JP2003144182A

JP2003144182A - ヒトパピローマウイルスの短鎖ヌクレオチド配列

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Publication number: JP2003144182A
Application number: JP2002244278A
Authority: JP
Inventors: Jeffrey L Joseph; ジェフリー・エル・ジョゼフ; Stanley R Bouma; スタンリー・アール・ボーマ; Ronald L Marshall; ロナルド・エル・マーシャル; Thomas G Laffler; トーマス・ジー・ラフラー
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2003-05-20
Also published as: DE69121821D1; GR3021724T3; EP0477972B1; TW205568B; DE69121821T2; CA2052413A1; EP0477972A3; CA2052413C; ATE142276T1; AU8482691A; EP0477972A2; KR920006510A; JP2001231587A; ES2094178T3; JPH04281791A; AU650055B2; DK0477972T3

Abstract

(57)【要約】【目的】増幅させることができ、試料中のＨＰＶの存
在の検出のために使用することのできるＤＮＡのオリゴ
ヌクレオチド鎖を提供する。【構成】４つのオリゴヌクレオチドプローブのセット
からなる、試料中に存在するヒトパピローマウイルスの
ＤＮＡを増幅させるためのＬＣＲに使用するのに有用な
組成物；該組成物およびリガーゼからなることを特徴と
する、試料中のヒトパピローマウイルスＤＮＡの存在を
検出するためのキット；長さが約１０〜約６０ヌクレオ
チドである、ヒトパピローマウイルス６型、１１型、１
６型、１８型および３３型とハイブリダイズさせるため
の共通オリゴヌクレオチド；ヒトパピローマウイルス６
型、１１型、１６型、１８型および３３型の存在を決定
するための型特異的オリゴヌクレオチド；ヒトパピロー
マウイルス６型、１１型、１６型、１８型および３３型
とハイブリダイズさせるための共通オリゴヌクレオチド
および該オリゴヌクレオチドを用いたヒトパピローマウ
イルスの検出のためのキットおよび方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般にヒトパピローマ
ウイルス(ＨＰＶ)の検出方法に関する。さらに詳しく
は、ヒトパピローマウイルスの短鎖ヌクレオチド配列お
よび該配列を用いたＨＰＶの検出方法に関する。本発明
のヌクレオチド配列は、増幅することができ、および／
または試料中のヒトパピローマウイルス産物の存在の決
定に用いることができ、また増幅することができ、試料
中に存在する６型、１１型、１６型、１８型、３１型、
３３型および６１型のヒトパピローマウイルスの特定の
型の決定に用いることができる。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
パピローマウイルス(ＨＰＶ)は、頸部癌およびその前駆
体病変の病因をしばしば伴う肛門生殖器の性器伝播疾患
と認められている。５６以上の型のＨＰＶが特徴付けら
れている。これらの型のうち、少なくとも２１の型が肛
門生殖器に感染する[グレゴワール(L. Gregoire)ら、J.
Clin. Micro.２７(１２)：２６６０〜２６６５(１９８
９)]。これら向粘膜性(mucosotropic)ウイルスは、一層
しばしば良性のコンジロームまたは潜伏感染を伴う。し
かしながら、前癌性病変および浸潤性癌(とりわけ頸部
における)中のＨＰＶの存在は、これらウイルスが腫瘍
原性である可能性を反映しているのかもしれない[ハウ
リー(P. M. Howley)、インポータント・アドバンスィズ
・イン・オンコロジー(Important Advances inOncolog
y)、デゥ・ビタ(D. T. DeVita, Jr.)ら編、ジェー・ビ
ー・リッピンコット(J. B. Lippincott)、フィラデルフ
ィア、ペンシルベニア州、５５〜７３頁参照]。

【０００３】ある種のＨＰＶ型、すなわちＨＰＶ１６型
および１８型、および頻度は劣るがＨＰＶ３１型、３３
型および３５型は、浸潤性の頸部癌およびその転移部位
に高比率で認められている。しかしながら、肛門生殖器
に感染する多くのＨＰＶ、たとえば６型や１１型などは
普通、良性のコンジローム中に認められ、浸潤性癌中に
はごくまれにしか認められていない。肛門生殖器中で検
出されるＨＰＶは、特定のＨＰＶ型が悪性腫瘍に付随す
ることに基づいて、大きく低リスクパピローマウイルス
(ＨＰＶ６型および１１型)、中リスクパピローマウイル
ス(ＨＰＶ３１型、３３型および３５型)または高リスク
パピローマウイルス(ＨＰＶ１６型および１８型)に分類
することができる[ロリンツ(A. T. Lorincz)ら、J. Na
t'l. Cancer Inst.,７９：６７１(１９８７)]。それゆ
え、ＨＰＶの存在を検出しＨＰＶの特定の型を決定する
ことにより、あるＨＰＶ型に付随する臨床的重要性(cli
nical significance)を決定するのに有用な診断および
予後手段を提供することが可能である。また、高感度か
つ特異的な試薬および方法により早期にＨＰＶを検出す
ることによっても、早期の管理およびカウンセリングを
提供することができるであろう。

【０００４】それゆえ、臨床試料中のＨＰＶを同定およ
び型決定するための正確かつ信頼性の高い方法に対する
必要性が存在する。しかしながら、破砕ビリオンで動物
を免疫することにより調製した公知のポリクローナル抗
血清では、皮膚および粘膜のゆうぜいのわずかに約３０
〜７０％においてしかＨＰＶ抗原を検出することができ
ない。さらに、抗血清は広く交差反応を起こす。現在利
用できる免疫学的試験は２つの主要な欠点を有する。第
一に、充分に分化した細胞しかウイルス抗原を表出でき
ないように思われる。高度の腫瘍形成を示すＨＰＶ感染
組織(たとえば、癌部位など)は、ＨＰＶ抗原を含有する
ことが希である。それゆえ、悪性腫瘍が進行すればする
ほど、被験組織中で検出できるウイルスの量は少なくな
ることになる。第二に、これら免疫学的試験は特定のウ
イルス型を同定することができない。

