CN113293219B

CN113293219B - 蒙古羊繁殖力相关基因bmpr1b的分子标记的特异性引物及其应用

Info

Publication number: CN113293219B
Application number: CN202110752147.6A
Authority: CN
Inventors: 佟彬; 高圆圆; 高一杰; 曹子薇; 邵广龙; 朱勇; 何梅; 杨明涛
Original assignee: Xilin Gol Mengzhiyuan Animal Husbandry Co ltd; Inner Mongolia University
Current assignee: Xilin Gol Mengzhiyuan Animal Husbandry Co ltd; Inner Mongolia University
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2041-07-02
Also published as: CN113293219A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物及其应用。蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明设计特异性引物，检测蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处是否存在G→T的突变，确定蒙古羊个体在该位点的基因型，实现对BMPR1B基因c.1470G>T的单核苷酸多态性检测，以比较BMPR1B基因c.1470G>T在蒙古羊品种中的多态性。本发明利用BMPR1B基因c.1470G>T多态性辅助蒙古羊育种，提高蒙古羊的产羔数，可作为辅助提高蒙古羊多胎性状的有效方法。

Description

蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物及其应用。

背景技术

BMPR1B（bone morphogenetic protein receptor type 1B，BMPR1B）即骨形态发生蛋白1B受体，与BMP15基因和GDF9基因等同属于转化生长因子β（TGFβ）超家族成员。绵羊的BMPR1B基因位于6号染色体上，包含10个外显子，编码区长1509bp，编码502个氨基酸。

蒙古羊是中国数量最多、分布最广的粗毛绵羊品种，主要分布于内蒙古、东北、华北和西北等地。典型种群包括苏尼特羊、乌珠穆沁羊、呼伦贝尔羊、滩羊、巴音布鲁克羊、小尾寒羊、多浪羊和湖羊等中国短尾羊品种的共同祖先。

乌珠穆沁羊产于内蒙古锡林郭勒盟东部乌珠穆沁草原，主要分布在东乌珠穆沁旗、西乌珠穆沁旗等地区，其适于终年放牧饲养，具有增膘快、蓄积脂肪能力强、产肉率高、性成熟早等特性，适于利用牧草生长旺期，开展放牧育肥或有计划的肥羔生产。同时，乌珠穆沁羊也是做纯种繁育胚胎移植的良好受体羊，后代羔羊体质结实抗病能力强，适应性较好。乌珠穆沁羊系蒙古羊，经过当地的长期选育，已经形成了优良的种群，1992年经过国家农业部、国家标准总局的确认下，正式批准“乌珠穆沁羊”为当地优良品种。2000年，乌珠穆沁羊被农业部评定为国家级畜禽资源保护品种。

苏尼特羊产于内蒙古自治区锡林郭勒盟苏尼特左旗和苏尼特右旗，有戈壁羊之称。其主要饲养方式为纯天然牧场自然放牧，气候特点为春季干旱多风、夏季炎热、冬季寒冷，主要饲养植物种类有沙葱、多根葱、小型针茅草等多达477种。苏尼特羊有很强的适应能力，在终年放牧不补任何伺料的条件下都能很快抓膘，而且肌肉丰满，体格壮大，肉质细嫩，无膻味，口感好，有较高的产肉性能。苏尼特羊肉富含人体所需要的各种氨基酸、脂肪酸、矿物质、维生素等，且蛋白质含量高、脂肪含量低，因此在国内外非常受欢迎。1996年苏尼特羊被锡林郭勒盟技术监督局批准为地方良种，1997年被内蒙古自治区人民政府正式命名为苏尼特羊，在2010年被列入全国优良畜种名录，2015年被列入国家级畜禽遗传保护名录。

现有技术对FecB基因产羔效应进行了研究，一个拷贝的FecB增加排卵数为1.0～1.5，增加产羔数0.9～1.2，Booroola绵羊BB型母羊的平均排卵数4.65枚，显著高于对照组++型母羊的平均排卵数（1.62枚）。进一步研究结果表明，一个拷贝将增加1.26枚排卵和0.67只产羔，两个拷贝将增加3.61枚排卵和0.77只产羔。

