BCIP显色反应和辣根过氧化物酶（HRP）催化的邻-联茴香胺或四甲基联苯胺的显色反应。由于AP体系的灵敏度高于HRP体系大约10倍，本发明实施例中采用AP显色体系：
首先，检测识别探针上的Biotin先与链亲和素碱性磷酸酶复合物（Streptavidin-AP）反应，生成新的复合物：Biotin-Streptavidin-AP，后者发生如下的显色反应：
Biotin-Streptavidin-AP + BCI-P → BCI-OH + Pi （pH
7.5）
BCI-OH + NBT →
蓝紫色沉淀
其中，BCIP为5溴-4氯-3吲哚磷酸（5-bromo-4chloro-3indolylphosphate）；NBT为硝基四氮唑蓝（nitro
blue tetrazolium）。
与现有技术相比，本发明的优点：
（1）芯片检测过程中，PCR产物的特异性、杂交探针的特异性、标记物的灵敏度、杂交最适温度、质控点以及杂交检测过程中严谨的洗涤操作都成为基因芯片成功检测的关键因素。因此在设计芯片时，每一个样本都设置了标志列，对芯片的点样质量、检测试剂的有效性及检测中每一步的操作正确性进行控制。采用夹心杂交原理，经过多次实验验证，筛选出12对合适的引物，能够在53℃的退火温度下，同时一次性完成一批样本的PCR扩增。根据12对合适的引物设计对应的探针，确定最佳杂交温度为46℃，所设计的12对引物、12条捕获探针和2条识别探针能够保证检测的准确性。
以上检测试剂盒中所包含的PCR扩增、芯片杂交、显色、检测过程能够准确检测绵羊多胎性状主效基因BMPR-1B基因的不同基因型，从而能够实现准确、快速、并行的绵羊多胎性状主效基因标记辅助育种。
（2）以上部分BMPR-1B基因PCR产物经生工生物（上海）有限公司测序验证。测序图谱见图5，基因芯片检测结果与测序结果完全符合。
（3）基因芯片探针之间的特异性
图3表明，12个实验样本，存在3种基因型（AA、AB、BB），通过基因芯片检测，以及与测序结果比较，不同基因型样本之间没有发生交叉杂交的现象，芯片检测的背景均一，说明设计的每一个探针的特异性高。
（4）芯片检测的重复性
从480只中国美利奴（新疆军垦型）羊中随机选出30只羊，每一只羊的基因组DNA样本至少用两对引物分别进行PCR扩增，再用基因芯片检测，结果表明所有样本经多次检测，分析结果都相同，重复率高，说明探针设计合理，芯片检测结果可靠。
（5）为了进一步证明基因芯片分析结果的可靠性，实验中同时应用基因芯片检测试剂盒和传统的PCR-RFLP（限制性片断长度多态性）对480只中国美利奴（新疆军垦型）羊进行BMPR-1B基因检测，对比分析，两种方法检测BMPR-1B基因的基因型结果均一致，芯片检测准确率达到100%，其中AA基因型个体数为238只，AB基因型个体数为202只，BB个体数为40只，说明设计的基因芯片检测绵羊多胎主效基因BMPR-1B基因是可行的。
本发明提供的试剂盒，可用于检测绵羊BMPR-1B基因A746G多态性，从而实现绵羊多胎性状的高效、价廉检测，为畜牧生产中高繁殖力种羊的筛选提供必要信息；本发明提供的检测方法可实现规模化、并行检测，简便实用，大大提高了工作效率。
附图说明
图1为本发明试剂盒的检测原理示意图，如图1所示，本试剂盒采用的工作原理：含编码序列的上游引物与公用下游引物对模板DNA进行特异扩增后产生的扩增产物M，其3’端的编码序列C与固定在芯片L上的特异性捕获探针P互补（每一样品对应不同的捕获探针，用于区别不同样品的扩增产物），其扩增片段的检测位点序列与识别探针a或b（带Biotin标记，用于区分BMPR-1B-746基因型）互补。
将各样品扩增产物混合后变性（平行做两管），然后分别加入含Biotin标记识别探针a和b的杂交缓冲液中混匀，在同一张芯片上A、B两个不同的反应区（两个反应区的阵列及各信号点分别对应的探针一致）中进行杂交反应。每个样品对应的扩增产物，其3’端会与芯片上的捕获探针杂交，若该扩增片段中含有与杂交缓冲液A或B中带Biotin标记的识别探针a或b互补的序列，则与该Biotin标记的识别探针a或b杂交，使扩增产物带上Biotin标记。将Biotin标记进行显色处理，即可检测到信号。否则检测不到信号。根据芯片上同一样品对应的A和B两个阵列上检测位点的信号强度来判断每一样品的基因型。
图2为特异性捕获探针的基因芯片点阵模式示意图，图中所示左半部分区域为A反应区，右半部分区域为B反应区，“标”为标志列。
图3为用本发明试剂盒检测12只绵羊BMPR-1B基因A746G多态性所得结果示意图。
图4为绵羊BMPR-1B基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker，1-12为BMPR-1B基因PCR扩增产物，C为空白对照，从图上可见，有139bp的扩增带，空白对照无条带，证明设计的引物及PCR条件能够正确扩增BMPR-1B基因。
图5为对实施例1中1号与5号绵羊样本BMPR-1B基因PCR扩增产物的测序图谱，如图5所示，左边测序图为1号样本经PCR扩增及测序，证明在BMPR-1B基因746处碱基为A，对应BMPR-1B基因型为AA基因型；右边测序图为5号样本经PCR扩增及测序，证明在BMPR-1B基因746处碱基为G，对应BMPR-1B基因型为BB基因型；经对比，基因芯片检测结果与测序结果完全符合。
具体实施方式
实施例1
参考图1－图5，下面结合附图对实施例详细描述本发明的技术方案，本实施例实施步骤如下：
一、制备多个绵羊的染色体DNA备用
（1）采集：本方法适用于EDTA抗凝的全血样本。采集被检测绵羊静脉血0.5ml，用一次性无菌注射针头抽取，收集于含100µl的2% EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中，盖上管盖，上下颠倒数次使混匀。
（2）存放：血样在2-8℃保存，保存期不应超过3周；在-20℃保存期半年，-80℃可长期保存，但严禁反复冻融。
