CN113817726A - 用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物及试剂盒。所述扩增引物组合物适于特异性扩增猫杯状病毒的ORF2基因靶标区域，包括正向引物及反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；各引物序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是相应序列的3'末端碱基，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3‑6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为腺嘌呤和胸腺嘧啶。本发明还公开了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，可用于猫杯状病毒的快速检测，应用前景广阔。

Description

用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种用于检测猫杯状病毒（FCV）的扩增引物组合物，尤其涉及经锁核酸修饰、化学基团标记的用于检测猫杯状病毒PCR扩增结合核酸分子捕获的特异性引物，及相应的试剂盒。
背景技术
猫杯状病毒（Feline calicivirus，FCV）是杯状病毒科、水疱性病毒属的成员之一，是无囊膜的单股正链RNA，直径为30 ~ 40nm，能够引起猫科动物急性口腔溃疡、结膜炎、急性关节炎、上呼吸道传染病和慢性胃肠炎等疾病，故又叫猫传染性鼻-结膜炎。FCV可导致动物患血热样疾病，在猫科动物中广泛流行，是危害猫科动物的重要病原之一，在我国猫群、虎和猎豹之间也存在感染FCV流行的报道，引起人们高度重视。
猫杯状病毒（FCV）呈世界性分布，接种疫苗的动物仍然可以成为持续性感染源，造成疾病的流行。目前检测FCV的常见方法有：酶联免疫法，但是该方法灵敏度低，假阳性高，易造成误检；荧光定量PCR法，该方法灵敏度较高，但仪器成本投入较大，对操作人员要求较高。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，适于特异性扩增猫杯状病毒的ORF2基因靶标区域，其包括：
正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
并且，所述正向引物、反向引物的每个序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是相应序列的3'末端碱基，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3-6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为腺嘌呤和/或胸腺嘧啶。
本发明实施例还提供了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其包括：前面所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1）本发明提供的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物中的各引物具有极高的扩增效率和特异性，能够高效率、特异性地扩增出目的基因片段；
2）本发明采用锁核酸修饰ORF2基因对应的上下游引物，锁核酸修饰后，大幅度提高了引物的Tm值和PCR扩增的退火温度，从而高效率地降低引物二聚体和非特异性扩增片段的形成，提高了扩增的特异性，避免了胶体金试条检测的假阳性；
3）本发明采用化学基团标记ORF2基因对应的上下游引物，上下游引物采用不同化学基团标记，分别与试条上对应的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，进一步提高了检测的特异性；
4）与ELISA和免疫胶体金技术相比，本发明充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件。本发明提供的试剂盒能够用于猫杯状病毒的快速定性检测，具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，应用前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型方案中核酸捕获金标试纸条的原理示意图；
图2是AsFV快速检测试纸条的结构示意图截面图；
图3是金标试纸条判读结果标准图；
图4A和图4B是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中零个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4C和图4D是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中一个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4E和图4F是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中两个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4G和图4H是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中三个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4I和图4J是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图5A和图5B是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中连续四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图6A和图6B是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中只有G和C碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图7A和图7B是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中是否修饰引物的3'末端碱基对引物二聚体的影响图；
