CN104046701A - 一种兔病毒性出血症病毒rt-lamp检测方法 - Google Patents

一种兔病毒性出血症病毒rt-lamp检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，根据RT-PCR法扩增测序的基因序列，运用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V4 software针对目的序列的6个不同位点，设计了4条特异性引物和1条环引物，通过反应条件优化、敏感性试验和特异性试验，初步建立了RHDV的RT-LAMP检测法，并进行临床检样初步应用。试验结果显示：该法可以扩增出183bp以上的一个梯状条带产物，可以检测到25copies的目的基因，对兔大肠杆菌、兔巴氏杆菌和实验室构建的欧洲野兔综合症病毒蛋白VP60基因重组质粒pGM-T-EBHSV的扩增均为阴性，有着比RT-PCR法更高的敏感性，在临床检测中该法阳性检出率与RT-PCR法检测结果相符合。

Description

一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法。
背景技术
兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)，又称兔瘟，由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起，它以全身广泛出血、淤血为主要特征，有着极高的发病率和死亡率，是一种传染性极强的致死性疾病，严重危害养兔业的健康发展。由于灭活疫苗的使用该病基本得到了控制，临床实践仍有疑似病例发生。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)，是由Notomi T等在2000年研发出来一类新型的核酸扩增检测方法，其核心包括一种能够识别和进行链置换的DNA聚合酶(BstDNA polymerase)与位于靶基因上的6个区域识别的4条特异引物。核酸扩增反应在恒温条件(65℃左右)几十分钟后即可完成。结果读判方便，可以通过裸眼观察白色混浊沉淀的产生、加入荧光染料颜色的改变和电泳检测，无需特殊仪器，反应特异性和敏感性高，在疾病病原的实验室和基层检测和诊断中有着广泛的应用前景。
现有检测技术中的主要缺陷：广泛用于RHDV实验室检测主要方法技术有RT-PCR、荧光RT-PCR等技术，这些技术都需要专用的PCR仪、荧光PCR仪等特殊仪器设备，反应时间较长，限制了在基层和普通实验室检测工作的开展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，为了建立用于RHDV临床诊断可靠、快速的检测技术，根据收集的RHDV的基因序列设计引物，对快速检测RHDV的RT-LAMP方法进行了研究，提供一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，根据RT-PCR法扩增测序的基因序列，运用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V4 software针对目的序列的6个不同位点，设计了4条特异性引物和1条环引物，通过反应条件优化、敏感性试验和特异性试验，初步建立了RHDV的RT-LAMP检测法，并进行临床检样初步应用。试验结果显示：该法可以扩增出183bp以上的一个梯状条带产物，可以检测到25copies的目的基因，对兔大肠杆菌、兔巴氏杆菌和实验室构建的欧洲野兔综合症病毒蛋白VP60基因重组质粒pGM-T-EBHSV的扩增均为阴性，有着比RT-PCR法更高的敏感性，在临床检测中该法阳性检出率与RT-PCR法检测结果相符合。其具体技术方案为：
一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，包括以下步骤：
(1)引物设计
设计4条特异性引物和1条环扩增引物，并对各引物进行稀释，于-20℃保存，所述引物具体为：
F3其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
B3其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
FiP其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
BiP其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
FLP其核苷酸序列如SEQ ID NO；5所示；
(2)目的检测基因(模板)的制备
以提取的RHDV基因组RNA为模板，按照PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit说明书的操作合成cDNA和PCR扩增；然后进行产物与pMD19-T的连接；并将连接产物转入感受态细胞DH5a、挑菌、克隆，按照质粒抽提试剂盒操作提取质粒，并对质粒进行鉴定；
(2.1)RHDV目的基因片段的克隆
(2.1.1)RHDV总RNA的提取
