CN112063753A

CN112063753A - 检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN112063753A
Application number: CN202010882404.3A
Authority: CN
Inventors: 李艳; 李春玲; 孙铭飞; 张昆丽; 勾红潮; 蔡汝健; 楚品品; 卞志标; 宋帅; 蒋智勇
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对、方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明的锁核酸修饰引物对、方法及试剂盒与常规引物、检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值；可在条件一般的实验室或基层开展。

Description

检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对、方法及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)属于双链DNA病毒目非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，该属目前仅有一个非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒的基因组为单分子线状DNA，长度约170-190kb。非洲猪瘟病毒组至少含有151-167个ORFs，P72蛋白由基因B646L编码，是病毒的主要结构蛋白和核心抗原蛋白，也是ASFV核酸检测主要的靶标蛋白。

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病时间短，病死率可达100％。非洲猪瘟是目前养猪业面临的头号传染病，被世界动物卫生组织列为法定报告疫病，我国将其列为一类动物传染病，给我国养猪业造成了严重的经济损失。

目前，非洲猪瘟尚无有效的疫苗预防，该病防控措施主要依靠精准检测，早期剔除，因此急需建立便捷、精准且适合临床非洲猪瘟病毒检测的方法。目前非洲猪瘟病毒的检测方法主要包括病毒分离、ELISA、普通PCR及荧光定量PCR。病毒分离和ELISA对实验人员专业技术的要求比较高，很难在条件一般的实验室或基层临床开展。荧光定量PCR的敏感性虽然相对较高，但需要昂贵的实时荧光定量PCR仪，在条件一般的实验室或基层临床同样难以推广普及。普通PCR技术比较容易推广使用，但其敏感性有待提高。

锁核酸(locked nucleic acid,LNA)技术通过将碱基进行锁核酸修饰，可显著提高核苷酸与DNA模板的结合能力。国内外研究发现，含有LNA碱基的引物可显著提高PCR扩增的效率，包括特异性和敏感性，含有LNA修饰碱基的PCR引物其Tm值显著提高。采用锁核酸修饰的引物PCR方法检测非洲猪瘟病毒具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对。

本发明的另一目的在于提供包含上述锁核酸修饰引物对的检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供利用上述检测试剂盒检测非洲猪瘟病毒的PCR方法。

本发明的目的通过下列技术方案实现：一种检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对，其上游引物和下游引物的序列如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。

所述的上游引物的序列中，第11位的碱基“T”、第15位的碱基“A”、第20位的碱基“T”均为锁核酸。

所述的下游引物的序列中，第9位的碱基“A”、第12位的碱基“T”、第16位的碱基“A”均为锁核酸。

上述锁核酸修饰引物对在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包含上述锁核酸修饰引物对。

所述的检测试剂盒还包含2×Tag Master Mix、阳性对照和阴性对照。

所述的阳性对照优选为包含所述的非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白P72编码基因B646L的重组质粒pUC57-ASFV-p72。

所述的基因B646L的核苷酸序列如Seq ID No.5所示。

所述的阴性对照为灭菌水。

上述检测非洲猪瘟病毒的试剂盒在鉴定和/或检测非洲猪瘟病毒中的应用。

一种检测非洲猪瘟病毒的PCR方法，包括如下步骤：

(1)从样品中提取病毒核酸；

(2)配制PCR反应体系；

(3)使用权利要求1或2所述的锁核酸修饰引物对进行扩增反应。

进一步的，所述的PCR方法还包括琼脂糖凝胶检测步骤。

步骤(2)中所述的PCR反应体系为：2×Tag Master Mix 10μL、浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物各0.8μL(体系中终浓度为0.4μmol/L)、模板DNA 1μL、ddH₂O加至20μL。

步骤(3)中所述的扩增反应的反应条件为：预变性95℃、4min；94℃、30s，72.6℃、30s，72℃、40s，扩增35个循环；72℃、10min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明检测非洲猪瘟病毒的引物对、PCR方法和试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点，将其用于科研及临床应用，具有商业应用价值。

2.采用本发明检测非洲猪瘟病毒的引物对、PCR方法和试剂盒进行检测，操作简便，可在条件一般的实验室或基层开展。

附图说明

图1是不同Tm值得到的PCR扩增结果图；其中，M为DL500，1～12依次为退火温度62℃、62.3℃、63.0℃、64.3℃、66.0℃、67.7℃、69.2℃、70.9℃、72.6℃、73.8℃、74.6℃、75.0℃，13为阴性对照。