图8A是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图；
图8B是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中零个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图；
图9是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测灵敏度实验结果图；
图10是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中零个、一个、两个、三个、四个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图；
图11是本发明一典型方案中FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测特异性实验结果图。
附图说明：1-衬板，2-样品垫，3-金标结合垫，4-包被膜，5-检测印迹线，6-对照印迹线，7-吸水垫，8-1-样品浸入端保护膜，8-2-手柄端保护膜。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是利用PCR扩增与核酸捕获金标试纸条相结合的方法，对FCV的ORF2基因的保守区域重新设计、锁核酸修饰、化学基团标记特异性引物，优化反应体系，以核酸捕获金标试纸条为载体对PCR扩增产物进行检测，检测原理示意可参阅图1。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
作为本发明实施例的一个方面，本发明提供了一种用于检测猫杯状病毒（以下可简称为FCV）的扩增引物组合物，适于特异性扩增猫杯状病毒的ORF2基因靶标区域，其包括：
正向引物（下文也可称为上游引物），所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
反向引物（下文也可称为下游引物），所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，本发明提供的用于FCV PCR扩增和核酸捕获的特异性引物根据FCV的ORF2基因的保守区域设计，用以FCV的定性检测。
进一步地，所述扩增引物组合物中ORF2基因对应的上游引物具有下列序列表1中FCV-ORF2-F（即前述的正向引物）所示的核苷酸序列，ORF2基因对应的下游引物具有下列序列表1中FCV-ORF2-R（即前述的反向引物）所示的核苷酸序列。
表1
Figure 527425DEST_PATH_IMAGE001
本发明所设计的以上各引物能够高效率、特异性地扩增出目的基因片段。
并且，本发明提供的扩增引物组合物中正向引物、反向引物的每个序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是相应序列的3'末端碱基，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3-6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为腺嘌呤A和/或胸腺嘧啶T。经过该种锁核酸方法修饰后，大幅度提高了引物的Tm值和PCR扩增的退火温度，从而高效率地降低引物二聚体和非特异性扩增片段的形成，提高了扩增的特异性，避免了胶体金试条检测的假阳性。
在一些优选实施方案中，从5’末端到3'末端方向，所述正向引物（即FCV-ORF2-F）中锁核酸的修饰位点可以分别是第6位的腺嘌呤A、第11位的胸腺嘧啶T、第17位的腺嘌呤A、第22位的胸腺嘧啶T，具体可以参见表2所示。
在一些优选实施方案中，从5’末端到3'末端方向，所述反向引物（即FCV-ORF2-R）中锁核酸的修饰位点可以分别是第6位的胸腺嘧啶T、第11位的腺嘌呤A、第17位的腺嘌呤A、第22位的胸腺嘧啶T，具体可以参见表2所示。
表2 修饰引物序列表（+N碱基为锁核酸修饰）
Figure 250530DEST_PATH_IMAGE002
在一些优选实施方案中，所述正向引物、反向引物的5’末端均经过化学基团标记。
进一步地，所述正向引物的5’末端所标记的化学基团与所述反向引物的5’末端所标记的化学基团不同。
其中具体的，所述正向引物的5’末端标记的是Biotin基团。而所述反向引物的5’末端标记的是FITC基团。
本发明以上采用的上、下游引物两端采用不同化学基团标记，分别与试条上包被的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，进一步提高了检测的特异性。
作为本发明实施例的另一个方面，本发明还提供了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其包括：前面所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物。
进一步地，本发明所提供的试剂盒包括用于对猫杯状病毒（FCV）核酸进行PCR扩增的扩增引物组合物，以及对其PCR扩增产物进行检测的FCV核酸捕获金标试纸条。