参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书进行提取；
(2.1.2)cDNA的合成(RT)
按照PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit说明书加入反应体系(10μL)，5×Primerscriptbuffer 2μL，RNase-free ddH2O 2.0μL，Random6mers(100μM)2μL，Oligo dTPrimer(50μM)0.5μL，Primerscript RT Enzyme Mix 0.5μL，Total RNA(2.1.1提取)3μL，37℃，15min；85℃ 5s，RT产物保存于-20℃备用；
(2.1.3)目的基因片段PCR扩增
按下面反应体系加样后进行混匀，置PCR仪中按照设计的反应程序进行PCR扩增；
(2.1.3.1)体系：(20μL)
PCR PreMixture(2×)10μL，P1(GTGGAACGGCCAAATA)1μL，P2(GGACTGTACAGTAAGC)1μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 6μL；
(2.1.3.2)程序：
95℃预变性5min；94℃ 50s，58℃ 50s，72℃ 55s，35cycles；72℃总延伸10min，16℃保存；
反应结束后，取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察核酸片段；
(2.2)目的片段的纯化回收
按柱式DNA胶回收试剂盒，使用试剂盒说明书进行操作，提取的纯化DNA溶液，可立即用于后续实验或者-20℃保存备用；
(2.3)目的片段的连接转化
按照pMD19-T Vector kit说明书进行回收目的基因片段的连接、转化、挑菌扩大培养。
(2.4)RHDV目的基因片段的鉴定
(2.4.1)质粒提取
按质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit的说明书进行重组质粒的抽提操作，操作步骤略；
(2.4.2)鉴定重组质粒
1)电泳鉴定
重组质粒和空载体(pMD19-T Vector)各取3μL进行电泳鉴定；并对条带大的质粒样品进行PCR扩增；
2)PCR鉴定
以选择条带大的质粒为模板，进行PCR，并对扩增产物进行电泳鉴定；
3)测序鉴定
对鉴定为阳性的DH5α菌液样品进行测序鉴定，并对结果进行比对分析，确定扩增得到的序列是否为RHDV的目的基因片段；
(2.5)重组质粒RHDV-pMD19-T的提取
按质粒抽提试剂盒的说明书进行鉴定阳性的重组质粒的抽提操作，-20℃保存备用；
(3)基础RT-LAMP反应
以步骤(2.2)中制备的cDNA作为模板，用设计的步骤(1)中的引物按下面反应体系加样后混匀，于恒温振荡箱65℃反应60min；
(3.1)反应体系(25μL)：
(3.2)结果读判：
1)核酸凝胶电泳：
反应结束后，取3μL反应产物进行1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳，观察产物条带；
2)根据反应混合物中生产白色沉淀的变化进行判断；
3)在反应管中加入Supper SYBR(100×)1μL，在紫外照射条件下观察颜色的变化；
(4)RHDV RT-LAMP扩增产物酶切鉴定
按照QuickCutTM XbaI说明书进行酶切鉴定，反应体系(40μL)如下：
轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温2h；取4μL酶切产物进行1.5％-2％核酸凝胶电泳分析。
(3)RT-LAMP反应条件确立
分别进行反应Mg2+量、Betaine量、各应物浓度、反应时间和反应温度的确定。
经过优化，最终确立RHDV基因组RNA的提取按照常规方法进行，按照PrimeScriptTMRT-PCR reagent Kit说明书的操作进行RT反应合成cDNA，LAMP的反应温度与时间为：63℃，60min，LAMP体系中Mg2+量为3μL，dNTP量为6μL，Betaine量确定为2μL，Zloop浓度确定为25μmol/L，F3/B3浓度确定为5μmol/L；FIP/BIP浓度确定为50μmol/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明根据测序的高度保守RHDV VP60的基因序列通过在线LAMP引物的软件PrimerExplorer V4 software(https://primerexplorer.jp/e/)设计引物，本发明在设计引物时发现VP60基因在不同毒株还是存在着一定的变异，影响着LAMP引物的设计我们对LAMP软件参数进行了改变，最后经过筛选处理后选出F3、B3、FIP、BIP4条特异性引物和一条环形引物Zloop，极大的缩短了扩增反应时间，提高了扩增效率，保证了引物的特异性。