（3）运输：用冰壶加冰或泡沫箱加干冰密封运输。
（4）利用上海百傲科技有限公司生产的“血细胞基因组DNA提取试剂盒”，该产品编号：BST01013 ，按说明书提取绵羊基因组DNA备用。
二、试剂盒组装，其中包括：分别装有12种扩增液的扩增管，1张基因芯片，预杂交液,杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ，Taq酶，杂交显色试剂；
所述的12种扩增液的每种扩增液中分别包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP：
SP1：<210>1、SP2: <210>2、SP3:
<210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6:
<210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9:
<210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12:
<210>12、QP: <210>13；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的编码序列和3’端21nt的特异序列组成；
所述的基因芯片是将5’端带氨基修饰和16聚脱氧胸苷酸的捕获探针P1-P12分A、B二个反应区顺序固定于醛基修饰的载玻片上制成的，所述P1-P12的编码序列如下：
P1: <210>14、P2:
<210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5:
<210>18、P6: <210>19、P7: <210>20、P8:
<210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11:
<210>24、P12: <210>25；
以上捕获探针的编码序列与相对应的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的编码序列一致；
所述基因芯片的A、B两个反应区分别设有标志列探针，所述标志列探针序列为：<210>26；
所述的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中分别含有5’端带有生物素或荧光基团标记的识别探针a和b，所述的生物素或荧光基团用X表示，识别探针a和b的编码序列如下：识别探针a：<210>27、识别探针b：<210>28。
三、用PCR方法扩增BMPR-1B基因含A746G位点的基因片断
1、合成公用上游引物(QP)和下游引物（SP1-SP12）即<210>1-<210>13：
SP1: 5’ tgctgctagcatgccgacgt aatctgtgattaggtacagtt
3’
SP2: 5’ tgcagcatgctagccgacgt aatctgtgattaggtacagtt
3’
SP3: 5’ tgcagcaacgttgccgagct
aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP4: 5’ tgcagctagcatcgcgacgt
aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP5: 5’ tgcagctgacatgccgaggt
aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP6: 5’ tgcagctagcagtccgacct
aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP7: 5’ tgcagctggcataccgacga aatctgtgattaggtacagtt
3’
SP8: 5’ tgcagccagcatgtcgacgt
aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP9: 5’ tcgagctagactgccgacgt
aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP10: 5’ tgcagcctgattgccgacgt aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP11: 5’ tgcagctagccgtacgacgt aatctgtgattaggtacagtt 3’
SP12: 5’ tgcagctacggtaccgacgt aatctgtgattaggtacagtt 3’
QP: 5’ gtt
ccg aga gac aga aat ata tc 3’
上述系列下游引物（SP1-SP12）均由5’端20nt的编码序列和3’端21nt的特异序列组成。其中下游引物划线部分的序列与相应的捕获探针序列一致，序列中碱基不同主要用于区别不同的12个样本。下游引物未画线的序列与BMPR-1B基因编码序列互补。
合成的引物序列用去离子水溶解并稀释至10μmol/l的使用液浓度。
2、PCR扩增目的基因片断
试剂组成：Taq酶：产品编号ET101-02-01，天根生化科技(北京)有限公司
10×Taq Buffer：含预混Mg2+
，产品编号ET101-02-01，天根生化科技(北京)有限公司
dNTP（各2.5 mM，N=A，T，C，G）：产品编号D0056，生工生物（上海）有限公司
Y-1扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP1，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水
