CN103333948A - 一种检测绵羊高繁殖力基因bmpr1b的分子诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绵羊高繁殖力基因BMPR1B突变位点A746G的基因型分析方法。采用等位基因特异PCR方法,设计两组特异引物(第一组为公共正向引物与野生型反向引物,第二组为公共正向引物和突变型反向引物)。如果只有第一组引物扩增出131bp的DNA片段,则所检测绵羊基因型为++;如果只有第二组引物扩增出131bp的DNA片段,则所检测绵羊基因型为BB;如果两组引物均扩增出131bp的DNA片段,则所检测绵羊基因型为B+。本发明避免了传统检测方法中限制性内切酶和DNA芯片的使用,PCR产物直接通过琼脂糖凝胶电泳分析获得基因型分析结果,是一种准确、简便、快速的绵羊高繁殖力基因BMPR1B的分子诊断方法。
Description
技术领域
本发明涉及绵羊高繁殖力基因BMPR1B突变位点A746G的基因型分析方法。本发明采用等位基因特异PCR(allele specific PCR, AS-PCR)的方法,该方法能够准确、快速、简便地检测BMPR1B基因突变位点A746G,包括根据突变位点设计特异引物和基因型的分析方法。
背景技术
绵羊繁殖力直接影响养羊生产的经济效益。绵羊属单胎哺乳类动物,但某些绵羊品种却具有稳定的多胎性能,如中国的湖羊、小尾寒羊以及国外的布鲁拉美利奴羊(Booroola Merino)、芬兰兰德瑞斯羊(Finnish Landrace)、罗曼诺夫羊(Romanov sheep)等品种。随着分子生物学技术的发展,一些高效的分子标记被应用于绵羊多胎性的研究,并产生了许多有效、快速的检测手段。其中PCR-RFLP、PCR-SSCP、AFLP以及利用四引物扩增受阻突变体系PCR等技术在绵羊高繁殖力候选基因的鉴定上得到了广泛的应用。
大量研究证明,BMPR1B基因具有促进排卵和增加产羔数的作用.。在绵羊BMPR1B基因的分子诊断方面,目前通常采用PCR-RFLP的方法,即通过PCR扩增包含多态位点的DNA片段,利用核酸限制性内切酶识别该突变位点的特点,通过PCR产物纯化、酶切获得基因型。同时,国内也有使用基因芯片检测BMPR1B基因A746G突变位点的专利申请(201110126709.2)。这两种方法需要使用核酸限制性内切酶或基因芯片等特殊材料,增加了检测成本和操作步骤。本发明利用AS-PCR方法,直接通过PCR扩增获得基因型,是一种快速、简便、高效的分子诊断方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确的检测绵羊高繁殖力BMPR1B基因的分子诊断方法。本方法从引物设计和优化PCR反应步骤着手,运用AS-PCR策略,避免了传统检测方法中限制性内切酶或基因芯片的使用,在PCR扩增后直接进行琼脂糖凝胶电泳分析,获得基因型结果。
本方法的工作原理:Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切核酸酶活性,在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少。针对已知突变位点设计适当的引物,可以通过PCR方法直接达到区分突变型与野生型基因的目的。本发明通过PCR扩增绵羊BMPR1B基因突变位点A746G在内的DNA片段,分别使用设计的两组特异引物(第一组为公共正向引物与野生型反向引物,第二组为公共正向引物和突变型反向引物)。电泳检测所得到的两组扩增产物,按照如下方法确定待测样品的基因型:如果只有第一组扩增产物检测出131bp目的条带,所述待测绵羊的基因型为++,即为野生型纯合体;如果只有第二组扩增产物检测出131bp目的条带,所述待测绵羊的基因型为BB,即为突变型纯合体;如果两组扩增产物均能检测出131bp目的条带,则所述待测绵羊的基因型为B+,即为杂合体。
具体实施方式 以下实施方案将对本发明做进一步的详细说明:
一、总DNA来自绵羊血液,其提取的方法如下:
(1) 向1.5mL离心管(EP管)中加入200 μL血样。加入500ul SNET(1% SDS,400 mM Nacl,5 mM EDTA,20 mM Tris-cl PH8.0),混匀。
(2) 向以上溶液中加入蛋白酶K至终浓度100ng/mL,混匀。
(3) 55℃孵育4h。
(4) 加入等体积的Tris-饱和酚,缓慢颠倒离心管数次,12000g 离心10min。
(5) 取水相于新的EP管中,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),震荡摇匀10min,12000g 离心10min。
(6) 取水相于新的EP管中,加入1/10体积的3M NaAc及 2.5倍体积的无水乙醇,摇匀,-20℃静置30min,12000g 离心10min。