因此，本发明还提供了一种特异性强、灵敏度高，能快速、简便地检测猫杯状病毒（FCV）的核酸捕获金标试纸条及其检测方法。该方法是以待检样品中的核酸为检测对象，特异性及灵敏度均较好。
在一些实施方案之中，请参阅图2所示，本发明提供的一种用于猫杯状病毒核酸捕获的金标试纸条含有长条型衬板1，衬板1的上表面从一端到另一端依次粘贴有样品垫2、吸附有FITC金标抗体的金标结合垫3、包被膜4及吸水垫7，包被膜4上印制有Biotin抗体的隐形检测印迹线5和羊抗鼠二抗的隐形对照印迹线6，所述的吸水垫7是滤纸或滤油纸。
进一步地，所述衬板1为硬质PVC塑胶条。
进一步地，所述样品垫2为聚酯膜。
进一步地，所述包被膜4为硝酸纤维素膜。
进一步地，所述金标试纸条的两端覆有保护膜，一端的样品浸入端保护膜8-1覆盖在样品垫2和金标结合垫3上，样品浸入端保护膜8-1上印制有样品标识线；另一端的手柄端保护膜8-2覆盖在吸水垫7上。
进一步地，所述金标试纸条还设有由底座和面板组成的外壳，底座上设有衬板1的试纸芯定位槽，面板上设有观察窗和加样孔，底座和面板之间以面板凹槽和凸条插接相连。
进一步地，所述包被膜4上的隐性检测印迹线5和隐性对照印迹线6为线条型。
本发明提供的金标试纸条的检测线包被上游引物标记化学基团的抗体，金垫上干燥有胶体金偶联下游引物标记化学基团的抗体。由于该试纸条采用了核酸捕获的方法，经PCR扩增后样本含量得到了几何级数的放大，因此大大提高了试纸条的检测灵敏度。并且，通过对PCR产物进行一定量的稀释，再进行上样，可极大提高胶体金试纸条的检测灵敏度。
综上，藉由上述技术方案，本发明充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件。本发明的检测方法使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，为FCV的检测提供了一种更为灵敏、更为准确、更为便捷、更为快速的检测方法。
本发明的检测方法以FCV的ORF2基因的保守区域设计锁核酸修饰、化学基团标记引物，PCR产物与金标试纸条结合并显色，根据显色结果，对猫杯状病毒进行定性检测。本发明的检测方法及试剂盒可用于猫杯状病毒的快速检测，应用前景广阔。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一、对FCV进行PCR的引物设计
参照GenBank收录的FCV基因组序列，选择FCV的ORF2基因保守区域，采用ABIPrimerExpress 3.0 PCR引物设计软件，设计合成引物。
Figure 127220DEST_PATH_IMAGE003
二、锁核酸修饰PCR引物
本实施例采用的引物修饰为：上游引物和下游引物分别有四个碱基经过锁核酸修饰（+N碱基为锁核酸修饰）。
2.1 FCV-ORF2 锁核酸修饰引物
2.1.1 FCV-ORF2 四个碱基锁核酸修饰引物（详见前文表2）
F：5’-TGGCA+ATCGC+TTTTGG+AGTGA+T-3’
R：5’-TTAGA+TCATT+ACCCTC+AACCG+T-3’
2.1.2 FCV-ORF2 零个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-TGGCAATCGCTTTTGGAGTGAT-3’
R：5’-TTAGATCATTACCCTCAACCGT-3’
2.1.3 FCV-ORF2 一个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-TGGCAATCGCTTTTGGAGTGA+T-3’
R：5’-TTAGATCATTACCCTCAACCG+T-3’
2.1.4 FCV-ORF2 二个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-TGGCAATCGC+TTTTGGAGTGA+T-3’
R：5’-TTAGATCATT+ACCCTCAACCG+T-3’
2.1.5 FCV-ORF2 三个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-TGGCA+ATCGCT+TTTGGAG+TG-3’
R：5’-TTAGATC+ATTACCC+TCAACCG+TG-3’
2.1.6 FCV-ORF2 连续四个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-TGGCAATCG+C+T+T+TTGGAGTGAT-3’
R：5’-TTAGATCA+T+T+A+CCCTCAACCGT-3’
2.1.7 FCV-ORF2 只有GC碱基锁核酸修饰引物
F：5’-TGG+CAATCG+CTTTT+GGAGT+GAT-3’
R：5’-TTAGAT+CATTA+CCCT+CAACC+GT-3’
2.1.8 FCV-ORF2 非3’末端碱基锁核酸修饰引物
F：5’-TGGCA+ATCGC+TTTTGG+AGTG+AT-3’
R：5’-TTAGA+TCATT+ACCC+TCA+ACCGT-3’
三、化学基团标记PCR引物
所述的引物化学基团标记方法为：上游引物采用Biotin基团标记，下游引物采用FITC基团标记。
3.1 FCV-ORF2化学基团标记引物（详见前文表2）
F：5’-Biotin-TGGCAATCGCTTTTGGAGTGAT -3’ 22bp
R：5’-FITC-TTAGATCATTACCCTCAACCGT -3’ 22bp
四、胶体金试纸条制作
该制作方法可以参考现有相关文献。
五、核酸制备
5.1无菌条件下将样本液体混合均匀后，取300μL样品于1.5mL洁净离心管中，加入500μL裂解液和10μL蛋白酶K，56℃水浴30min。
5.2磁珠使用前须于37℃温育10min，用手轻轻摇匀使之呈现悬浮状态。