Y-2扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP2，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-3扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP3，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-4扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP4，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-5扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP5，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-6扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP6，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-7扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP7，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-8扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP8，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-9扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP9，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-10扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP10，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-11扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP11，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
Y-12扩增液：1μl上游引物QP，1μl下游引物SP12，2.5μl 10×Taq Buffer，2.5μl dNTP，14μl去离子水，共21μl混合液
琼脂糖：产品编号AB0014，生工生物（上海）有限公司
DNA标准分子量：pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker，产品编号SM0221，生工生物（上海）有限公司
操作步骤
（1）从试剂盒中取出Y-1至Y12扩增液和Taq酶，3000×g离心30 sec，使液体流回管底；分别在每管中加入Taq 酶（1U/µl）1µl。
（2）分别在Y-1扩增液到Y-12扩增液管中各加入提取的相应基因组DNA
3µl，总体积25µl，混匀。
（3）用PCR扩增仪（Tc-25/H PCR扩增仪，杭州大和热磁电子有限公司）按下列条件扩增：94℃ 5min；94℃ 25sec，53℃ 25sec，72℃ 25sec，40个循环；72℃ 5min。
（4）配制1.5%的琼脂糖凝胶，取各管PCR扩增产物各5µl，以100V恒定电压，30min电泳检测PCR扩增的BMPR-1B基因片断，对PCR产物测序。图4为PCR产物电泳图，其中M为pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker，1-12为BMPR-1B基因PCR扩增产物，C为空白对照，从图4可见，有139bp的扩增带，空白对照无条带。证明设计的引物及PCR条件能够正确扩增目的基因。
四、PCR产物与基因芯片的杂交
利用本发明试剂盒中的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ以及采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒中所包含的：预杂交液、洗液1、 反应舱进行杂交试验。所述芯片杂交试剂盒(产品编号：BST05010，上海百傲科技有限公司)
所述的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中分别含有5’端带有生物素或荧光基团标记的识别探针a和b，所述的生物素或荧光基团用X表示，识别探针a和b的序列如下：
识别探针a为<210>27：5’X-
ctc atc aac acc gtc t ga tat att t 3’
识别探针b为<210>28：5’X-
ctc atc aac acc gtc c ga tat att t 3’
识别探针的序列与BMPR-1B基因含A746G位点处25bp编码序列互补，所述的碱基对应A746G位点，其中，t碱基对应A等位基因，c碱基对应B等位基因。
1、取12管PCR扩增产物各4µl，加至0.2ml的薄壁管中（自备），分别制备2管PCR扩增混合物，98℃热变性5min，取出后迅速放入冰盒，-20℃ 放置备用。
2、取出基因芯片，做好样品编号，在A、B杂交舱中各加满预杂交液溶液（约110µl），于46℃静置5min，将杂交舱中的溶液吸除干净；
3、从杂交缓冲液Ⅰ（含有识别探针a，浓度为100pM）中吸出70µl溶液，加到已变性的一管PCR扩增混合物中，混匀，将混合液小心加入芯片上的A杂交舱中，加液时应注意无气泡产生；
4、从杂交缓冲液Ⅱ（含有识别探针b，浓度为100pM）中吸出70µl溶液，加到已变性的另一管PCR扩增混合物中，混匀，将混合液小心加入芯片上的B杂交舱中，加液时应注意无气泡产生；