【０００５】パピローマウイルス群は、主要なカプシド
タンパク質において共通のアミノ酸配列を有しているこ
とが知られている[たとえば、ベーカー(C. C. Baker)、
ザ・パポバビリダエ(The Papovaviridae)(Vol.２)、ハ
ウリーおよびザルツマン(N. P. Salzman)編、プレナム
・パブリッシュ・コーポレーション(Plenum Publ. Cor
p.)、ニューヨーク(１９８７)、３２１〜３８５頁参
照]。このウイルスのＤＮＡはクロスハイブリダイズ
し、相同配列を示す[ロー(M. F. Law)ら、J. Virol.５
８：２２５〜２２９(１９７９)]。それゆえ、臨床試料
中のＨＰＶＤＮＡおよびＲＮＡの検出および識別のた
めの一層高感度で特異的な手段として、分子ハイブリダ
イゼーション法が開発されている[ロリネツ(A. T. Lori
nez)、Obstetrics and Gynecol. Clinics of N. Americ
a１４：４５１(１９８７)]。

【０００６】ヒトパピローマウイルスのＤＮＡおよびＲ
ＮＡに特異的な配列は知られており、出版されている
[たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／６９９４０(１９８９
年１０月１９日公開)、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０５８１
６(１９８６年１０月９日公開)およびヨーロッパ特許出
願第０３０１９６８号(１９８９年２月１日公開)参
照]。

【０００７】相同なＤＮＡ配列を検出するために使用す
る分子ハイブリダイゼーション法は、特定ＨＰＶ型にし
かない核酸配列に結合するプローブとともに使用した場
合には、高度に特異的となり得る。しかしながら、所定
の臨床試料中の全ウイルスＤＮＡの濃度は、該試験の感
度の限界を下回っているかもしれない。たとえば、異形
成頸部病変中のウイルスＤＮＡの量は、異形成が増大す
るにつれて減少する。

【０００８】この感度の問題を克服するため、たとえば
複製連鎖反応(ＰＣＲ)法やリガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)法
を使用することによりウイルスＤＮＡ配列を増幅させる
ことができる。かくして得られた生成物を、サザーンブ
ロッティングなどのウイルス型の同定のための通常のハ
イブリダイゼーション法により同定することができる
[オステ(C. Oste)、Biotechniques ６：１６３(１９８
８)、マリス(K. B. Mullis)、米国特許第４,６８３,２
０２号、およびＥＰ−Ａ−３２０３０８(バイオテクニ
カ)参照]。

【０００９】ＰＣＲおよびＬＣＲの両方とも、試料中に
存在するＤＮＡを検出可能なレベルまで増幅させる。実
際には、感度レベルは、試料当たり約５０〜１００コピ
ーである。その次に感度の良好な方法はドット−ブロッ
ティング法であり、この方法は約１０,０００分子を検
出することができる。一方、サザーンブロッティング法
では、試料当たり約１００,０００コピーのＤＮＡが信
頼性をもって検出される。

【００１０】それゆえ、適当なＨＰＶの診断には２つの
工程が必要となる。一つのやり方として、まず臨床的に
関連のあるＨＰＶ型の存在を群特異的プライマーを用い
て検出する。ＨＰＶの存在を検出した後、該群のＨＰＶ
間で低い相同性を有する型特異的プローブを用いて型間
での識別を行うことができる。別法として、最初に型特
異的プローブの混合物を用いて識別を行うことができ
る。ただし、これらプローブはそれぞれ独立にＤＮＡを
増幅することができなければならず、また独立に検出す
ることができなければならない。過去においては、その
ようなことは特異的抗体を用いて行った。一般に、核酸
プローブおよびプライマーは抗体に比べてサブタイプ間
の識別を一層顕著に行うことができる。このようなＤＮ
Ａに基づく試験の使用により、従来の抗体に基づく試験
に比べて感度および特異性の両方を向上させることがで
きる。

【００１１】それゆえ、増幅させることができ、試料中
のＨＰＶの存在の検出のために使用することのできるＤ
ＮＡのオリゴヌクレオチド鎖を提供することが有利であ
る。また、増幅させることができ、試料中の特定のＨＰ
Ｖ型の存在の検出のために使用することのできるＤＮＡ
の短いオリゴヌクレオチド鎖を提供することが有利であ
る。オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせての使用は、試
料中に存在するＨＰＶおよびその特定の型の特異的かつ
高感度のインビトロ診断を可能にするのに有利である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、約１０〜約６
０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを提供す
るものであり、本発明のヌクレオチドは、増幅すること
ができ、特定の型のヒトパピローマウイルスの特定配列
の検出か、または異なる型の間で高い相同性を示す共通
領域の検出に用いることができる。ＨＰＶの存在の決定
は、ＨＰＶ６型、１１型、１６型、１８型、３１型、３
３型および６１型の存在を検出するために提供される配
列に試料を接触させることにより行う。この決定は、た
とえばＰＣＲまたはＬＣＲにより前以て増幅するかまた
は増幅することなく行う。型特異的な増幅および共通増
幅のいずれも可能である。これら公知の増幅手順に従っ
て、ＰＣＲにより配列を増幅させる場合には２つのオリ
ゴヌクレオチドを用意し、ＬＣＲにより増幅させる場合
には４つのオリゴヌクレオチドを用意する。

【００１３】ＨＰＶの存在が検出されたら、その後にＨ
ＰＶ型特異的プローブを用いて行うＰＣＲまたはＬＣＲ
によって試料中に存在するＨＰＶ型を決定することがで
きる。別法として、型特異的ＨＰＶの存在はまた、ＨＰ
Ｖ６型、１１型、１６型、１８型、３１型、３３型およ
び６１型の検出のために本発明により提供される型特異
的ヌクレオチド配列に試料を直接接触させることによっ
ても決定することができる。本発明はまた、該オリゴヌ
クレオチドを用いた、ヒトパピローマウイルスの増幅お
よび検出のため方法およびキットをも提供する。