5.3经水浴裂解完毕的样品中，加入15μL已加热混匀的磁珠，再加入250μL的结合液，涡旋混匀。
5.4将离心管于混合仪旋转混合10min（转速0.83 ~ 0.85转/s）。
5.5混合完毕，于磁力架固定吸附，肉眼观察，磁珠完全被吸附至磁铁一侧即可（约需要10 ~ 15s），用移液器吸去离心管内清液，加入500μL漂洗液漂洗磁珠，每次注入漂洗液后轻轻摇匀5s，再次固定于磁力架，10s后再次完全吸去清液，重复漂洗三次。
5.6将离心管从磁力架上取下，开盖放置5min使乙醇完全挥发。
5.7加入100μL洗脱液，超声分散附着在离心管壁的磁珠（超声时间大约45s，时间不宜过长以免RNA断裂），期间不断取出摇匀肉眼观察分散情况。
5.8水浴65℃，10min，然后置于磁力架上分离磁珠，用移液器吸取清液至新的洁净1.5mL离心管中，即得到RNA溶液。
也可按照市面上商品化核酸制备试剂盒进行核酸提取。
六、PCR实验
6.1 PCR反应体系
Figure 11999DEST_PATH_IMAGE004
6.2 PCR反应条件
90℃预变性30秒；60℃反转录5分钟；95℃预变性1分钟；95℃变性10秒，64℃退火20秒，40个循环；4℃保存。
七、判读标准
7.1试纸条上样
取6μL PCR产物，加入54μL上样稀释液，混匀后垂直缓慢滴加于试条样品孔中，3-5分钟之间观察结果。
7.2结果判定
试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为阳性。试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性，详见图3。
7.3表述
阳性：FCV-ORF2试纸条质控线（C线）变红色，且检测线（T线）变红色，则检测结果为检出猫杯状病毒ORF2基因。
阴性：FCV-ORF2试纸条质控线（C线）变红色，且检测线（T线）不变色，检测结果为阴性，判定为未检出猫杯状病毒ORF2基因。
7.4质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
A)空白对照：质控线变红，检测线未变红。
B)阴性对照：质控线变红，检测线未变红。
C)阳性对照：质控线变红，检测线变红。
对比例1 引物中锁核酸修饰碱基数量对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中锁核酸修饰碱基的数量对引物二聚体的影响，对FCV-ORF2引物进行不同碱基数量锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4A-图4J，具体的，图4A和图4B为FCV-ORF2引物中零个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图，图4C和图4D为FCV-ORF2引物中一个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图，图4E和图4F为FCV-ORF2引物中两个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图，图4G和图4H为FCV-ORF2引物中三个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图，图4I和图4J为FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图。其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；猫：猫的核酸；+：103copy/μl阳性样本核酸；++：104copy/μl阳性样本核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别有零、一、二、三个碱基经过锁核酸修饰时，不能有效消减引物二聚体的产生，且会导致胶体金试条检测假阳性的产生，而且都有不同程度的非目的片段产生。而当上下游引物分别有四个碱基经过锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
对比例2 引物中锁核酸修饰碱基的间距对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中锁核酸修饰碱基的间距对引物二聚体的影响，对FCV-ORF2引物进行四个3-6个碱基间距的碱基锁核酸修饰和连续四个碱基锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4I和图4J，以及图5A和图5B。图5A和图5B为FCV-ORF2引物中连续四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；猫：猫的核酸；+：103copy/μl阳性样本核酸；++：104copy/μl阳性样本核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别有连续四个碱基被锁核酸修饰时，不仅不能有效消减引物二聚体的产生，还会导致胶体金试条检测假阳性的产生，而且从电泳图上来看，该引物不能扩增出目的片段。而当上下游引物分别有四个3-6个碱基间距的碱基经过锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
另外，本案发明人还尝试了锁核酸修饰碱基的间距1个或者2个碱基，其结果与连续四个碱基锁核酸修饰的结果一样，存在空间位阻，易造成胶体金试条检测假阳性。