5、将基因芯片迅速放入46℃恒温箱中，保温30min。从洗液1中吸出700µl洗液1置1.5ml离心管中，于46℃恒温箱中预热；
6、从恒温箱中取出基因芯片，吸除A、B杂交舱中溶液；
7、在A、B杂交舱中各加入110µl已预热的洗液1，46℃保温5min，然后将杂交舱中溶液吸除干净。再重复此步骤两次。
五、基因芯片杂交信号的显色
本实施例试剂盒中的杂交显色试剂采用上海百傲科技有限公司的芯片显色试剂盒进行显色试验。所述芯片显色试剂盒(产品编号：BST06010，上海百傲科技有限公司)包含：抗体液，洗液2，洗液3，显色液。
1、在A、B杂交舱中分别加入110µl洗液2溶液，室温放置2min；
2、将杂交舱中溶液吸除干净，向A、B杂交舱中分别加入110µl抗体液溶液，室温放置20min；
3、将杂交舱中溶液吸除干净，向A、B杂交舱中分别加入110µl洗液2溶液，室温静置2min。再重复此步一次；
4、将杂交舱中溶液吸除干净，向A、B杂交舱中分别加入110µl洗液3溶液，室温放置1min；
5、将杂交舱中溶液吸除干净，向A、B杂交舱中分别加入110µl显色液溶液，46℃避光放置40min。
六、基因芯片杂交信号的检测
1、吸除A、B杂交舱中溶液，小心揭除杂交舱，将显色载玻片显色区小心用蒸馏水冲洗一下，置46℃烘干；
2、将显色载玻片面朝下扣在BaiO® BE-2.0生物芯片识读仪(Cat# BSE 01011 )的片槽上检测，具体操作见仪器使用说明。图3为得到的检测图像，经Array Doctor 2.0软件分析可自动输出检测结果：
1号样本，2号样本，7号样本，8号样本为：BMPR-1B基因746AA纯合子；
3号样本，4号样本，9号样本，10号样本为：BMPR-1B基因746AB杂合子；
5号样本，6号样本，11号样本，12号样本为：BMPR-1B基因746BB纯合子。
对检测结果的分析如下：
（1）芯片检测过程中，PCR产物的特异性、杂交探针的特异性、标记物的灵敏度、杂交最适温度、质控点以及杂交检测过程中严谨的洗涤操作都成为基因芯片成功检测的关键因素。因此在设计芯片时，每一个样本都设置了标志列，对芯片的点样质量、检测试剂的有效性及检测中每一步的操作正确性进行控制。采用夹心杂交原理，经过多次实验验证，筛选出12对合适的引物，能够在53℃的退火温度下，同时一次性完成一批样本的PCR扩增。根据12对合适的引物设计对应的探针，确定最佳杂交温度为46℃，所设计的12对引物、12条捕获探针和2条识别探针能够保证检测的准确性。
以上检测试剂盒中所包含的PCR扩增、芯片杂交、显色、检测过程能够准确检测绵羊多胎性状主效基因BMPR-1B基因的不同基因型，从而能够实现准确、快速、并行的绵羊多胎性状主效基因标记辅助育种。
（2）以上部分BMPR-1B基因PCR产物经生工生物（上海）有限公司测序验证。测序图谱见图5，基因芯片检测结果与测序结果完全符合。
（3）基因芯片探针之间的特异性
图3表明，12个实验样本，存在3种基因型（AA、AB、BB），通过基因芯片检测，以及与测序结果比较，不同基因型样本之间没有发生交叉杂交的现象，芯片检测的背景均一，说明设计的每一个探针的特异性高。
（4）芯片检测的重复性
从480只中国美利奴（新疆军垦型）羊中随机选出30只羊，每一只羊的基因组DNA样本至少用两对引物分别进行PCR扩增，再用基因芯片检测，结果表明所有样本经多次检测，分析结果都相同，重复率高，说明探针设计合理，芯片检测结果可靠。
（5）为了进一步证明基因芯片分析结果的可靠性，实验中同时应用基因芯片检测试剂盒和传统的PCR-RFLP（限制性片断长度多态性）对480只中国美利奴（新疆军垦型）羊进行BMPR-1B基因检测，对比分析，两种方法检测BMPR-1B基因的基因型结果均一致，芯片检测准确率达到100%，其中AA基因型个体数为238只，AB基因型个体数为202只，BB个体数为40只，说明设计的基因芯片检测绵羊多胎主效基因BMPR-1B基因是可行的。
上述实施例是提供给熟悉本领域内的人员来实现或使用本发明的，熟悉本领域的人员可在不脱离本发明的发明思想的情况下，对上述实施例做出种种修改或变化，因而本发明的保护范围并不被上述实施例所限，而应该是符合权利要求书提到的创新性特征的最大范围。
实施例2
本实施例具体检测方法参照实施例1，其不同地方在于本实施例试剂盒组成如下表所示：
| 名 称 | 规格（ml / 瓶) | 数量（个） | 名 称 | 规格(µl / 管） | 数量（个） |
| 抽提液1 | 45 | 1 | Taq酶 | 160 | 1 |
| 抽提液2 | 10 | 1 | Y-1扩增液 | 21 | 12 |
| 预杂交液 | 3 | 1 | Y-2扩增液 | 21 | 12 |
| 杂交缓冲液Ⅰ | 2 | 1 | Y-3扩增液 | 21 | 12 |
| 杂交缓冲液Ⅱ | 2 | 1 | Y-4扩增液 | 21 | 12 |
| 洗液1 | 9 | 1 | Y-5扩增液 | 21 | 12 |
| 洗液2 | 9 | 1 | Y-6扩增液 | 21 | 12 |
| 洗液3 | 3 | 1 | Y-7扩增液 | 21 | 12 |
| 抗体液 | 1 | 3 | Y-8扩增液 | 21 | 12 |
| 显色液 | 3 | 1 | Y-9扩增液 | 21 | 12 |
| Y-10扩增液 | 21 | 12 | |||
| Y-11扩增液 | 21 | 12 | |||
| Y-12扩增液 | 21 | 12 | |||
| 基因芯片 | 12张/盒 | 1 | 说明书 | 1 |
表中所示规格：每张芯片可同时检测12只羊。144只羊/盒。其中抽提液1及抽提液2包含在上海百傲科技有限公司生产的“血细胞基因组DNA提取试剂盒”中，该产品编号：BST01013
