CN116676429A - 用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的lamp引物组及方法 - Google Patents

用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的lamp引物组及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的LAMP引物组及方法。本发明的LAMP引物组包括一对外引物F3和B3和一对内引物FIP和BIP，利用该引物组制备的荧光可视化快速检测试剂盒可实现对穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的高灵敏度和高特异性检测，且最低检测限可达到1.76×100 copies/μL，不与穿山甲其它相关病毒反应；同时操作简便，成本较低，设备适用范围广，更易于操作人员临床现场的快速检测，用于及时防治，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

Description

用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的LAMP引物组及 方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的LAMP引物组及方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒 (Respiratory syncytial virus，RSV) 是有包膜的非节段负义RNA病毒，属于肺炎病毒科正肺病毒属，单负链病毒目。RSV仅在人类中传播，尽管它首先是从黑猩猩中分离出来的。该病毒可以通过实验感染小鼠、大鼠、棉鼠、雪貂和仓鼠，但不会在这些动物种群中自然传播。而近年来发现马来亚穿山甲(Manis javanica)自然感染了RSV，这些RSV与人类流行的菌株具有99.4%-99.8%的基因组同一性。
RSV病毒为非节段性单股负链RNA病毒，基因组全长约15.2 Kb，共包含10个基因，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白（F、G、M2-1、M2-2、SH、N、P、L）和3种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3)；其中的融合蛋白（fusion protein，F）和粘附蛋白（attachment protein，G）是两个主要的包膜糖蛋白。根据F蛋白和G蛋白的突变，RSV病毒分为A和B两种亚型。
目前最常用核酸检测方法有常规PCR方法等。传统的RSV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。PCR和Real-time PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，需要专业技术人员，还需要有荧光定量PCR仪，且Real-time PCR试剂成本很贵，难以在基层应用。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。其特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60 min内实现109-1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于荧光PCR技术，而检测成本远低于荧光定量PCR。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的LAMP引物组及方法。
本发明的第一个目的是提供用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的LAMP引物组，包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP；所述的外引物F3，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的外引物B3，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的内引物FIP，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的内引物BIP，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的试剂盒，其包括环介导等温扩增试剂和所述的LAMP引物组。
本发明的第三个目的是提供所述的LAMP引物组在检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的方法，包括以下步骤：
S1. 提取待检测样品的RNA并反转录为cDNA；
S2. 利用所述的LAMP引物组、以步骤S1获得的cDNA为模板进行环介导等温扩增反应；
S3. 扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检测样品是否含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型。
优选，所述的步骤S2中，所述的环介导等温扩增反应的体系为25 μL：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL10 mM dNTP Mix、1.5 μL 100 mM MgSO4、2.5 μL 10 mM Betaine、10 μM的外引物F3、B3各1.0 μL、40 μM的内引物FIP、BIP各1.0 μL；待检样品cDNA模板1.5 μL，ddH2O补足至25 μL；所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃恒温反应50 min，然后在80℃恒温处理5 min。