【００１４】適切なＨＰＶの診断には２つの条件が必要
である。第一の条件は、関係するすべての型の検出を可
能とし、第二の条件は、それら型間での識別を可能とす
る。過去においては、そのようなことは特異的抗体を用
いて行っていた。一般に、核酸プローブおよびプライマ
ーは、抗体に比べてサブタイプ間での識別を一層顕著に
行うことができる。それゆえ、ＤＮＡに基づく試験は、
抗体に基づく試験に比べて感度および特異性の両方とも
向上している。

【００１５】米国特許第４,６８３,１９５号および同第
４,６８３,２０２号には、ＰＣＲを用いてＤＮＡ配列を
増幅させる方法が教示されている。この方法は、いまや
多くの分子生物学研究機関での標準法となっている。下
記実施例１〜４では、これら２つの特許に記載された手
順および市販のジーン−アンプ^TMキットの使用説明書に
記載された方法(書類Ｎｏ.５５６３５−６／８９、パー
キン−エルマー／シータス、エメリービル、カリフォル
ニア州)を利用した。

【００１６】ＰＣＲにおいては、２つの相補的なポリヌ
クレオチド鎖を２つのオリゴヌクレオチドプライマーで
処理して、各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長生成
物が合成されるようにする。これらプライマーは、いっ
たん一方のプライマーの伸長生成物が鋳型から分離され
たら、該一方のプライマーの伸長生成物が他方のプライ
マーからの伸長生成物の合成のための鋳型となるように
選択する。連鎖反応は、プライマー伸長生成物を鋳型か
ら変性させ、得られた一本鎖分子を同じプライマーと再
アニールさせ、ついで該プライマーからさらに伸長生成
物を生成させるというサイクルにより維持される。この
サイクルは、目的核酸断片が検出可能な濃度まで増加す
るまで、いかに多くの回数でも繰り返すことができる。

【００１７】かくして増幅した目的配列は、幾つかの公
知方法のいずれかにより検出することができる；たとえ
ば、ＰＣＲにより生成した二本鎖生成物を変性させ、つ
いで該伸長生成物とハイブリダイズする１または２以上
のリポータープローブで処理することにより検出するこ
とができる。このリポータープローブは検出可能な標識
を有しており、通常、過剰に加える。それゆえ、ハイブ
リダイズしなかったリポータープローブは、ハイブリダ
イズしたリポータープローブから分離工程により分離し
なければならない。リポータープローブおよび分離工程
を用いない伸長生成物の他の検出方法では、臭化エチジ
ウムで染色したゲルにより伸長生成物を検出する。ＤＮ
Ａをニトロセルロースに移し、試料中に存在すると思わ
れるＨＰＶ型に特異的なプローブを用いて釣り上げる(p
robing)ことにより診断を確認することができる。

【００１８】ＰＣＲを用いた別法では、ＨＰＶＤＮＡ
内の既知制限部位を利用し、１種または２種以上の制限
エンドヌクレアーゼで生成した開裂パターンを調べるこ
とにより、増幅ＤＮＡが予想配列を含んでいることを示
すことができる。２つの理由から、増幅配列の真正さを
確かめる必要がある。すなわち、(１)増幅プライマーに
相補的な配列が、ＨＰＶＤＮＡを含有しない細胞ＤＮ
Ａ中に偶然に存在するものではないことを確認するた
め、および(２)試料中に存在するＨＰＶ型を同定するた
め、である。増幅のために選択した配列がＨＰＶ型間で
保存されているならば、増幅配列を見いだしても特定の
ＨＰＶ型を示すことにはならない。

【００１９】また、これら２つのプライマーの結合部位
に基づいて、増幅生成物のサイズの予測が可能でなけれ
ばならない。それゆえ、生成物が認められた場合には、
ＨＰＶが存在することが妥当に確実でなければならな
い。しかしながら、２つの異なるＨＰＶ型からは、同じ
かまたは異なるサイズの生成物が得られるかもしれな
い。それゆえ、得られた結果の解釈が信頼のおけるもの
であるという確信が得られるまでは、増幅配列の同定を
確認するためハイブリダイゼーションを行うべきであ
る。また、ＰＣＲ法ではゲノムの小さな部分しか分析さ
れないので、相同性の高いプライマーが存在しない限
り、密接に関連した配列すなわち型特異的な配列しか同
定できないことに注意すべきである。

【００２０】他の特に有用な検出法は、ＥＰ−Ａ−３５
７０１１号に記載されている。この方法では、異なるリ
ポーター分子、たとえばハプテンを各プライマーに結合
させる。増幅後、変性前に、ハプテン(ハプテン１)を抗
ハプテン１抗体コーティング固相で「捕捉する」ことによ
り検出することができる。分離された複合体は、標識と
抗ハプテン２抗体との結合体により検出することがで
き、固相に付随する標識を測定する。

【００２１】リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)は、ＤＮＡの切
片をコピーし、ＤＮＡの切片のコピーをコピーし、以下
これを何度も繰り返すことにより該ＤＮＡの切片を増幅
させる。この方法は、ヨーロッパ特許出願第０３２０３
０８号(１９８９年６月１４日公開)に記載されている。
この方法では、目的配列中のすぐ隣合わせの領域に相補
的な２つのプローブ(たとえば、ＡおよびＢ)をハイブリ
ダイズさせ、ライゲートさせる。かくしてライゲートし
たプローブを、ついで該目的配列から変性して分離さ
せ、その後、最初のプローブＡおよびＢとは反対のセン
スの別の２つのプローブ(Ａ'およびＢ')とハイブリダイ
ズさせる。ついで、これら第二のプローブ間でライゲー
トさせる。その後、変性／ハイブリダイゼーション／ラ
イゲーションのサイクルを繰り返して、センス(＋)およ
びアンチセンス(−)の両方の２倍長プローブを生成させ
る。