图2是不同引物浓度得到的PCR扩增结果图；其中，M为DL500，1～7依次为引物浓度0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L和0.7μmol/L，8为阴性对照。

图3是LNA修饰引物PCR方法的敏感性检测结果图；其中，1～7依次为3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹、3×10⁰拷贝的阳性重组质粒，8为阴性对照。

图4是LNA修饰引物PCR方法的特异性检测结果图；其中，1、2均为3×10⁶拷贝的阳性重组质粒，3为猪瘟病毒，4为猪圆环病毒2型，5为猪伪狂犬病毒，6为阴性对照。

图5是常规引物PCR扩增敏感性检测结果图；其中，M为DL500，1～5依次为3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²拷贝的阳性重组质粒，6为阴性对照。

图6是常规引物real-time PCR方法检测结果图；其中，A为扩增曲线，1～6依次为3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹拷贝的阳性重组质粒；B为熔解曲线。

具体实施方式

下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1用于非洲猪瘟病毒检测的LNA引物对的设计

根据GenBank中公布的非洲猪瘟病毒的基因组序列中保守稳定的B646L基因(P72蛋白基因，登录号：MH713612)序列，设计两对特异性引物，其中锁核酸修饰引物序列中的适当碱基进行锁核酸修饰。引物具体序列如表1所示。

表1引物序列

表1中，P1引物序列中，第11位、15位和20位碱基为锁核酸修饰碱基；P2引物序列中，第9位、12位和16位碱基为锁核酸修饰碱基。

B646L基因的扩增区域如SEQ ID No.5所示：

GGTAATGTGATCGGATACGTAACGGGGCTAATATCAGATATAGATGAACATGCGTCTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCTTATCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAA

实施例2非洲猪瘟病毒LNA引物PCR检测方法的建立与优化

1、病毒株

猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒均采购自市场上的商品化疫苗，其中，猪瘟病毒活疫苗购自广东永顺生物制药股份有限公司，猪伪狂犬病毒活疫苗(Bartha-K61株)、猪圆环病毒2型灭活疫苗购自上海海利生物技术有限公司。

2、试剂盒中阳性对照物的制备

阳性对照质粒pUC57-ASFV-p72由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并测序。测序结果与GenBank序列比对无误后，采用全自动紫外分光光度计测定质粒的浓度和纯度。

3、病毒核酸提取

按照病毒核酸提取试剂盒操作说明，提取猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的病毒基因组，作为模板。

4、PCR反应条件优化

1)反应条件和反应体系

反应条件为：95℃、4min；94℃、30s，72.6℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃、10min。反应体系如表2所示。

表2 PCR反应体系

2)退火温度的优化

将退火温度进行梯度设置为62℃～75℃，分别为62℃、62.3℃、63.0℃、64.3℃、66.0℃、67.7℃、69.2℃、70.9℃、72.6℃、73.8℃、74.6℃、75.0℃，进行退火温度的优化，反应体系和其他反应条件均与步骤1)中记载相同。用P1/P2引物进行PCR，反应结束后取PCR产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，PCR扩增反应在62℃～75℃退火温度范围内均有良好扩增，退火温度为72.6℃时扩增目的条带最亮，因此最佳退火温度选择72.6℃。

3)引物浓度的优化

P1/P2引物浓度分别为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L和0.7μmol/L，无菌水作为阴性对照，反应条件和反应体系均与步骤1)中记载相同，结果如图2所示，随着引物浓度提高，扩增的目的条带越来越明显，当引物浓度达到0.4μmol/L时，目的条带最亮，而后随着引物浓度提高，目的条带无明显变化，因此最佳引物浓度为0.4μmol/L。

5、敏感性试验

将测定浓度和纯度后的阳性重组质粒pUC57-ASFV-p72分别做10倍的梯度稀释，选取3×10⁰～3×10⁶copies/μL共7个稀释度的重组质粒作为标准品模板(标号依次为7、6、5、4、3、2、1)，无菌水作为阴性对照，利用步骤4建立的反应体系和反应条件进行PCR扩增，试验重复3次。结果如图3所示，LNA引物PCR最低可检测限度为3×10¹copies/μL。