优选，所述的步骤S3，扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检测样品是否含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；
其中判断的方法为如下的任意一种：
（1）SYBR Green I荧光染色显色法：向扩增反应体系溶液中加入SYBR Green I，然后直接用肉眼观察；如果溶液变成绿色（说明扩增反应体系中产生有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型扩增产物），则待检测样品中含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；如果溶液保持橙色，则待检测样品中不含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；
（2）琼脂糖凝胶电泳法：将扩增反应体系溶液进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现梯形电泳条带，则待检测样品中含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；如果无梯形电泳条带，则待检测样品中不含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型。
优选，所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的方法，还含有阴性对照品和阳性对照品，以DEPC处理的ddH2O为阴性对照品，以含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型的G基因的重组质粒DNA为阳性对照品。
本发明提供的检测穿山甲RSV A和RSV B的LAMP引物组，引物组包括F3、B3、FIP、BIP，该引物组可以用于检测RSV，其特异性良好，该引物灵敏度高，稳定性良好，使反应时间减少，应用该LAMP引物组建立的环介导等温扩增技术来检测RSV，在特异性、灵敏度和重复性方面都可以得到良好的效果。这些优势使得本发明开发的基于LAMP检测方法方便用于实验室对RSV的快速检测和诊断。
本发明具有以下优点和有益效果：
1、操作简便、快速：本发明建立的穿山甲RSV A和RSV B的LAMP检测方法操作简便、无需复杂昂贵仪器。此外，建立的RSV-A、B的LAMP检测方法快速高效，可在60 min内完成（时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当）。反应结果判定方法简单，LAMP反应的扩增产物用SYBR Green I染色，在紫外光照射下肉眼可检测到扩增产物。
2、灵敏度高：本发明通过用10倍连续稀释细胞培养中的RSV-A、B的RNA的方法确定了LAMP引物组和检测方法的检测限。本发明的RSV-A、B的LAMP检测方法对RSV-A、B的RNA检测限为：1.76×100copies/μL。
3、特异性强：本发明的穿山甲RSV A和RSV B的LAMP方法特异性好，用穿山甲东阳病毒（Dong yang pangolin virus，DYPV）基因组、丽水病毒（Lishuipangolin virus，LSPV）基因组、副流感病毒5型（Parainfluenza Virus 5，PIV5）基因组、盖塔病毒（Getah virus,GETV）基因组、巴泰病毒（Batai virus, BATV）基因组作为模板进行LAMP检测，均未发现阳性结果。
附图说明
图1为实施例1中的重组质粒扩增图，证明设计的引物等能将RSV靶基因扩增出来；泳道1和2的两个条带分别对应的是pUC57-RSV-A-G和pUC57-RSV-B-G重组质粒；泳道3为阴性对照；M，DNA marker。
图2为实施例1中引物组组合对RSV-A、B的特异性图，其中，泳道1-2表示为RSV-A、RSV-B，泳道3-8分别为DYPV、LSPV、PIV5、GETV、BATV、阴性对照；M，DNA marker。
图3为利用引物组合制备的试剂盒灵敏性检测结果，图中泳道1-6分别表示RSV-A基因组RNA按照1.76×104copies/μL、1.76×103copies/μL、1.76×102copies/μL、1.76×101copies/μL、1.76×100copies/μL、1.76×10-1copies/μL六个梯度进行稀释，并作为模板进行反应；M，DNA marker。
图4为利用引物组合制备的试剂盒灵敏性检测结果，图中泳道1-6分别表示RSV-B基因组RNA按照1.76×104copies/μL、1.76×103copies/μL、1.76×102copies/μL、1.76×101copies/μL、1.76×100copies/μL、1.76×10-1copies/μL六个梯度进行稀释，并作为模板进行反应；M，DNA marker。
图5为RSV-A环介导等温扩增最适时间测定的荧光可视化图片，反应管编号1-7依次对应的反应条件分别为65℃反应60 min、50 min、40 min、30 min、20 min、10 min、阴性对照。
图6为RSV-A环介导等温扩增最适时间的琼脂糖凝胶电泳图片，泳道1-7依次分别为反应时间60 min、50 min、40 min、30 min、20 min、10 min、阴性对照；M，DNA marker。
图7为RSV-B环介导等温扩增最适时间测定的荧光可视化图片，反应管编号1-7依次对应的反应条件分别为65℃反应60 min、50 min、40 min、30 min、20 min、10 min、阴性对照。
图8为RSV-B环介导等温扩增最适时间的琼脂糖凝胶电泳图片，泳道1-7依次分别为反应时间60 min、50 min、40 min、30 min、20 min、10 min、阴性对照；M，DNA marker。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：LAMP引物的设计与验证
1、引物的设计