Booroola绵羊BMPR1B基因高度保守的胞内激酶信号区域的碱基由A突变为G，这样所表达的249号氨基酸由谷氨酸变成了精氨酸，这个突变与Booroola母羊高繁殖力完全相关；而且，在不是起源Booroola品系的许多绵羊品种的个体中则没有发现该突变；原位杂交表明BMPR1B基因在绵羊卵巢的卵母细胞和颗粒细胞中特异性表达；在携带FecB突变的Booroola母羊中，BMPR1B基因部分失活导致了颗粒细胞的高级分化和排卵卵泡的高级成熟。

绵羊BMPR1B基因还存在另一个突变位点，其位于编码区第1113位，它的突变是由C变为A，但这个位点突变没有引起相应的氨基酸序列变化。BMPR1B基因作为Booroola绵羊基因的重要候选基因，其突变体在行为上和FecB基因表型完全一致，原因是BMPR1B基因突变增加了信号传导过程对受体下游的信号传导强度，最终导致卵泡早熟、排卵增加和Booroola羊多胎表型的出现。

以绵羊BMPR1B基因为候选基因，应用PCR-RFLP方法通过分析湖羊、夏洛来、陶赛特、萨福克、罗米丽、中国美利奴羊、中国美利奴肉用多胎品系以及陶赛特×中国美利奴羊和萨福克×中国美利奴羊杂交后代共615只个体的FecB基因多态性，以及BMPR1B基因多态性对产羔数、体尺和体重的影响。结果表明，基因在不同品种（系）绵羊中共有3种基因型（BB、B+和++），但基因型频率分布在各品种（系）间差异极显著（p<0.01）。在湖羊中仅有BB基因型；在中国美利奴肉用多胎品系中和BB、B+和++基因型频率分别为51％、30％和19％；而其他品种（系）羊中则仅有++基因型。对中国美利奴羊肉用多胎品系研究，发现BB和B+基因型群体平均产羔数分别为2.9和2.3，显著高于++基因型群体（1.2，p<0.01）。

用BMPR1B基因作为候选基因，对湖羊及其杂交后代进行了多胎机制的研究，实验结果表明，湖羊在BMPR1B基因的相应位置上发生了与Booroola羊相同的突变（A746G），该基因的BB基因型在湖羊群体内是占主体，而在其杂交后代中以B+型为主。

通过使用DNA分析发现我国湖羊和小尾寒羊存在多胎基因BMPR1B。东北半细毛羊、夏洛莱以及小尾寒羊杂种绵羊BMPR1B基因BB型群体的排卵数明显高于B+型、++型群体的排卵数（p<0.01）。

以BMPR1B基因为候选基因，采用PCR-SSCP技术检测在低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、萨福克羊）以及高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）中基因的单核苷酸多态性。结果表明：小尾寒羊和湖羊在BMPR1B基因编码区序列的第746号位点上有一个碱基A→G的突变，此处发生的突变与Booroola Merino绵羊突变是相同的，因而小尾寒羊和湖羊具有高的繁殖力，这个候选基因可以用于对绵羊产羔数的辅助选择，多赛特和萨福克绵羊则没有发生这种突变，所以具有较低的繁殖力。

在小尾寒羊、无角陶赛特羊和无角陶赛特羊╳小尾寒羊杂交一代三个母羊群体中，利用PCR-SSCP技术在三个群体共261只母羊的基因外显子区均发现突变编码区位处，该突变引起氨基酸序列由野生型的谷氨酸转变成精氨酸。通过对变异位点与绵羊产羔性状的关联分析，结果显示：BMPR1B基因型对产羔性状有明显效应（p<0.05），纯合突变型BB和杂合突变型AB比野生型母羊多产1.04和0.74羔。