对比例3 引物中修饰的碱基种类为A和T或者G和C对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中修饰的碱基种类为A和T或者G和C对引物二聚体的影响，对FCV-ORF2引物进行只有A和T碱基锁核酸修饰或者只有G和C碱基锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4I和图4J，以及图6A和图6B。图6A和图6B为FCV-ORF2引物中只有G和C碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；猫：猫的核酸；+：103copy/μl阳性样本核酸；++：104copy/μl阳性样本核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别只有G和C碱基被锁核酸修饰时，不仅不能有效消减引物二聚体的产生，还会导致胶体金试条检测假阳性的产生，而且引物的灵敏度与只有A和T碱基锁核酸修饰引物相比，下降了一个数量级。当上下游引物分别只有A和T碱基经过锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
对比例4 引物中是否修饰引物的3'末端碱基对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中是否修饰引物的3'末端碱基对引物二聚体的影响，对FCV-ORF2引物进行3'末端碱基锁核酸修饰和非3'末端碱基锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4I和图4J和图7A和图7B，图7A和图7B为FCV-ORF2引物中是否修饰引物的3'末端碱基对引物二聚体的影响图，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；猫：猫的核酸；+：103copy/μl阳性样本核酸；++：104copy/μl阳性样本核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别进行非3'末端碱基锁核酸修饰时，不仅不能有效消减引物二聚体的产生，还会导致胶体金试条检测假阳性的产生，而且从电泳图上来看，该引物不能扩增出目的片段。当上下游引物分别进行3'末端碱基锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
经过以上对照试验，本案发明人获得的结论如下：FCV-ORF2-F、FCV-ORF2-R的各引物序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3-6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为A和T，且锁核酸修饰于3'末端碱基。因此，只有前述特定的四个碱基被锁核酸修饰了才能达成最优的效果。
测试例1 FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物的灵敏度实验
为了验证FCV-ORF2四个碱基被锁核酸修饰这对引物的灵敏度，本案发明人将FCV的真实样本RNA提取物进行梯度浓度稀释，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。其中，FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR-电泳检测结果见图8A，其中，M：Marker；1：106copy；2：105copy；3：104copy；4：103copy；5：102copy；6：101copy；7：100copy；8：阴性；FCV-ORF2引物中零个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR-产物电泳检测结果见图8B，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；猫：猫的核酸；+：103copy/μl阳性样本核酸；++：104copy/μl阳性样本核酸。以上结果表明，FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物的灵敏度能达到103copy/μl，但是FCV-ORF2零个碱基锁核酸修饰引物的灵敏度只能达到104copy/μl，较四个碱基锁核酸修饰的引物降低了一个数量级。
FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测灵敏度实验检测结果可以参见图9，其中，1：106copy；2：105copy；3：104copy；4：103copy；5：102copy；6：101copy；7：100copy；8：阴性。以上结果表明，当RNA浓度为103copy/μl时，FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物试纸条质控线和检测线依然能显示红色条带，电泳检测结果与试纸条检测结果保持一致。综上所述，本实施例的FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物，电泳检测和试条检测的灵敏度都可达到103copy/μl，且比FCV-ORF2零个碱基锁核酸修饰引物的灵敏度高一个数量级。
测试例2 FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物的特异性实验
为了验证FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物的特异性，本案发明人用FCV的质粒DNA作为阳性质控，猫毛和猫唾液核酸作为宿主，无核酸酶的水作为阴性对照，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。FCV-ORF2引物中零个、一个、两个、三个、四个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图可以参见图10，其中，FCV-0 LNA表示FCV-ORF2零个碱基锁核酸修饰引物，FCV-1 LNA表示FCV-ORF2一个碱基锁核酸修饰引物，FCV-2 LNA表示FCV-ORF2两个碱基锁核酸修饰引物，FCV-3 LNA表示FCV-ORF2三个碱基锁核酸修饰引物，FCV-4LNA表示FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；猫：猫的核酸；+：103copy/μl阳性样本核酸；++：104copy/μl阳性样本核酸。