根据Genbank已发表的20对RSV的全基因组序列，比对分析，以Human respiratorysyncytial virus A strain BIME018T/pangolin/2018,（登录号: OM256489）为参考序列，选取G蛋白高度保守区域作为目的片段，运用Primer Explorer Version 5软件（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）设计了引物组用于LAMP分析。将从NCBI数据库上下载好的RSV-A和RSV-B的G基因序列导入上述软件，经过筛选得到合适的引物，进行引物合成，合成后的外引物F3、B3的浓度为10 μM，内引物FIP、BIP的浓度为40 μM。最终得到的LAMP引物组合如表1所示。
表1 LAMP引物序列
2、RNA模板的制备
2.1 质粒RNA模板的制备：
pUC57-RSV-A-G为含有呼吸道合胞病毒A型G基因片段的重组质粒，pUC57-RSV-B-G为含有呼吸道合胞病毒B型G基因片段的重组质粒，由库美生物技术有限公司合成构建，质粒含有T7启动子，重组质粒的RNA转录本依照T7体外转录试剂盒制备。具体体系组分及用量为：10×Transcription Buffer 2.0 μL，DNTP 2.0 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，T7 RNApolymerase 2.0 μL，模板（重组质粒） 0.5-1 μg，加RNase free ddH2O补足至20 μL。37℃孵育2 h，孵育完全后加入2.0 μL的RNase free DNase I，37℃消化30 min，以除去残留DNA。
2.2 待检样品RNA模板的制备：
利用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit（诺唯赞），提取样品基因组RNA，具体方法如下：
（1）向RNase-free离心管中加入200 μL样本(如样本量不足，使用PBS或0.9% NaCl补足)，加入500 μL Buffer VL，涡旋混匀15-30 s，将混合液瞬时离心收集至管底。
（2）将FastPure RNA Columns置于Collection Tubes 2 mL中，转移上述混合液至FastPure RNA Columns中，12,000 rpm (13,400×g)离 1 min，弃滤液。
（3）向FastPure RNA Columns中加入600 μL Buffer RW，12,000 rpm (13,400×g)离心30 s，弃滤液。重复步骤3。空柱12,000 rpm (13,400×g)离心2 min。
（4）小心将FastPure RNA Columns转移至新的RNase-free Collection Tubes1.5 mL (试剂盒提供)中，向膜中央悬空加入30-50 μL的RNase-free ddH2O，室温放置1min，12,000 rpm (13,400×g)离心1 min。
（5）弃去FastPure RNA Columns，DNA/RNA可直接用于后续检测或置于-30 ~ -15℃短期保存或置于-85 ~ -65℃长期保存。
3、cDNA模板的制备
反应体系组分及用量如下：5X PrimeScript Buffer 4.0 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.5 μL，PrimeScript RTase（200 U/μL） 1.0 μL，模板RNA 10 μL，加RNasefree ddH2O 补足至20 μL。30℃反应10 min，42℃反应40 min后95℃灭活5 min，产物-20℃储存备用。
4、引物的筛选及验证
使用表1的LAMP引物组合进行LAMP扩增，扩增反应体系（25 μL）为：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL10 mM dNTP Mix (Takara)、1.5 μL 100 mM MgSO4(Thermo Fisher Scientific)、2.5 μL10 mM Betaine、10 μM的外引物F3、B3分别加入1.0 μL、40 μM的内引物FIP、BIP分别加入1.0 μL；待检样品cDNA模板加入1.5 μL，ddH2O补足至25 μL。LAMP扩增反应工作程序为：65℃、50 min，再在80℃下恒温反应5 min。
方案一：LAMP产物(10 μL)经2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色紫外可见。图1结果表明，检测pUC57-RSV-A-G重组质粒、pUC57-RSV-B-G重组质粒均为阳性，有明显的梯形扩增条带。
方案二：通过向LAMP反应混合物中加入1.0 μL SYBR Green I(10000；Invitgen)，在紫外光照射下直接用肉眼观察产物。在LAMP扩增产物存在的情况下，溶液变成绿色；但在没有样本扩增产物的情况下，溶液保持橙色。重复实验进行三次。
实施例2：最适反应时间的优化
LAMP扩增反应在65℃下进行10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，以确定最佳反应时间。通过实验结果图5、图6、图7、图8得知在65℃反应50 min为最佳反应时间，在20 min时已出现扩增产物。
实施例3：样品的处理及检测
1、样品提取RNA：每份样品分别按照病毒DNA/RNA提取试剂盒操作说明书进行处理。
2、提取的RNA样品利用反转录试剂盒将病毒基因组RNA反转录为cDNA。
3、LAMP扩增：将处理后获得的cDNA模板样本，扩增反应体系（25 μL）为：2.5 μL 10× Isothermal Amplification Buffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5μL 10 mM dNTP Mix (Takara)、1.5 μL 100 mM MgSO4(Thermo Fisher Scientific)、2.5μL 10 mM Betaine、10 μM的外引物F3、B3分别加入1.0 μL、40 μM的内引物FIP、BIP分别加入1.0 μL；待检样品cDNA模板加入1.5 μL；ddH2O补足至25 μL。同时采用无DNA酶的蒸馏水作为阴性对照。将配置好、分装完毕的反应试管置于恒温锅仪器中在65℃下恒温60 min，再在80℃下恒温反应5 min。