【００２２】ＬＣＲ法では、試料核酸は、一本鎖ＤＮＡ
として提供するか、または二本鎖ＤＮＡとして提供して
それを変性して各鎖に分離させる。４つのプローブを用
いる。最初の２つのプローブ(ＡおよびＢ)は、いわゆる
主プローブであり、その次の２つのプローブ(Ａ'および
Ｂ')は、いわゆる副プローブである。第一プローブ(Ａ)
は、目的ヌクレオチド配列の主鎖の第一部分とハイブリ
ダイズし得る一本鎖である。第二プローブ(Ｂ)は、目的
ヌクレオチド配列の主鎖の第二部分とハイブリダイズす
ることができる。これらプローブが目的ヌクレオチド配
列の主鎖にハイブリダイズしたときに第一プローブの
３'末端と第二プローブの５'末端とが結合できるよう
に、目的配列の主鎖の第一部分の５'末端と目的配列の
主鎖の第二部分の３'末端とが相対して位置している。

【００２３】第三のプローブ(Ａ')は該第一のプローブ
とハイブリダイズすることができ、第四のプローブ
(Ｂ')は該第二のプローブとハイブリダイズすることが
できる。これらハイブリダイズしたプローブは、ライゲ
ートさせて再構成した融合プローブ配列を生成させる。
ついで、試料中の該ＤＮＡを変性させて、試料ＤＮＡか
らライゲートしたプローブを分離させる。引き続き上記
ライゲートプローブおよび目的ＤＮＡを上記手順に供す
るサイクルを繰り返し行って、試料中の検出可能なＤＮ
Ａの量を増加させる。サイクルを行う回数は、使用した
配列および試験に必要な感度に依存する。通常、１５〜
６０回のサイクルを行う。少なくとも一つのプローブを
シグナル生成化合物と結合させることができる。

【００２４】上記４つのプローブを適当な結合成分に結
合してある場合は、増幅生成物の検出は、当業者に知ら
れた標準的な手動または自動イムノアッセイ法により行
うことができる。これら方法の例としては、たとえば、
イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡおよび
ＭＥＩＡなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションは
また、当該技術分野で知られたドットブロッティング
法、スロットブロッティング法またはレプリカブロッテ
ィング法に従って行うことができる。

【００２５】これら配列は適当なシグナル生成化合物
(標識)で標識することができる。該シグナル生成化合物
(標識)は、外部手段により検出できる測定可能なシグナ
ルを生成させることができる。本発明で用いることので
きる種々のシグナル生成化合物の例としては、色原体；
酵素などの触媒；フルオレセインおよびローダミンなど
の発光化合物；化学発光化合物；³²Ｐなどの放射性元
素；および当業者に知られた他の標識などが挙げられ
る。特定の標識を選択することは重要ではないが、標識
はそれ自体かまたは１または２以上の他の物質と組み合
わせるかによってシグナルを生成することができなけれ
ばならない。

【００２６】標識および特異的結合成分から種々の異な
る指示試薬を調製することができる。標識および特異的
結合成分のいずれかを変えることができる。指示試薬中
に用いることのできる特異的結合成分の例としては、抗
体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および
それらのフラグメントを含む)、アビジンまたはビオチ
ン、ビオチンおよび抗−ビオチン抗体、炭水化物または
レクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子
またはレセプター分子、酵素補助因子または酵素、酵素
インヒビターまたは酵素、あらゆる抗原性物質、ハプテ
ン、抗体、およびそれらの組み合わせなどが挙げられ
る。

【００２７】試料は、ＨＰＶを含有していると思われる
すべての生物学的物質であってよい。それゆえ、試料
は、人体組織であってよく、またはＨＰＶを含有してい
ると思われる細胞を含む試料であってよい。

【実施例】つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。なお、実施例中に使用した略語は下記のとおりであ
る。

【００２８】ＴＲＩＳ：[トリス(ヒドロキシメチル)ア
ミノメタン]の略(緩衝液として使用) ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸の略(キレート化剤) ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネートの略(蛍
光ハプテン誘導体) ＮＨＳ−エステル：Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエス
テルの略ＭＥＳ：[２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸]の略
(緩衝液) ＴＷＥＥＮ^R−２０：アトラス・ケミカル(Atlas Chemic
al)社のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
の商標名(界面活性剤) ＢＩＳ−ＴＲＩＳ：[ビス−(２−ヒドロキシエチル)ア
ミノ]トリス(ヒドロキシメチル)メタンの略(緩衝液) ＴＲＩＴＯＮＸ−１００^R：ローム・アンド・ハース(R
ohm & Haas)社のノナエチレングリコールオクチルフェ
ノールエーテルの商標名(界面活性剤) ＩＭｘ^R：アボット・ラボラトリーズ社の微細粒子酵素
イムノアッセイ(ＭＥＩＡ)を行うための自動装置の商標
名

【００２９】実施例１市販のジーン−アンプ^TMキットの使用説明書(書類Ｎｏ.
５５６３５−６／８９、パーキン−エルマー／シータ
ス、エメリービル、カリフォルニア州から入手可能)に
実質的に従ってＰＣＲを行った。下記試薬を０.５ｍｌ
容のポリプロピレンチューブ中で混合し、ＰＣＲを行う
のに使用した。

【００３０】試薬最終濃度水 (最終容量を５０μＬまたは１００μＬとする) 反応緩衝液１０ｍＭＴＲＩＳｐＨ８.３５０ｍＭＫＣｌ１.５ｍＭＭｇＣｌ₂ ０.０１％ゼラチンｄＮＴＰ混合物各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰＰＣＲ１１μＭＰＣＲ２１μＭプラスミド１０μＬ１ｎｇ／１００μＬ (またはコントロール−ヒト胎盤ＤＮＡ(プールした胎盤ＤＮＡ、カタログＤ−３２８７、シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州)) ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス(Thermus Acquaticus) ２５または６３.９単位／１ｍＬ

【００３１】混合後、反応混合物に鉱油(１００μＬ)を
重層した。ついで、幾つかの温度にてインキュベーショ
ンすることが可能な装置中に該チューブを入れ、プログ
ラムした温度変化を３０または４０サイクル行った。正
確な温度変化のサイクル数および使用した装置は、各実
験に依存して変わり、その詳細は実施例３に記載する。