检测小尾寒羊227只，多赛特羊40只母羊、萨福克羊37只BMPR1B基因，结果表明高繁殖力的小尾寒羊和湖羊在BMPR1B基因编码序列第位碱基处发生了与Booroola Merino绵羊相同的突变，而低繁殖力的多赛特和萨福克绵羊则没有发生这种突变。

检测海门山羊74个样本，黄淮山羊71个样本，波淮杂交二代山羊92个样本BMPR1B、BMP15和GDF9的3个基因6个位点（FecB、FecX^H、FecX^G、FecX^B、FecX^I和FecG^H），均没有发现多胎性。

研究策勒黑羊BMPR1B、ESR基因型与生殖激素水平的相关性研究。结果表明：BMPR1B和ESR基因上的突变没有影响母羊的雌二醇和孕酮的分泌水平。

以300只苏尼特羊为研究对象，利用PCR-RFLP技术结合DNA测序技术，分析BMPR1B基因中多个不同突变位点对苏尼特羊多胎性状的影响。结果表明：FecB位点与苏尼特羊的双羔率有关（p<0.001）。

因此，绵羊的多胎性状与FecB、BMPR1B、BMP15和GDF9等多个基因相关。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物。

本发明的再一目的在于提供上述特异性引物的应用。

本发明采用DNA测序技术检测蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处是否存在一个G→T的突变，通过确定蒙古羊个体在该位点的基因型，对BMPR1B基因c.1470G>T进行单核苷酸多态性检测，以比较BMPR1B基因c.1470G>T在蒙古羊品种中的多态性，判断c.1470G>T为与蒙古羊多胎性状相关的分子标记。

根据本发明的具体实施方式的蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物，所述引物序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-ACACTCTTCTACTATCAGCAA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-AAGGCAATCCCAAAATACCG-3’。

本发明的蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物可应用于检测蒙古羊多胎性状的试剂盒，或者应用于辅助蒙古羊育种中。

根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊繁殖力的方法，所述方法包括利用上述的特异性引物扩增蒙古羊基因组DNA的步骤。

具体的，根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊繁殖力的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）提取待测蒙古羊的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的蒙古羊的基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

（3）判断扩增产物中蒙古羊基因组中的BMPR1B基因第1470位核苷酸的基因型，选择BMPR1B基因编码区域第1470位为TT基因型的蒙古羊，作为育种的亲本。

所述蒙古羊基因组中的BMPR1B基因的c.1470G>T SNP的检测方法为：

利用PCR方法扩增蒙古羊BMPR1B基因的片段，并将扩增产物进行DNA测序；

若在蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现单峰且基因型为G，则此基因型为GG，

若在蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现套峰，则此基因型为GT，若在蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现单峰且基因型为T，则此基因型为TT。

该位点突变自所对应的氨基酸选自氨基酸序列第490位苏氨酸，当所述位点为G或T时，其对应氨基酸为均为苏氨酸；

TT基因型蒙古羊的平均产羔数高于GT基因型，基因型GT蒙古羊的平均产羔数高于GG型。

本发明中，蒙古羊的繁殖力具体体现为每胎生产的羊羔数。

根据本发明具体实施方式的高蒙古羊繁殖力的方法，步骤（2）PCR扩增时，扩增体系的总体积20μL，其中，上下游引物各1μL，模版1μL，预混液10μL，去离子水7μL。

根据本发明具体实施方式的高蒙古羊繁殖力的方法，步骤（2）PCR扩增程序为95℃预变性3min，99℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，然后进行测序。

本发明的有益效果：

本发明设计特异性引物，采用DNA测序技术检测蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处是否存在G→T的突变，确定蒙古羊个体在该位点的基因型，实现对BMPR1B基因c.1470G>T的单核苷酸多态性检测，以比较BMPR1B基因c.1470G>T位点在蒙古羊品种中的多态性。

数据统计结果表明，本发明的特异性引物能够检测该分子标记，从而可以用于辅助蒙古羊育种，提高蒙古羊的产羔数，本发明的方法可作为辅助提高蒙古羊多胎性状的有效方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明BMPR1B的c.1470G>T的PCR产物图；