，按说明书提取绵羊基因组DNA即可；预杂交液及洗液1采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒，所述芯片杂交试剂盒产品编号：BST05010，上海百傲科技有限公司生产；其中洗液2、洗液3、抗体液、显色液采用上海百傲科技有限公司的芯片显色试剂盒进行显色试验。所述芯片显色试剂盒产品编号：BST06010。
实施例3
本实施例具体检测方法参照实施例1，其不同地方在于本实施例试剂盒组成如下表所示：
| 名 称 | 规格（ml / 瓶) | 数量（个） | 名 称 | 规格(µl / 管） | 数量（个） |
| 抽提液1 | 45 | 1 | Taq酶 | 160 | 1 |
| 抽提液2 | 10 | 1 | Y-1扩增液 | 21 | 1 |
| 预杂交液 | 3 | 1 | Y-2扩增液 | 21 | 1 |
| 杂交缓冲液Ⅰ | 2 | 1 | Y-3扩增液 | 21 | 1 |
| 杂交缓冲液Ⅱ | 2 | 1 | Y-4扩增液 | 21 | 1 |
| 洗液1 | 9 | 1 | Y-5扩增液 | 21 | 1 |
| 洗液2 | 9 | 1 | Y-6扩增液 | 21 | 1 |
| 洗液3 | 3 | 1 | |||
| 抗体液 | 1 | 3 | |||
| 显色液 | 3 | 1 | |||
| 基因芯片 | 1张/盒 | 1 | 说明书 | 1 |
表中所示规格：使用一张芯片可检测6只羊。其中抽提液1及抽提液2包含在上海百傲科技有限公司生产的“血细胞基因组DNA提取试剂盒”中，该产品编号：BST01013
，按说明书提取绵羊基因组DNA即可；预杂交液及洗液1采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒，所述芯片杂交试剂盒产品编号：BST05010，上海百傲科技有限公司生产；其中洗液2、洗液3、抗体液、显色液采用上海百傲科技有限公司的芯片显色试剂盒进行显色试验。所述芯片显色试剂盒产品编号：BST06010。
实施例4
本实施例具体检测方法参照实施例1，其不同地方在于本实施例试剂盒组成如下表所示：
| 名 称 | 规格（ml / 瓶) | 数量（个） | 名 称 | 规格(µl / 管） | 数量（个） |
| 抽提液1 | 45 | 1 | Taq酶 | 160 | 1 |
| 抽提液2 | 10 | 1 | Y-1扩增液 | 21 | 1 |
| 预杂交液 | 3 | 1 | Y-2扩增液 | 21 | 1 |
| 杂交缓冲液Ⅰ | 2 | 1 | Y-3扩增液 | 21 | 1 |
| 杂交缓冲液Ⅱ | 2 | 1 | Y-4扩增液 | 21 | 1 |
| 洗液1 | 9 | 1 | Y-5扩增液 | 21 | 1 |
| 洗液2 | 9 | 1 | Y-6扩增液 | 21 | 1 |
| 洗液3 | 3 | 1 | Y-7扩增液 | 21 | 1 |
| 抗体液 | 1 | 3 | Y-8扩增液 | 21 | 1 |
| 显色液 | 3 | 1 | Y-9扩增液 | 21 | 1 |
| Y-10扩增液 | 21 | 1 | |||
| 基因芯片 | 1张/盒 | 1 | 说明书 | 1 |
表中所示规格：一张芯片可检测10只羊。10只羊/盒。其中抽提液1及抽提液2包含在上海百傲科技有限公司生产的“血细胞基因组DNA提取试剂盒”中，该产品编号：BST01013
，按说明书提取绵羊基因组DNA即可；预杂交液及洗液1采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒，所述芯片杂交试剂盒产品编号：BST05010，上海百傲科技有限公司生产；其中洗液2、洗液3、抗体液、显色液采用上海百傲科技有限公司的芯片显色试剂盒进行显色试验。所述芯片显色试剂盒产品编号：BST06010。
<110> 新疆农垦科学院，上海百傲科技有限公司
<120> 绵羊BMPR-1B基因A746G多态性检测试剂盒及检测方法
<141>
<160> 28
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
tgctgctagc atgccgacgt aatctgtgat taggtacagt t 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
tgcagcatgc tagccgacgt aatctgtgat taggtacagt t 41
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
tgcagcaacg ttgccgagct aatctgtgat taggtacagt t 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
tgcagctagc atcgcgacgt aatctgtgat taggtacagt t 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
tgcagctgac atgccgaggt aatctgtgat taggtacagt t 41
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
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<223> 引物
<400> 6
tgcagctagc agtccgacct aatctgtgat taggtacagt t 41
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 7
tgcagctggc ataccgacga aatctgtgat taggtacagt t 41
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<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