6、特异性试验

利用所建立的LNA引物PCR反应体系和反应条件，以3×10⁶拷贝的阳性重组质粒pUC57-ASFV-p72作为标准的阳性对照，猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒基因组作为模板，无菌水作为阴性对照，进行PCR，以验证LNA引物PCR方法的特异性。采用P1/P2引物分别对3×10⁶拷贝的阳性重组质粒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒基因组进行LNA引物PCR扩增，结果如图4所示，只有阳性重组质粒能扩增出147bp的目的片段，其他病毒未扩增出目的条带，表明LNA引物PCR检测方法具有良好的特异性。

对比例

1、非洲猪瘟病毒LNA引物与常规引物PCR扩增比对

将实施例2中测定浓度和纯度后的阳性重组质粒pUC57-ASFV-p72分别做10倍的倍比稀释，得到3×10²～3×10⁶copies/μL共5个稀释度的重组质粒作为标准品模板，每个模板浓度作3个平行样，无菌水作为阴性对照。按照实施例2LNA引物的PCR反应体系和以下反应条件：预变性95℃、4min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、40s，扩增35个循环；72℃、10min，采用实施例1未修饰引物P3/P4进行非洲猪瘟病毒PCR扩增。反应结束后取PCR产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图5所示，常规引物P3/P4的PCR扩增最低可检测限度为3×10³copies/μL，比LNA修饰引物PCR扩增灵敏度低了100倍，敏感性远低于LNA引物PCR，且有非特异性扩增条带，说明LNA引物PCR更灵敏且特异性良好。

2、非洲猪瘟病毒LNA引物PCR方法与常规引物real-time PCR方法扩增比对

将3×10¹～3×10⁶copies/μL共6个稀释度的重组质粒作为标准品模板，每个模板浓度作3个平行样，无菌水作为阴性对照。采用P3/P4引物，按照扩增程序：95℃、30s；95℃、5s，60℃、30s，共40个循环；熔解曲线：95℃、15s，60℃、1min，95℃、15s，及表3所示反应体系进行real-time PCR扩增，获得荧光扩增曲线。通过观察扩增曲线来确定检测到重组质粒的最低拷贝数。结果如图6所示，采用常规引物real-time PCR方法扩增的最低检测限度为3×10²copies/μL，扩增敏感性比LNA修饰引物PCR方法扩增灵敏度低了10倍，说明所建立的LNA引物PCR方法敏感性高。

表3 real-time PCR反应体系

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对、方法及试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P1

<400> 1

ggtaatgtga tcggatacgt aacg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P2

<400> 2

ttggcacaag ttcggacatg ttgt 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P3

<400> 3

ggtaatgtga tcggatacgt aacg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P4

<400> 4

ttggcacaag ttcggacatg ttgt 24

<210> 5

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B646L基因的核苷酸序列

<400> 5

ggtaatgtga tcggatacgt aacggggcta atatcagata tagatgaaca tgcgtctgga 60

agagctgtat ctctatcctg aaagcttatc tctgcgtggt gagtgggctg cataatggcg 120

ttaacaacat gtccgaactt gtgccaa 147

Claims

1.一种检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对，其特征在于：其上游引物和下游引物的序列如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对，其特征在于：

所述的上游引物的序列中，第11位的碱基“T”、第15位的碱基“A”、第20位的碱基“T”均为锁核酸；

3.权利要求1或2所述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

4.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1或2所述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物对。

5.根据权利要求4所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：

所述的检测试剂盒还包含2×Tag Master Mix、阳性对照和阴性对照；

所述的阳性对照为包含所述的非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白P72编码基因B646L的重组质粒pUC57-ASFV-p72；

所述的基因B646L的核苷酸序列如Seq ID No.5所示；

所述的阴性对照为灭菌水。

6.权利要求4或5所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒在鉴定和/或检测非洲猪瘟病毒中的应用。

7.一种检测非洲猪瘟病毒的PCR方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)从样品中提取病毒核酸；

(2)配制PCR反应体系；

8.根据权利要求7所述的检测非洲猪瘟病毒的PCR方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的PCR反应体系为：2×Tag Master Mix 10μL、体系中终浓度均为0.4μmol/L的上游引物和下游引物、模板DNA 1μL、ddH₂O加至20μL。

9.根据权利要求7所述的检测非洲猪瘟病毒的PCR方法，其特征在于：

10.根据权利要求7-9任一项所述的检测非洲猪瘟病毒的PCR方法，其特征在于：所述的PCR方法还包括琼脂糖凝胶检测步骤。