【００３２】実施例２実施例１の手順に従い、下記配列がＰＣＲ法によりパピ
ローマウイルス６型、１１型、１６型、１８型、３１
型、３３型および６１型の切片を増幅させることがわか
った。

【化１３】配列ＩＷＤＯは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／００６２
９(ＷＯ８６／０５８１６)に開示された配列に由来す
る。

【００３３】下記配列が、ＰＣＲ法によりパピローマウ
イルス６型、１１型、１６型、１８型および３１型の切
片を増幅させることがわかった。下記表１は、配列と該
配列の各種型中での位置を示す。

【化１４】表１(プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いるこ
とのできる配列)

【表１】

【００３４】実施例３ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
する直鎖状プラスミドを目的鎖として用いた。これら
は、ｐＨＰＶ６.１(ＨＰＶ６)、ｐＳＰ６５.１１.５(Ｈ
ＰＶ１１)、ｐ６５.１６.８(ＨＰＶ１６)、ｐＨＰＶ１
８Ｈ(ＨＰＶ１８)、ｐＧ３.ＨＰＶ３１(ＨＰＶ３１)、
ｐＬＮＫ３２２.ＨＰＶ３３(ＨＰＶ３３)およびｐＢＲ
３２２.ＨＰＶ６１(ＨＰＶ６１)であった。インキュベ
ーション装置としては、プログラマブルサイクリックリ
アクター(Programmable Cyclic Reactor)^TM(エリカンプ
(Ericomp)、サンジエゴより入手可能)を用いた。実施例
１に記載したＰＣＲ法に従い、０.０８９ＭＴＲＩＳ、
０.０８９Ｍホウ酸塩、２ｍＭＥＤＴＡ、および０.５ｐ
ｐｔ臭化エチジウムを含有する緩衝液中、アガロース
(ヌシーブ(NuSieve)^R：シーケム(SeaKem)^RＧＴＧを５：
３の比率で含有、ＦＭＣコーポレーション、ロックラン
ド、メイン州より入手可能)により電気泳動により１０
μＬアリコートを分析した。

【００３５】図１は、ＤＮＡサーマルサイクラー^TM(パ
ーキン−エルマー／シータス、エメリービル、カリフォ
ルニア州)中で６３.９単位／ｍＬのＤＮＡポリメラーゼ
を用いて得られた結果を示す、臭化エチジウム染色１.
２％アガロースゲルの写真の模式図である。試料を９４
℃で５分間加熱し、ついで、９４℃で１分間、４０℃で
２分間および７２℃で１.５分間の温度プログラムに４
０サイクル供した。この場合に使用したＰＣＲプライマ
ーは、実施例２のＰＣＲ１およびＰＣＲ５であった。電
気泳動後のゲルを調べたところ、予測された位置、すな
わち２９２ｂｐにバンドが示された［レーン１、ＨＰＶ
６；レーン２、ＨＰＶ１１；レーン３、ＨＰＶ１６；レ
ーン４、ＨＰＶ１８；レーン５、ＨＰＶ３１；レーン
６、ＨＰＶ３３；レーン７、ＨＰＶ６１；レーン８、プ
ールしたヒト胎盤ＤＮＡ(ＨＰＶ感染を含むと思われ
る)；レーン９、分子量マーカー：ΦＸ１７４のＨａｅ
ＩＩＩ消化物］。

【００３６】図２は、プログラマブルサイクリックリア
クター^TM(エリカンプ、サンジエゴ、カリフォルニア州)
中で２５単位／ｍＬのＤＮＡポリメラーゼを用いて得ら
れた結果を示す、臭化エチジウム染色４％アガロースゲ
ルの写真の模式図である。この場合は、試料を、５０℃
で１分間、７２℃で２分間および９５℃で１分間の温度
プログラムに３０サイクル供した。この場合は、プラス
ミドｐ６５.１６.８(ＨＰＶ１６)を増幅させるため、実
施例２のプライマーＰＣＲ１、ＰＣＲ２、ＰＣＲ３、Ｐ
ＣＲ４およびＰＣＲ５を用いた。図２のゲルは、予測さ
れた位置、すなわちＰＣＲ１およびＰＣＲ４は２３５ｂ
ｐ、レーン２；ＰＣＲ１およびＰＣＲ５は２６７ｂｐ、
レーン４；ＰＣＲ２およびＰＣＲ４は２５４ｂｐ、レー
ン６；ＰＣＲ２およびＰＣＲ５は２８６ｂｐ、レーン
８；ＰＣＲ３およびＰＣＲ４は１７４ｂｐ、レーン１
０；ＰＣＲ３およびＰＣＲ５は２０６ｂｐ、レーン１
２；分子量マーカー、１２３、２４６、３６９、４９
２、・・・ｂｐ、レーン１にそれぞれバンドを示してい
る。

【００３７】図３は、図１と同じ条件で得られた結果を
示す、臭化エチジウム染色１.２％アガロースゲルの写
真の模式図である。この場合は、プライマーとしてＰＣ
Ｒ１４およびＰＣＲ１５をＩＷＤＯとともに用いた。Ｐ
ＣＲ１４およびＩＷＤＯの増幅ＰＣＲ生成物の予測され
るサイズは、試験したＨＰＶのすべての型において４３
７ｂｐである。ＰＣＲ１５およびＩＷＤＯの生成物の予
測されるサイズは、９８ｂｐである。これらサイズの生
成物はゲル中に認められ、ＰＣＲ１４およびＰＣＲ１５
をＩＷＤＯとともに用いた場合に６型、１１型、１６
型、１８型、３１型、３３型および６１型のＨＰＶＤ
ＮＡを増幅することが確認された。