图2为本发明BMPR1B的c.1470G>T的测序结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1建立检测蒙古羊多胎性状的分子标记的方法

1）模板材料准备

采集蒙古羊的血样并记录产羔数和胎次，所采集的蒙古羊来自于内蒙古锡林郭勒盟苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗，将血样保存在抗凝管中待用。

2）PCR产物测序。

随机抽取12只蒙古羊（连续产双羔母羊6只+连续单羔母羊6只）进行PCR产物测序，找到了位于BMPR1B基因编码区的SNP位点，即NC_040257.1:c.1470G>T。

3）引物设计

根据GeneBank报道的绵羊基因序列，本发明自行设计上下游引物F和R，通过比较筛选，最终获得引物序列如下：

F:5’-ACACTCTTCTACTATCAGCAA-3’；

R:5’-AAGGCAATCCCAAAATACCG-3’。

以从蒙古羊实验材料提取的基因组为模板，分别用上述引物进行扩增。

上下游引物的扩增体系一致，扩增体系的总体积20μL，其中，上下游引物各1μL，模版1μL，预混液10μL，去离子水7μL。

扩增产物经过95℃预变性3min，99℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，对扩增产物进行测序。

BMPR1B的c.1470G>T的PCR扩增结果见图1。

PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

Acactcttctactatcagcaaagccacctgcttgctcctgtcacaaggaagacatgaaaatttgtttaagtcctttaagatttgcatgagaaaggaatttttatggaattttatgcctacatgcttttaagactatcttttaaaagtacattcaaatttcagaaacccagaactagaagccagtatcgagtgccagccttgcagatcatacgttcctctcgtgtaagtccggttctccttttccttcctgcagtgtctcaggcagatggggaaactcatgacggaatgctgggctcacaatcctgcctcaagactgacagccctacgggttaagaaaacccttgccaaaatgtcagagtcccaggacattaagctctgaggcaagagtaagtgtctctggacaaagccagtagatatcctcctgtttgtgggcagagcaaaagatgttccagcagcatccaccgtcccagcctcgaacatcctcctgctccccagagggtgtattcttacatctcagggagcagcctggacaaacagaagtttccagaagcacggattcctcatgtctgtctgtaggcgggagaaactgcctgggtaatttgttcaagatatgatgcatgttgctttctaagaaagcccggtattttgggattgcctt

测序结果见图2，若在蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现单峰且基因型为G，则此基因型为GG，若在蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现套峰，则此基因型为GT，若在蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现单峰且基因型为T，则此基因型为TT。

实施例2统计分析BMPR1B基因型及其与蒙古羊群体多胎性状的关系

按照实施例1中所设计的引物对蒙古羊进行了基因检测，并计算了蒙古羊的基因型频率和等位基因频率，统计结果请参阅表1。

注：括号内是样本数。

表1蒙古羊的基因型频率和等位基因频率的统计结果图

结果如表1所示，蒙古羊的GG、GT和TT的基因型频率分别为0.428、0.412和0.160，G和T等位基因频率分别为0.634和0.366，G等位基因为优势等位基因。

对BMPR1B基因型及其与蒙古羊多胎性状进行关联性分析，具体实验如下：

（1）所选试验样本群体中的部分位点进行个体基因型分析，计算等位基因频率和基因型频率，进行χ²检验。

（2）根据试验结果计算该位点的基因频率与基因型频率，并对该位点基因型的分布进行Hardy-Weinberg平衡的卡方适合性检验。使用SPSS 19.0软件对蒙古羊群体多胎性状与基因型的关联性分析，其中统计模型包括基因型为固定效应和公羊为随机效应，构建混合线性模型（MLM）如下：