本发明对LAMP法的反应体系进行优化，并通过敏感试验和特异性试验对建立的RHDV的RT-LAMP检测法进行了检验，试验显示：本发明建立的RHDV的RT-LAMP检测法，具有良好的灵敏性，可以检测到25copy的目的基因，其灵敏度比RT-PCR的灵敏度高10倍，对重组质粒pGM-T-EBHSV、兔巴氏杆菌菌液、兔大肠杆菌菌液、兔葡萄球菌菌液的RT-LAMP扩增为阴性，而RHDV的RT-LAMP为阳性，该法可以对RHDV特异性检测。在疑似样品的初步检测中，RT-LAMP法与RT-PCR法的阳性检出率结果完全相符，表明所建立的RT-LAMP法有着良好的特异性和敏感性，为RHDV的检测和诊断提供了一种可靠的技术工具。国内也有相关RHDVRT-LAMP检测的相关报道，与之相比本发明除了对常见兔病原的特异性检测外，还对与RHDV同属的EBHSV的VP60相应基因片段进行了检测。值得一提的是RT-LAMP法只需要一个一般的恒温水浴锅在45min左右就可以完成扩增反应，其检测结果可以直接通过肉眼观察加入Supper SYBR(SYBR GreenI)后在紫外灯照射下的颜色变化或者产物混合物的浑浊度判定结果，因此更适合在基层应用快速诊断RHDV，为RHDV的防控提供了新的检测技术。
附图说明
图1是RHDV毒株的RT-PCR检测结果，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：阴性对照(双蒸水模板)；2：RHDV；
图2是重组载体电泳鉴定结果，M：核酸分子M标准(DL2000)；1：pMD19-T载体；2：RHDV-pMD19-T；
图3是重组质粒PCR鉴定结果，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：pMD19-T PCR产物；
图4是RHDV RT-LAMP基础反应结果，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：RHDV扩增结果；2：对阴性(ddH2O)扩增照；
图5是RHDV RT-LAMP检测结果的浑浊度变化，1：RHDV；2：阴性对照(双蒸水模板)；
图6是RHDV RT-LAMP检测结果的颜色变化，1：RHDV；2；阴性对照(双蒸水模板)；
图7是RT-LAMP扩增产物的酶切鉴定，M；核酸分子量标准(DL2000)；1：RHDVRT-LAMP产物；2：RT-LAMP产物QuickCut XbaI酶切结果；
图8是RT-LAMP反应温度优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：65℃；2：64℃；3：63℃；4：62℃；5：61℃；
图9是RT-LAMP反应时间优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：90min；2：75min；3：60min；4：45min；5：30min；
图10是RT-LAMP Mg2+量的优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：6μL；2：5μL；3：4μL；4：3μL；5：2μL；6：1μL；7：0μL；
图11是RT-LAMP dNTP量的优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：10μL；2：8μL；3：6μL；4：4μL；5：2μL；6：0μL；
图12是RT-LAMP Betaine量的优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：5μL；2：4μL；3：3μL；4：2μL；5：1μL；6：0μL；
图13是RT-LAMP环引物浓度的优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：40μmol/L；2：35μmol/L；3：30μmol/L；4：25μmol/L；5：20μmol/L；6：15μmol/L；7：0μmol/L；
图14是RT-LAMP外引物浓度的优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：15μmol/L；2：12.5μmol/L；3：10μmol/L；4：7.5μmol/L；5：、5μmol/L；6：2.5μmo1/L；7：0μmol/L；
图15是RT-LAMP内引物浓度的优化，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：60μmol/L；2：50μmol/L；3：40μmol/L；4：30μmol/L；5：20μmol/L；6：10μmol/L；7：0μmol/L；
图16是RHDV RT-LAMP敏感性试验结果，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：2.5拷贝；2：2.5×101拷贝；3：2.5×102拷贝；4：2.5×103拷贝；5：2.5×104拷贝；6：2.5×105拷贝；7：2.5×106拷贝；8：2.5×107拷贝；9：2.5×108拷贝；10：2.5×109拷贝；
图17是RHDV RT-LAMP特异性试验结果，M：核酸分子量标准(DL2000)；1：阳性对照；2：阴性对照；3：RHDV；4：重组质粒pGM-T-EBHSV；5：兔巴氏杆菌；6：兔大肠杆菌。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