【００３８】図３において、レーン１は分子量マーカー
(ΦＸ１７４のＨａｅＩＩＩ消化物)；レーン２〜９はＰ
ＣＲ１４＋ＩＷＤＯであり、レーン２はＨＰＶ６、レー
ン３はＨＰＶ１１、レーン４はＨＰＶ１６、レーン５は
ＨＰＶ１８、レーン６はＨＰＶ３１、レーン７はＨＰＶ
３３、レーン８はＨＰＶ６１、レーン９はＨＰＶに感染
していると思われるヒト胎盤ＤＮＡ；レーン１０〜１７
はＰＣＲ１５＋ＩＷＤＯであり、レーン１０はＨＰＶ
６、レーン１１はＨＰＶ１１、レーン１２はＨＰＶ１
６、レーン１３はＨＰＶ１８、レーン１４はＨＰＶ３
１、レーン１５はＨＰＶ３３、レーン１６はＨＰＶ６
１、レーン１７はＨＰＶに感染していると思われるヒト
胎盤ＤＮＡ；レーン１８は分子量マーカー(ΦＸ１７４
のＨａｅＩＩＩ消化物および１ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ
消化物)である。

【００３９】実施例４２つの工程、すなわち非特異的な増幅と特異的な検出を
同時に行わうことができる領域として、４つの領域を選
択した。これら４つの領域の境界部分には、１セットの
プライマーを用いたＰＣＲによりＨＰＶ６型、１１型、
１６型、１８型または３３型のいずれをも増幅すること
ができるように、高相同性の領域が含まれていた。ま
た、これら４つの領域の内部には、これらパピローマウ
イルス型のいずれか一つに特異的なプローブがその特異
的な相補的な相手にはハイブリダイズするが他の相手と
はハイブリダイズしないように、低相同性の領域が含ま
れていた。

【００４０】本実施例に記載する４つの領域を利用する
ことができるように、組み合わせて用いるべく下記セッ
トの配列をデザインした。各セット中のＰＣＲｎで示さ
れる２つのものは、パピローマウイルス６型、１１型、
１６型、１８型および３３型のいずれをも認識する。他
のＰＲＯＢＥｎで示されるものは、特定セット中のもの
と一緒に用いて１つの特定の型のみを認識する。下記表
２〜５は、配列および種々の型における位置を示す。

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【００４１】表２((１)普遍プローブまたはＰＣＲプラ
イマーとして用いることのできる配列および(２)型特異
的プローブとして用いることのできる配列；セット
「ａ」)

【表２】表３((１)普遍プローブまたはＰＣＲプライマーとして
用いることのできる配列および(２)型特異的プローブと
して用いることのできる配列；セット「ｂ」)

【表３】表４((１)普遍プローブまたはＰＣＲプライマーとして
用いることのできる配列および(２)型特異的プローブと
して用いることのできる配列；セット「ｃ」)

【表４】表５((１)普遍プローブまたはＰＣＲプライマーとして
用いることのできる配列および(２)型特異的プローブと
して用いることのできる配列；セット「ｄ」)

【表５】

【００４２】実施例５共通配列を選択するために開発した独特の手法に従い、
配列を選択した。下記配列がかくして選択した共通配列
であり、それぞれヒトパピローマウイルス６型、１１
型、１６型、１８型および３３型のそれぞれとハイブリ
ダイズする。これら配列は独特の部位でハイブリダイズ
し、その位置を下記表６および７に示す。

【表６】

【表７】

【００４３】実施例６リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)のため、下記試薬を０.５ｍ
Ｌ容ポリプロピレンチューブ中で混合した。試薬容量最終濃度水２１μＬ反応緩衝液１０μＬ５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７.８１０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ１０ｍＭＭｇＣｌ₂ １００ｍＭＫ⁺(あらゆる採取源から) ０.００１％ＢＳＡ１ｍＭＤＤＴ

【００４４】ニコチンアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ) ０.５μＬ１００μＬプローブＡ(センス) ４μＬ５.０×１０¹¹分子プローブＡ'(アンチセンス、５'−リン酸) ４μＬ７.５×１０¹¹分子プローブＢ(センス、５'−リン酸) ４μＬ７.５×１０¹¹分子プローブＢ'(アンチセンス) ４μＬ５.０×１０¹¹分子目的配列(１０μg/mLのヒト胎盤担体ＤＮＡを含有) １.５μＬ１５ｎｇ／５０μＬＤＮＡリガーゼ、サーマス・サーモフィルス(Ther- mus thermophilus) １μＬ

【００４５】この反応混合物に鉱油(３０μＬ)を重層し
た。幾つかの温度にてインキュベーションすることが可
能な装置[たとえば、コイ・ラボラトリー・プロダクツ
(CoyLaboratory Products)(アンアーバー、ミシガン州)
から入手した熱サイクラーまたはプログラマブルサイク
ラーリアクター^TM(エリカンプ、サンジエゴ、カリフォ
ルニア州より入手可能)]中に上記チューブを入れ、幾つ
かのサイクルのプログラムした温度変化に供した。各サ
イクルは、５０℃で１分間および８５℃で１分間であっ
た。

【００４６】実施例７リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)を行う際に、ヨーロッパ特許
出願公開第０３２０３０８Ａ２に記載の下記手順を用い
た。実施例６の試薬を用いて下記手順を行った。目的配
列中のすぐ隣の領域に相補的な２つのプローブ(Ａおよ
びＢ)をハイブリダイズさせ、ライゲートした。このラ
イゲートしたプローブを変性させて鋳型配列から分離さ
せ、最初のプローブ(ＡおよびＢ)とはセンスが反対の別
の２つのプローブ(Ａ'およびＢ')とハイブリダイズさせ
た。ついで、これら第二のプローブをライゲートさせ
た。その後、変性／ハイブリダイゼーション／ライゲー
ションのサイクルを行って、＋および−の両方のセンス
の２倍長プローブを生成させた。