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<223> 引物
<400> 8
tgcagccagc atgtcgacgt aatctgtgat taggtacagt t 41
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<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
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<223> 引物
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tcgagctaga ctgccgacgt aatctgtgat taggtacagt t 41
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<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
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<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
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tgcagctagc cgtacgacgt aatctgtgat taggtacagt t 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 12
tgcagctacg gtaccgacgt aatctgtgat taggtacagt t 41
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<211> 23
<212> DNA
<213> 绵羊（Ovis aries）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 13
gttccgagag acagaaatat atc 23
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
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mttttttttt ttttttttgc tgctagcatg ccgacgt 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 15
mttttttttt ttttttttgc agcatgctag ccgacgt 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 16
mttttttttt ttttttttgc agcaacgttg ccgagct 37
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 17
mttttttttt ttttttttgc agctagcatc gcgacgt 37
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 18
mttttttttt ttttttttgc agctgacatg ccgaggt 37
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 19
mttttttttt ttttttttgc agctagcagt ccgacct 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 20
mttttttttt ttttttttgc agctggcata ccgacga 37
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 21
mttttttttt ttttttttgc agccagcatg tcgacgt 37
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 22
mttttttttt ttttttttcg agctagactg ccgacgt 37
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 23
mttttttttt ttttttttgc agcctgattg ccgacgt 37
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 24
mttttttttt ttttttttgc agctagccgt acgacgt 37
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 25
mttttttttt ttttttttgc agctacggta ccgacgt 37
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 氨基修饰的探针
<400> 26
mttttttttt ttttttttgg gtgccatcag ggagca 36
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 生物素或荧光基团修饰的探针
<400> 27
nctcatcaac accgtctgat atattt 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 生物素或荧光基团修饰的探针
<400> 28