(7) 去水相,干燥后用适量的超纯水溶解,获得DNA提取液用于下一步的PCR扩增。
二、AS-PCR分析
1、 引物设计:
使用Primer premier version 5设计引物,引物如下:
公共正向引物: 5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3';
突变型反向引物(突变型G):5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCC-3';
野生型反向引物(野生型A):5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCT-3'。
扩增片段长度为131bp。
2、PCR反应体系(15ul):
反应成分 | 加入量(μl) |
ddH2O μl | 11.1 |
10x PCR buffer | 1.5 |
dNTP (10 mM) | 0.5 |
正向引物(10 mM) | 0.4 |
反向引物primer (10 mM) | 0.4 |
Taq DNA Polymerase(5 U/μl) | 0.1 |
DNA template | 1 |
3、反应条件:95℃预变性5分钟;循环条件(95℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒),35个循环;72℃延伸7分钟;4℃保存。
三、基因型分析
PCR扩增后,PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图1所示。图1中5个样本分别为野生型引物和突变型引物扩增后的电泳结果。
附图说明 图1为绵羊高繁殖力基因BMPR1B A746G位点的AS-PCR基因型检测结果,1w-5w:公共正向引物与野生型反向引物的检测结果,1m-5m:公共正向引物与突变型反向引物的检测结果; M:DM0601 DNA ladder marker。AS-PCR结果表明样品1基因型为B+,样品2和3基因型为BB,样品4和5基因型为++。
综上所述,本发明是一种能够节约成本、缩短检测时间、操作简便、结果可靠的绵羊高繁殖力基因的分子诊断方法。
SEQUENCE LISTING
<110> 赵兴波,陈晓勇,敦伟涛
<120> 一种检测绵羊高繁殖力基因BMPR1B的分子诊断方法
<130> 2012
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 绵羊
<400> 1
gtcgctatgg ggaagtttgg atg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 绵羊
<400> 2
ttcatgcctc atcaacaccg tct 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 绵羊
<400> 3
ttcatgcctc atcaacaccg tcc 23
Claims (3)
1.一种检测绵羊高繁殖力基因BMPR1B的分子诊断方法,PCR扩增包括已知绵羊BMPR1B基因突变位点A746G在内的DNA片段,分别使用设计的两组特异引物,第一组包括公共正向引物和野生型反向引物,第二组包括公共正向引物和突变型反向引物。
2.如权利要求书1所述的绵羊高繁殖力基因BMPR1B分子诊断的方法,其特征在于:以所述待测绵羊的基因组为模板,用设计的两对引物分别进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测所得到的两组PCR产物,按照如下方法确定待测绵羊BMPR1B基因A746G突变位点的基因型:如果只有第一组引物(公共正向引物和野生型反向引物)能够扩增出131bp特异片段,所述待测绵羊的基因型为++,即为野生型纯合体;如果只有第二组引物(公共正向引物和突变型反向引物)能够扩增出131bp特异片段,所述待测绵羊的基因型为BB,即为突变型纯合体;如果两组引物均能扩增出131bp的特异片段,所述待测绵羊的基因型为B+,即为杂合体。
3.绵羊BMPR1B突变位点A746G设计特异引物,根据权利要求书2所述,具体如下:
公共正向引物: 5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3';
突变型反向引物(突变型G):5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCC-3';
野生型反向引物(野生型A):5'-TTCATGCCTCATCAACACCGTCT-3'。
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