(1)引物设计
根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公布的40多株RHDV VP60基因(登录号AF453761.1、KF537693.1等)、EBHSV VP60基因和本研究第一章的测序结果，运用Premier5.0和DNAstar等软件分析，将选取VP60的保守基因片段使用Primer Explorer V4 software(https://primerexplorer.jp/e/)，设计4条特异性引物和1条环扩增引物。送上海英潍捷基贸易有限公司合成。并对各引物进行稀释，于-20℃保存。
表1.RHDV LAMP引物
Table3-1.The LAMP primers for RHDV detection
(2)目的检测基因(模板)的制备
以提取的RHDV基因组RNA为模板，按照PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit说明书的操作合成cDNA和PCR扩增；然后进行产物与pMD19-T的连接；并将连接产物转入感受态细胞DH5a、挑菌、克隆，按照质粒抽提试剂盒操作提取质粒，并对质粒进行鉴定；
(2.1)RHDV目的基因片段的克隆
(2.1.1)RHDV总RNA的提取
参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书进行提取；
(2.1.2)cDNA的合成(RT)
按照PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit说明书加入反应体系(10μL)，5×Primerscriptbuffer 2μL，RNase-free ddH2O 2.0μL，Random6mers(100μM)2μL，Oligo dTPrimer(50μM)0.5μL，Primerscript RT Enzyme Mix 0.5μL，Total RNA(2.1.1提取)3μL，37℃，15min；85℃ 5s，RT产物保存于-20℃备用；
(2.1.3)目的基因片段PCR扩增
按下面反应体系加样后进行混匀，置PCR仪中按照设计的反应程序进行PCR扩增；
(2.1.3.1)体系：(20μL)
PCR PreMixture(2×)10μL，P1(GTGGAACGGCCAAATA)1μL，P2(GGACTGTACAGTAAGC)1μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 6μL；
(2.1.3.2)程序：
95℃预变性5min；94℃ 50s，58℃ 50s，72℃ 55s，35cycles；72℃总延伸10min，16℃保存；
反应结束后，取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察核酸片段；
(2.2)目的片段的纯化回收
按柱式DNA胶回收试剂盒，使用试剂盒说明书进行操作，提取的纯化DNA溶液，可立即用于后续实验或者-20℃保存备用；
(2.3)目的片段的连接转化
按照pMD19-T Vector kit说明书进行回收目的基因片段的连接、转化、挑菌扩大培养。
(2.4)RHDV目的基因片段的鉴定
(2.4.1)质粒提取
按质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit的说明书进行重组质粒的抽提操作，操作步骤略；
(2.4.2)鉴定重组质粒
1)电泳鉴定
重组质粒和空载体(pMD19-T Vector)各取3μL进行电泳鉴定；并对条带大的质粒样品进行PCR扩增；
2)PCR鉴定
以选择条带大的质粒为模板，进行PCR，并对扩增产物进行电泳鉴定；
3)测序鉴定
对鉴定为阳性的DH5α菌液样品进行测序鉴定，并对结果进行比对分析，确定扩增得到的序列是否为RHDV的目的基因片段；
(2.5)重组质粒RHDV-pMD19-T的提取
按质粒抽提试剂盒的说明书进行鉴定阳性的重组质粒的抽提操作，-20℃保存备用；
(3)基础RT-LAMP反应
以步骤(2.2)中制备的cDNA作为模板，用设计的步骤(1)中的引物按下面反应体系加样后混匀，于恒温振荡箱65℃反应60min；
(3.1)反应体系(25μL)：
(3.2)结果读判：
1)核酸凝胶电泳：
反应结束后，取3μL反应产物进行1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳，观察产物条带；
2)根据反应混合物中生产白色沉淀的变化进行判断；
3)在反应管中加入Supper SYBR(100×)1μL，在紫外照射条件下观察颜色的变化；
(4)RHDV RT-LAMP扩增产物酶切鉴定
按照QuickCutTM XbaI说明书进行酶切鉴定，反应体系(40μL)如下：
轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温2h；取4μL酶切产物进行1.5％-2％核酸凝胶电泳分析。
优化RT-LAMP的反应条件