4、结果分析和判定
试剂盒检测结果的判定方法为：
LAMP扩增反应产物利用琼脂糖凝胶电泳技术判断阴性和阳性。
阳性时：琼脂糖凝胶电泳在紫外线光照下出现梯形条带。
阴性时：琼脂糖凝胶电泳在紫外线光照下无梯形条带出现。
实施例4：灵敏度检验
分别将穿山甲RSV A和RSV B的RNA进行梯度稀释后反转录为cDNA，以此为模板评价LAMP引物组检测RSV-A、RSV-B的灵敏度。由图3、图4的灵敏度测试结果看出，该引物检测限1.76×100copies/μL仍出现良好的扩增信号，因此确定该引物在检测RSV-A和RSV-B的检测限为1.76×100copies/μL。
实施例5：特异性检验
1、用LAMP引物组及制备的试剂盒按照实施例1的方法分别检测各种病毒基因组，并通过琼脂糖凝胶电泳技术验证反应体系的特异性。
2、检测结果如图2所示，从该图可以看出，LAMP引物组及试剂盒可以成功检测出穿山甲RSV-A和RSV-B的基因组，而穿山甲东阳病毒（Dong yang pangolin virus，DYPV）、丽水病毒（Lishuipangolin virus，LSPV）、副流感病毒5型（Parainfluenza virus 5，PIV5）、盖塔病毒（Getah virus, GETV）、巴泰病毒（Batai virus, BATV）的基因组检测均为阴性（分别依次对应泳道3-7），无扩增产物产生。结果表明实施例1所述的LAMP引物组合制备的试剂盒没有造成交叉反应，具有良好的特异性。
以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、检测方便快捷、结果准确可靠。

Claims (7)

1. 用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP；所述的外引物F3，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的外引物B3，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的内引物FIP，其核酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述的内引物BIP，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的试剂盒，其特征在于，包括环介导等温扩增试剂和权利要求1所述的LAMP引物组。
3.权利要求1所述的LAMP引物组在检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型中的应用，所述的应用不用于疾病诊断目的。
4.一种非疾病诊断目的的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 提取待检测样品的RNA并反转录为cDNA；
S2. 利用权利要求1所述的LAMP引物组、以步骤S1获得的cDNA为模板进行环介导等温扩增反应；
S3. 扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检测样品是否含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2中，所述的环介导等温扩增反应的体系为25 μL：2.5 μL 10× Isothermal Amplification Buffer II、1.0 μL 8U/μLBst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL 10 mM dNTP Mix、1.5 μL 100 mM MgSO4、2.5 μL 10 mMBetaine、10 μM的外引物F3、B3各1.0 μL、40 μM的内引物FIP、BIP各1.0 μL；待检样品cDNA模板1.5 μL，ddH2O补足至25 μL；所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃恒温反应50min，然后在80℃恒温处理5 min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3，扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检测样品是否含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；其中判断的方法为如下的任意一种：
（1）SYBR Green I荧光染色显色法：向扩增反应体系溶液中加入SYBR Green I，然后直接用肉眼观察；如果溶液变成绿色，则待检测样品中含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；如果溶液保持橙色，则待检测样品中不含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；
（2）琼脂糖凝胶电泳法：将扩增反应体系溶液进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现梯形电泳条带，则待检测样品中含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型；如果无梯形电泳条带，则待检测样品中不含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还含有阴性对照品和阳性对照品，以DEPC处理的ddH2O为阴性对照品，以含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型的G基因的重组质粒DNA为阳性对照品。
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