【００４７】実施例８実施例６および７に記載の手順に従い、下記配列がＨＰ
Ｖ１６型のＬ１領域部分を増幅させることがわかった。

【化１９】

【００４８】実施例９完全長のパピローマウイルス１６型挿入を含有する直鎖
状プラスミド(ｐ６５.１６.８；ＨＰＶ１６)を目的配列
として用いた。ＬＣＲ１(実施例８)は、５'末端に³²Ｐ
−リン酸を含んでいた。使用した熱サイクラー(幾つか
の温度でインキュベーションを行うことができる)はコ
イ・ラボラトリー・プロダクツ(アンアーバー、ミシガ
ン州)から入手した。実施例６および７に記載のＬＣＲ
サイクルを行った後、０.０８９ＭＴＲＩＳ、０.０８
９Ｍホウ酸塩および２ｍＭＥＤＴＡ中、４％アガロー
ス(ヌシーブ^R：シーケム^RＧＴＧを５：３の比率で含
有、ＦＭＣコーポレーション、ロックランド、メイン州
より入手可能)を用いた電気泳動により１０μＬアリコ
ートを分析した。

【００４９】図４は、オートラジオグラムの写真を示す
模式図である。レーン１および２は、ＨＰＶ１６型目的
配列の不在下でのＬＣＲを示す。レーン３および４は、
１０ ⁴分子のｐ６５.１６.８の存在下でのＬＣＲを示
す。レーン５および６は、１０⁶分子のｐ６５.１６.８
の存在下でのＬＣＲを示す。すべてのレーンは約２４〜
２５ｂｐのバンド(ライゲートしていないプローブに対
応)の存在を示している。レーン１〜４では約５０ｂｐ
でのバンド(ライゲートしたＬＣＲプローブに対応)は非
常にわずかであるが、レーン５および６では該サイズの
強度のバンドが示されていることが観察できる。

【００５０】実施例１０目的配列、サイクラーおよび配列は実施例８および９の
ものと同じであった。プローブとして使用したオリゴヌ
クレオチドの幾つかは、ライゲーションから遠位末端に
化学標識を共有結合により結合させておいた。これら標
識は、５'−フルオレセイン−ＬＣＲ１Ａ、３'−フルオ
レセイン−ＬＣＲ１Ａ'、３'−ビオチン−ＬＣＲ１Ｂお
よび５'−ビオチン−ＬＣＲ１Ｂ'であった。共有結合は
標準法、すなわち、カンサル(Kansal)らのTet. Letters
２９：５５３７〜５５４０(１９８８)に記載の方法に
実質的に従ってアミン末端オリゴヌクレオチドをＦＩＴ
Ｃまたはビオチン−ＮＨＳ−エステルと反応させること
により行った。

【００５１】実施例６および７に記載のＬＣＲを行った
後、ヨーロッパ特許出願公開第０２６２３２８号に記載
のイムノクロマトグラフィー検出システムを用いて混合
物を分析した。簡単に説明すると、この方法には、２つ
のイムノクロマトグラフィー試薬、すなわち抗体コーテ
ィングコロイドおよび抗体処理ニトロセルロースの調製
が含まれていた。

【００５２】上記コロイドは、ＭＥＳ緩衝液(ｐＨ６.
０)中に０.０５％固形分となるようにポリピロールを希
釈することにより調製したポリピロールであった(全容
量５００μＬ中に１２０μｇの抗ビオチン抗体を含
有)。５分毎に短時間回転撹拌しながら混合物を５５℃
で２０分間インキュベートした。このインキュベーショ
ンの後に、＠１％ＴＷＥＥＮ−２０(１０μＬ)および２
５ｍＭＢＩＳ−ＴＲＩＳ(ｐＨ６.５)中の＠１０％卵ア
ルブミン(２５μＬ)を加えた。この混合物を短時間超音
波処理し、遠心分離により洗浄した。ニトロセルロース
の孔径は５μｍであり、これに毛管ホイップにより細い
線で抗フルオレセイン抗体を加えた。

【００５３】ライゲートしたＬＣＲ生成物は二重標識
(フルオレセインおよびビオチン)してあるため、抗ビオ
チン抗体結合ポリピロールを抗フルオレセイン抗体結合
ニトロセルロースに連結させた。ライゲートしていない
ＬＣＲ生成物は単独の標識しかされていないため、この
連結は生成しなかった。このＬＣＲ混合物の２５μＬア
リコートを、１００ｍＭＴＲＩＳ(ｐＨ８.０)、１５０
ｍＭＮａＣｌおよび２％ＢＳＡからなる緩衝液(１００
μＬ)に加えた。ポリピロールの１０μＬアリコートを
加えた。ついで、この懸濁液中に、下端から１.５ｃｍ
の箇所に抗フルオレセイン抗体を吸着させたニトロセル
ロースの７×０.３ｃｍストリップを浸漬した。溶媒フ
ロントがニトロセルロースストリップの上端から１ｃｍ
以内に達するまで、この懸濁液を毛管作用により該スト
リップを上昇させた。ストリップ上の抗フルオレセイン
抗体の位置にむらのない黒線が存在することにより陽性
の反応が示された。

【００５４】図５は、得られたニトロセルロースストリ
ップの写真を示す模式図である。図５中、「Ｏ」は化学標
識の結合していないすべてのプローブを示す。「Ｆ」は、
ＬＣＲ１ＢまたはＬＣＲ１Ｂ'上の標識を有しない、フ
ルオレセイン−ＬＣＲ１Ａおよびフルオレセイン−ＬＣ
Ｒ１Ａ'を示す。「Ｂ」は、ＬＣＲ１ＡまたはＬＣＲ１Ａ'
上の標識を有しない、ビオチン−ＬＣＲ１Ｂおよびビオ
チン−ＬＣＲ１Ｂ'を示す。「ＢＦ」は、フルオレセイン
−ＬＣＲ１Ａ、フルオレセイン−ＬＣＲ１Ａ'、ビオチ
ン−ＬＣＲ１Ｂおよびビオチン−ＬＣＲ１Ｂ'を示す。
ＢＦの場合のみ、ニトロセルロースストリップ上の抗フ
ルオレセイン抗体の部位にポリピロール複合体が存在す
ることに注意すべきである。