1优化RT-LAMP的反应时间与温度
以步骤(2.5)中提取的阳性重组质粒RHDV-pMD19-T为模板，进行反应温度的梯度优化试验(反应温度分别为65℃、64℃、63℃、62℃、61℃)；按照确定的反应温度进行反应时间(90min，75min，60min，45min，30min)的确定。
2优化RT-LAMP的Mg2+、dNTP和Betaine量
以步骤(2.7)中提取的阳性重组质粒RHDV-pMD19-T为模板，按照确定的反应温度和时间进行Mg2+(25mM)0μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL)加入量的筛选；按照确定的反应温度、时间和Mg2+量进行dNTP(2.5mM)0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL)加入量的筛选；按照确定的反应温度、时间、Mg2+量和dNTP量进行Betaine(8mM)0μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL)加入量的筛选。
3优化RT-LAMP的引物浓度
以步骤(2.7)中提取的阳性重组质粒RHDV-pMD19-T为模板，按照3.2.5.1和3.2.5.2已经确定的条件进行引物浓度的优化：Zloop(40μmol/L、35μmol/L、30μmol/L、25μmol/L、20μmol/L、15μmol/L、0μmol/L)；F3/B3(15μmol/L、12.5μmol/L、10μmol/L、7.5μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、0μmol/L)；FIP/BIP(60μmol/L、50μmol/L、40μmol/L、30μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、0μmol/L)。
RT-LAMP敏感性试验
按照确定的反应温度和反应时间，将已经测量的RHDV DNA样品为模板定量，然后10倍梯度稀释，分别作为模板，进行LAMP反应的敏感性检测。反应结束后，分别取5μL扩增产物进行电泳鉴定，并与第二章RT-PCR的敏感性实验进行对比，同时确定检测的目的基因的敏感限度。
RT-LAMP特异性试验
1常见病原模板的制备
按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌的DNA基因组，具体操作步骤略。
LAMP的扩增
以3.2.7.1提取的病原的DNA或cDAN为模板，按照3.2.5步确定的反应条件和反应时间，进行LAMP反应的的特异性检测，反应结束后分别对扩增产物进行电泳鉴定、浑浊度观察和加入染料后在紫外灯下的颜色观察。
结果与分析
1RHDV目的基因片段扩增结果
分别以ddH2O和2提取的RNA为模板，按操作进行RT-PCR，结果如图1所示，泳道2在约257bp扩增出特异性条带产物；ddH2O阴性对照(泳道1)无任何扩增。
2RHDV目的基因片段的鉴定
将扩增产物按照操作进行特异性目的扩增产物的纯化回收、连接转化、挑菌摇菌后提取重组质粒，PCR扩增，电泳鉴定，结果见图2和图3。由图2可知，RHDV重组质粒(泳道2)迁移速度较空载体(泳道1)慢，由图3可知泳动速度慢的重组质粒的普通PCR鉴定扩增出257bp左右的特异性条带(泳道2)，而泳动速度快的空载体的普通PCR鉴定结果为阴性(泳道1)。
将PCR鉴定阳性的重组质粒送北京华大基因科技服务有限公司进行序列测定，结果如下(粗线部分为目的基因的序列，部分为引物P1和P2的位置)：
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATT AATCTCTAG
将测序结果提交NCBI中进行同源性分析，结果扩增的基因序列与公布的KF537693.1等序列同源性达99％，这表明RHDV目的基因片段的成功克隆。重组阳性质粒于-20℃冰箱冻存备用。
3RHDV RT-LAMP反应扩增
以制备的cDNA作为模板，按照合成的引物进行RT-LAMP扩增。反应结束后取反应产物分别扩增产物进行电泳鉴定、浑浊度观察和加入染料后在紫外灯下的颜色观察。
电泳结果如图4所示，泳道1扩增产物为约183bp的特异性梯状条带，阴性对照(泳道2)无特异性扩增；浑浊度观察结果如图5所示，管1有肉眼可见的明显白色沉淀；加入染料Supper SYBR(100×)后在紫外照射条件下管1呈现出绿色荧光，而阴性对照管2呈现出淡红色，结果见图6。
4RHDV RT-LAMP扩增产物的酶切鉴定
按照操作取RT-LAMP扩增产物进行进行酶切鉴定，37℃酶切2h，取4μL酶切产物进行1.5％核酸凝胶电泳，结果见图7。由图7可知，RHDV扩增产物电泳后呈现梯状条带(泳道1)，而RHDV扩增产物经过QuickCut XbaI特异性酶切后，产生两条100-250bp大小的特异性条带(泳道2)。
RHDV RT-LAMP反应条件的优化
1RT-LAMP反应时间与温度的优化