Y = µ + G + R + e

其中：Y为产羔数记录值；µ为群体平均值；G为基因型效应，R为公羊效应；e为随机残差效应。

不同基因型与蒙古羊产羔数的平均值及标准误见表2。

注：a，c:p<0.01。

表2不同基因型与蒙古羊产羔数的平均值及标准误统计结果图

结果如表2所示，TT基因型在产羔数上比GG基因型高0.31，这表明G等位基因突变为T等位基因对蒙古羊的产羔性状有一定的影响，且此位点的不同基因型在产羔数上差异达显著水平（p<0.01）。结果表明，可利用该位点的遗传多样性筛选提高蒙古羊多胎性状的种羊。

实施例3提高蒙古羊繁殖力的方法

本实施例的提高蒙古羊繁殖力的方法，法包括以下步骤：

（1）提取待测蒙古羊的基因组DNA；

（2）用特异性引物进行PCR扩增；

从蒙古羊实验材料提取的基因组为模板，用实施例1所述引物进行扩增，扩增体系的总体积20μL，其中，上下游引物各1μL，模版1μL，预混液10μL，去离子水7μL；

经过95℃预变性3min，99℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，测序；

（3）判断蒙古羊基因组中的BMPR1B基因第1470位核苷酸的基因型，

若蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现单峰且基因型为G，则此基因型为GG，若蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现套峰，则此基因型为GT，若蒙古羊基因组中的BMPR1B基因编码区域1470bp处出现单峰且基因型为T，则此基因型为TT；

选择BMPR1B基因编码区域第1470位为TT基因型的蒙古羊，作为育种的亲本。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 内蒙古大学

锡林郭勒盟蒙之原牧业有限公司

<120> 蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acactcttct actatcagca a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggcaatcc caaaataccg 20

<210> 3

<211> 658

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acactcttct actatcagca aagccacctg cttgctcctg tcacaaggaa gacatgaaaa 60

tttgtttaag tcctttaaga tttgcatgag aaaggaattt ttatggaatt ttatgcctac 120

atgcttttaa gactatcttt taaaagtaca ttcaaatttc agaaacccag aactagaagc 180

cagtatcgag tgccagcctt gcagatcata cgttcctctc gtgtaagtcc ggttctcctt 240

ttccttcctg cagtgtctca ggcagatggg gaaactcatg acggaatgct gggctcacaa 300

tcctgcctca agactgacag ccctacgggt taagaaaacc cttgccaaaa tgtcagagtc 360

ccaggacatt aagctctgag gcaagagtaa gtgtctctgg acaaagccag tagatatcct 420

cctgtttgtg ggcagagcaa aagatgttcc agcagcatcc accgtcccag cctcgaacat 480

cctcctgctc cccagagggt gtattcttac atctcaggga gcagcctgga caaacagaag 540

tttccagaag cacggattcc tcatgtctgt ctgtaggcgg gagaaactgc ctgggtaatt 600

tgttcaagat atgatgcatg ttgctttcta agaaagcccg gtattttggg attgcctt 658

Claims

1.蒙古羊繁殖力相关基因BMPR1B的分子标记的特异性引物在辅助蒙古羊多胎性状育种中的应用，其特征在于，所述特异性引物序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-ACACTCTTCTACTATCAGCAA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-AAGGCAATCCCAAAATACCG-3’。

2.提高蒙古羊多胎性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）提取待测蒙古羊的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的蒙古羊的基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物，其中，所述特异性引物序列如下：SEQ ID NO.1：5’-ACACTCTTCTACTATCAGCAA-3’；SEQ ID NO.2：5’-AAGGCAATCCCAAAATACCG-3’；

（3）判断扩增产物中蒙古羊基因组中的BMPR1B基因中c.1470G>T位点的基因型，选择BMPR1B基因编码区域第1470位为TT基因型的蒙古羊，作为育种的亲本。

3.根据权利要求2所述的提高蒙古羊多胎性状的方法，其特征在于，步骤（2）PCR扩增时，扩增体系的总体积20μL，其中，特异性引物各1μL，模版1μL，预混液10μL，去离子水7μL。

4.根据权利要求2所述的提高蒙古羊多胎性状的方法，其特征在于，步骤（2）的扩增程序：95℃预变性3min，99℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环，72℃延伸10min。