nctcatcaac accgtccgat atattt 26
Claims (4)
1.一种绵羊BMPR-1B基因A746G多态性检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要包含下列扩增液、至少1张基因芯片、杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ、预杂交液、Taq酶、杂交显色试剂；
所述的扩增液中的每种扩增液中分别包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP：
SP1：<210>1、SP2: <210>2、SP3: <210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6: <210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9: <210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12: <210>12、QP: <210>13；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的编码序列和3’端21nt的特异序列组成；
所述的基因芯片是将5’端带氨基修饰和16聚脱氧胸苷酸的捕获探针P1-P12分A、B二个反应区顺序固定于醛基修饰的载玻片上制成，所述P1-P12的序列如下：
P1:
<210>14、P2: <210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5: <210>18、P6: <210>19、P7: <210>20、P8: <210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11: <210>24、P12: <210>25；
以上捕获探针的序列与相对应的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的编码序列一致；
所述基因芯片的A、B两个反应区分别设有标志列探针，所述标志列探针序列为：<210>26；
所述的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中分别含有5’端带有生物素或荧光基团标记的识别探针a和b，所述的生物素或荧光基团用X表示，识别探针a和b的序列如下：
识别探针a：<210>27、识别探针b：<210>28。
2.一种绵羊BMPR-1B基因A746G多态性的检测方法，其特征在于主要包括以下步骤：
（1）制备多个绵羊的染色体DNA备用；
（2）试剂盒组装，其中主要包括：分别装有12种扩增液的扩增管，至少1张基因芯片，杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ，预杂交液、Taq酶，杂交显色试剂；
所述的12种扩增液的每种扩增液中分别包含以下系列下游引物SP1-SP12之一和公用上游引物QP：
SP1：<210>1、SP2: <210>2、SP3: <210>3、SP4: <210>4、SP5: <210>5、SP6: <210>6、SP7: <210>7、SP8: <210>8、SP9: <210>9、SP10: <210>10、SP11: <210>11、SP12: <210>12、QP: <210>13；
上述系列下游引物SP1-SP12均由5’端20nt的编码序列和3’端21nt的特异序列组成；
所述的基因芯片是将5’端带氨基修饰和16聚脱氧胸苷酸的捕获探针P1-P12分A、B二个反应区顺序固定于醛基修饰的载玻片上制成，所述P1-P12的序列如下：
P1:
<210>14、P2: <210>15、P3: <210>16、P4: <210>17、P5: <210>18、P6: <210>19、P7: <210>20、P8: <210>21、P9: <210>22、P10: <210>23、P11: <210>24、P12: <210>25；
以上捕获探针的序列与相对应的下游引物SP1-SP12的5’端20nt的编码序列一致；
所述基因芯片的A、B两个反应区分别设有标志列探针，所述标志列探针序列为：<210>26；
所述的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中分别含有5’端带有生物素或荧光基团标记的识别探针a和b，所述的生物素或荧光基团用X表示，识别探针a和b的序列如下：识别探针a：<210>27、识别探针b：<210>28；
（3）用PCR方法扩增：在试剂盒中每个扩增管中加入一个绵羊的染色体DNA作为扩增模板，用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增多个绵羊的BMPR-1B基因包含A746G的基因片段，得到PCR扩增产物；
（4）变性处理： 将所得到的各个扩增管的PCR扩增产物变性处理，之后分别取一定体积的变性后扩增产物，分别加入杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ中，混匀备用；
（5）预杂交及杂交：先将基因芯片与预杂交液进行预杂交、然后将上述备用的杂交缓冲液Ⅰ和Ⅱ分别与基因芯片的A和B反应区域的捕获探针P1-P12阵列杂交；
（6）杂交信号检测：进行显色处理后检测基因芯片A和B反应区域阵列的杂交信号。
3.如权利要求2所述的绵羊BMPR-1B基因A746G多态性的检测方法，其特征在于所述的用PCR方法扩增步骤中的退火温度设置为53℃。
4.如权利要求2或3所述的绵羊BMPR-1B基因A746G多态性的检测方法，其特征在于所述的杂交步骤中的杂交温度设置为46℃。
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