按照操作步骤，以提取的重组质粒RHDV-pMD19-T为模板，进行RT-LAMP温度优化，结果见图8：除了61℃，其他反应温度都有梯度扩增条带，其中62℃、63℃温度条件下扩增产物条带梯度更清晰(泳道4和3)，便于观察，为保证反应的特异性将反应温度确定为63℃；以63℃为反应温度分别进行五个反应时间的扩增，结果见图9，反应时间为90min、75min、60min时反应扩增产物亮度差别不大，扩增结果也比较好，为了缩短反应时间，最终将反应时间确定为60min，温度与时间确定为：63℃，60min。
2RT-LAMP反应Mg2+、dNTP和Betaine的优化
按照操作步骤确定的条件，以提取的重组质粒RHDV-pMD19-T为模板，对Mg2+、dNTP和Betaine的量进行优化。
Mg2+量(25mM)的优化：设计(0μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL)七个不同的Mg2+量，分别进行RT-LAMP，结果见图10：Mg2+量在6μL至3μL时均有特异性梯状扩增条带且扩增产物亮度差异不大(泳道1、2、3和4)，在保证不影响试验的条件下，考虑节约试剂和扩增特异性将Mg2+量确定为3μL；
dNTP量(2.5mM)的优化：以3μL为Mg2+量分别进行0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL不同dNTP量的扩增，结果见图11：dNTP量在4μL至10μL时都有特异性扩增，其中dNTP量在6μL、8μL、10μL时扩增条带更亮(泳道1、2、3)，扩增效果较好，在保证试验结果准确的条件下考虑到节约试剂将dNTP量确定为6μL；
Betaine量(8mM)的优化：以3μL为Mg2+量和6μL为dNTP量分别进行0μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL不同Betaine量的扩增，结果见图12：Betaine量在5μL到0μL时均有特异性梯状扩增条带，但0μL、1μL Betaine量条件下扩增条带梯度短、模糊，2μL、3μL、4μL、5μL条件下扩增产物梯度长、清晰(泳道1、2、3、4)，扩增效果更好，Betaine量确定为2μL。
3RT-LAMP反应引物浓度的优化
按照操作步骤和确定的条件，以提取的重组质粒RHDV-pMD19-T为模板，设计不同的浓度对引物浓度进行优化。
环引物优化：分别以40μmol/L、35μmol/L、30μmol/L、25μmol/L、20μmol/L、15μmol/L、0μmol/L七个不用的Zloop浓度进行RT-LAMP，结果见图13：Zloop浓度在七个浓度下均有特异性梯状扩增条带，其中40μmol/L、35μmol/L、30μmol/L、25μmol/L Zloop浓度条件下扩增条带梯度更长(泳道1、2、3)，扩增效果更好，在保证试验结果准确的条件下考虑到节约试剂将Zloop浓度确定为25μmol/L；
外引物优化：分别以15μmol/L、12.5μmol/L、10μmol/L、7.5μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、0μmol/L七个不同的F3/B3浓度进行RT-LAMP，结果见图14：F3/B3浓度在0μmol/L时无明显扩增条带，在15μmol/L至2.5μmol/L时均有特异性梯状扩增条带，其中7.5μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L浓度时扩增产物更亮、更长(泳道4、5、6)，扩增效果更好，在保证试验结果准确的条件下考虑到节约试剂将F3/B3浓度确定为5μmol/L；
内引物优化：分别对七个不同的FIP/BIP浓度进行RT-LAMP，结果见图15：FIP/BIP浓度在60μmol/L至10μmol/L时均有特异性梯状扩增条带，其中60μmol/L、50μmol/L浓度下扩增产物更亮(泳道1、2、3)，扩增效果更好，考虑到节约试剂和减少二聚体的生成将FIP/BIP浓度确定为50μmol/L；
RHDV RT-LAMP敏感性试验结果
按照已经测量的RHDV DNA样品为模板定量，然后10倍梯度稀释，分别作为模板，采用3.3.4确定的反应条件进行敏感性试验，同时与第二章建立的RT-PCR检测结果对比。结果见图16，泳道2到泳道10都有明显扩增条带，通过换算得RT-LAMP检测敏感度为25copy目的基因，对比第二章RT-PCR检测敏感度250copy，RT-LAMP法灵敏度更好。
RHDV RT-LAMP特异性试验结果
以提取的兔巴氏杆菌和兔大肠杆菌的基因组DNA、重组质粒pGM-T-EBHSV以及RHDV采用确定的反应条件进行特异性试验，结果见图17，阳性对照和RHDV都有特异性条带为阳性，而阴性对照、重组质粒pGM-T-EBHSV、兔巴氏杆菌和兔大肠杆菌均无扩增条带为阴性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)引物设计
设计4条特异性引物和1条环扩增引物，并对各引物进行稀释，于-20℃保存，所述引物具体为：F3其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
B3其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