以上结果表明，FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物除了阳性质控泳道有目的条带，其他泳道均没有任何条带，FCV-ORF2零个、一个、两个、三个碱基锁核酸修饰引物，出现很多非特异性扩增片段。
FCV-ORF2引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测特异性实验结果可以参见图11，其中，阴：DEPC水；猫：猫的核酸；+：103copy/μl阳性样本核酸；++：104copy/μl阳性样本核酸。以上结果表明，除了阳性对照试纸条质控线和检测线依然能显示红色条带，其他均只有质控线能显示红色条带，与电泳结果保持一致。综上所述，本实施例的FCV-ORF2四个碱基锁核酸修饰引物特异性好，能有效地扩增出目的片段，且没有非特异性扩增片段产生。
实施例2 FCV PCR扩增结合核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒
将用于对猫杯状病毒（FCV）核酸进行PCR检测的修饰引物FCV-ORF2-F（10μM）40μL，FCV-ORF2-R（10μM）40μL以及预混液 250μL、2mM 脱氧核糖核苷酸 250μL、Mn2+ 60μL、扩增酶15μL、FCV质粒DNA（30ng/μL）20μL、超纯水1.5mL、上样样品稀释液5mL、成品试纸条48条共同包装，得到猫杯状病毒（FCV）PCR产物核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒。
综上所述，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，可用于猫杯状病毒的快速检测，应用前景广阔。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/ 或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 苏州蝌蚪生物技术有限公司
<120> 用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
tggcaatcgc ttttggagtg at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ttagatcatt accctcaacc gt 22

Claims (9)

1.一种用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，适于特异性扩增猫杯状病毒的ORF2基因靶标区域，其特征在于，包括：
正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
并且，所述正向引物、反向引物的每个序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是相应序列的3'末端碱基，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3-6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为腺嘌呤和/或胸腺嘧啶。
2.根据权利要求1所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，其特征在于：从5’末端到3'末端方向，所述正向引物中锁核酸的修饰位点分别为第6位的腺嘌呤、第11位的胸腺嘧啶、第17位的腺嘌呤、第22位的胸腺嘧啶。
3.根据权利要求1所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，其特征在于：从5’末端到3'末端方向，所述反向引物中锁核酸的修饰位点分别为第6位的胸腺嘧啶、第11位的腺嘌呤、第17位的腺嘌呤、第22位的胸腺嘧啶。
4.根据权利要求1所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，其特征在于：所述正向引物、反向引物的5’末端均标记有化学基团。
5.根据权利要求4所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，其特征在于：所述正向引物的5’末端所标记的化学基团与所述反向引物的5’末端所标记的化学基团不同。
6.根据权利要求5所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，其特征在于：所述正向引物的5’末端均标记有Biotin基团。
7.根据权利要求5所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物，其特征在于：所述反向引物的5’末端均标记有FITC基团。
8.一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1-7中任一项所述的用于检测猫杯状病毒的扩增引物组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括猫杯状病毒核酸捕获金标试纸条。
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