FiP其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
BiP其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
FLP其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
(2)目的检测基因模板的制备
以提取的RHDV基因组RNA为模板，按照PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit说明书的操作合成cDNA和PCR扩增；然后进行产物与pMD19-T的连接；并将连接产物转入感受态细胞DH5a、挑菌、克隆，按照质粒抽提试剂盒操作提取质粒，并对质粒进行鉴定；
(2.1)RHDV目的基因片段的克隆
(2.1.1)RHDV总RNA的提取
参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书进行提取；
(2.1.2)cDNA的合成
按照PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit说明书加入反应体系(10μL)，5×Primerscriptbuffer 2μL，RNase-free ddH2O 2.0μL，Random6mers(100μM)2μL，Oligo dTPrimer(50μM)0.5μL，Primerscript RT Enzyme Mix 0.5μL，Total RNA(2.1.1提取)3μL，37℃，15min；85℃5s，RT产物保存于-20℃备用；
(2.1.3)目的基因片段PCR扩增
按下面反应体系加样后进行混匀，置PCR仪中按照设计的反应程序进行PCR扩增；
(2.1.3.1)体系：(20μL)
PCR PreMixture(2×)10μL，P1：GTGGAACGGCCAAATA1μL，P2：GGACTGTACAGTAAGC1μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 6μL；
(2.1.3.2)程序：
95℃预变性5min；94℃ 50s，58℃ 50s，72℃ 55s，35cycles；72℃总延伸10min，16℃保存；
反应结束后，取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察核酸片段；
(2.2)目的片段的纯化回收
按柱式DNA胶回收试剂盒，使用试剂盒说明书进行操作，提取的纯化DNA溶液，可立即用于后续实验或者-20℃保存备用；
(2.3)目的片段的连接转化
按照pMD19-T Vector kit说明书进行回收目的基因片段的连接、转化、挑菌扩大培养；
(2.4)RHDV目的基因片段的鉴定
(2.4.1)质粒提取
按质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit的说明书进行重组质粒的抽提操作，操作步骤略；
(2.4.2)鉴定重组质粒
1)电泳鉴定
重组质粒和空载体(pMD19-T Vector)各取3μL进行电泳鉴定；并对条带大的质粒样品进行PCR扩增；
2)PCR鉴定
以选择条带大的质粒为模板，进行PCR，并对扩增产物进行电泳鉴定；
3)测序鉴定
对鉴定为阳性的DH5α菌液样品进行测序鉴定，并对结果进行比对分析，确定扩增得到的序列是否为RHDV的目的基因片段；
(2.5)重组质粒RHDV-pMD19-T的提取
按质粒抽提试剂盒的说明书进行鉴定阳性的重组质粒的抽提操作，-20℃保存备用；
(3)基础RT-LAMP反应
以步骤(2.2)中制备的cDNA作为模板，用设计的步骤(1)中的引物按下面反应体系加样后混匀，于恒温振荡箱65℃反应60min；
(3.1)反应体系25μL
(3.2)结果读判：
1)核酸凝胶电泳：
反应结束后，取3μL反应产物进行1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳，观察产物条带；
2)根据反应混合物中生产白色沉淀的变化进行判断；
3)在反应管中加入Supper SYBR(100×)1μL，在紫外照射条件下观察颜色的变化；
(4)RHDV RT-LAMP扩增产物酶切鉴定
按照QuickCutTM XbaI说明书进行酶切鉴定，反应体系40μL如下：
轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温2h；取4μL酶切产物进行1.5％-2％核酸凝胶电泳分析。
2.根据权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述步骤(2.5)中，反应温度与时间为：63℃，60min，Mg2+量为3μL，dNTP量为6μL，，Betaine量确定为2μL，Zloop浓度确定为25μmol/L，F3/B3浓度确定为5μmol/L；FIP/BIP浓度确定为50μmol/L。
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