【００５５】実施例１１下記表８に示す配列がＨＰＶ１１型、１６型および１８
型にそれぞれ特異的であることが決定された。

【表８】

【００５６】実施例１２実施例３と同様にして、ｐＧＥＭ３中に完全長のパピロ
ーマウイルス挿入を有する直鎖状プラスミドを目的配列
として用いた。これらのプラスミドは、ｐＳＰ６５.１
１.５(ＨＰＶ１１)、ｐＳＰ６５.１６.８(ＨＰＶ１６)
およびｐ６３ＨＰＶ１８Ｈ(−)(ＨＰＶ１８)であった。
実施例１１のプローブを実施例９と同様にしてビオチン
で標識した。熱サイクラーはコイ・ラボラトリー・プロ
ダクツからのものを用いた。

【００５７】実施例６および７に記載のようにしてＬＣ
Ｒを行った後、反応混合物を逆ブロット法により下記の
ようにして分析した。特定のＨＰＶ型に特異的なオリゴ
ヌクレオチドをセルロース膜(メンテック(Memtek)^TM、
ベレリカ、マサチューセッツ州)に共有結合により結合
させた。これら配列は、表９に示すように、型特異的Ｌ
ＣＲプローブであるＬＣＲ２、ＬＣＲ３およびＬＣＲ４
の内部「半分」を結合させることにより得た。

【表９】

【００５８】ハイブリダイゼーションは下記のようにし
て行った。膜をハイブリダイゼーション緩衝液(０.７５
ＭＮａＣｌ、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７.
０、０.５％ウシ血清アルブミン[ＢＳＡ]、０.５％ポリ
ビニルピロリドン、１.０％ドデシル硫酸ナトリウム[Ｓ
ＤＳ]、および０.１％ニシン精子ＤＮＡ)中、３７°Ｃ
で１５分間プレハイブリダイズした。試料を約５分間沸
騰させた。ついで、沸騰させた試料の２５μＬアリコー
トを新たなハイブリダイゼーション緩衝液(１ｍＬ)中に
入れた。この混合物を膜とともに３７°Ｃで２０時間イ
ンキュベートした。ついで、これら膜を、新たなハイブ
リダイゼーション緩衝液中のストレプトアビジン−アル
カリホスファターゼ結合体(ＢＲＬ、ガイセルスバー
グ、メリーランド州より入手可能)の１：１０００希釈
液とともにインキュベートした。ついで、膜を室温にて
１％ＳＤＳ含有ＳＳＣ緩衝液(１５０ｍＭＮａＣｌ、１
５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０)中で２回、およ
び１％トリトンＸ−１００^R(シグマ・ケミカル、セント
ルイス、ミズーリ州より入手可能)をさらに含有するＳ
ＳＣ緩衝液中で２回洗浄した。この膜を１％トリトンＸ
−１００^Rを含有する３７°ＣにてＳＳＣ緩衝液中で２
回、ついで再び室温にてＳＳＣ緩衝液中で２回洗浄し
た。

【００５９】これら膜を、モレキュラー・バイオシステ
ムズ(ロットＷＦＰ−０１８８、サンジエゴ、カリフォ
ルニア州)から得た希釈液(約２ｍＬ)中のテストパック
(TestPack)^TM基質(ストレップ(Strep)Ａテストパック^TM
試薬Ｃ、リスト１３０１Ｇ、アボット・ラボラトリー
ズ、アボットパーク、イリノイ州より入手可能)に１：
５希釈液(約１ｍＬ)とともにインキュベートした。青色
が陽性反応を示していた。

【００６０】これらの結果を図６〜８に示す。図６にお
いて、写真はＬＣＲ２Ａ、ＬＣＲ２Ａ'、ＬＣＲ２Ｂお
よびＬＣＲ２Ｂ'とｐＳＰ６５.１１.５との反応から得
られたＬＣＲ生成物の量を示す。６つのすべての捕捉オ
リゴヌクレオチドは膜上に存在していた。反応生成物の
大部分はＨＰＶ−１１特異的オリゴヌクレオチドの部位
に認められた。図７において、写真はＬＣＲ３Ａ、ＬＣ
Ｒ３Ａ'、ＬＣＲ３ＢおよびＬＣＲ３Ｂ'とｐＳＰ６５.
１６.８との反応から得られたＬＣＲ生成物の量を示
す。６つのすべての捕捉オリゴヌクレオチドは膜上に存
在していた。すべての反応生成物がＨＰＶ−１６特異的
オリゴヌクレオチドの部位に認められた。図８におい
て、スケッチはＬＣＲ４Ａ、ＬＣＲ４Ａ'、ＬＣＲ４Ｂ
およびＬＣＲ４Ｂ'とｐＧ３Ｇ３ＨＰＶ１８Ｈ(−)との
反応から得られたＬＣＲ生成物の量を示す。６つのすべ
ての捕捉オリゴヌクレオチドは膜上に存在していた。実
質的にすべての反応生成物がＨＰＶ−１８特異的オリゴ
ヌクレオチドの部位に認められた。

【００６１】実施例１３下記配列が、ＨＰＶ１６型のＥ６領域部分に特異的であ
ることが決定された。

【化２０】

【００６２】実施例１４ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
する塩基変性プラスミドを目的配列として用いた。これ
らのプラスミドは、ｐＧ３ＨＰＶ６(＋)(ＨＰＶ６)、ｐ
ＳＰ６５.１１.５(ＨＰＶ１１)、ｐＳＰ６５.１６.８
(ＨＰＶ１６)、ｐ６３ＨＰＶ１８Ｈ(−)(ＨＰＶ１８)、
ｐ６３：ＨＰＶ３１(ＨＰＶ３１)、ｐＬＮＫ３２２：Ｈ
ＰＶ３３(ＨＰＶ３３)、ｐＢＲ３２２：ＨＰＶ３５(Ｈ
ＰＶ３５)、ｐＵＣ１９：ＨＰＶ５２(ＨＰＶ５２)、ｐ
ＬＮＫ３２２：ＨＰＶ５８(ＨＰＶ５８)、ｐＵＣ９：Ｈ
ＰＶ５９(ＨＰＶ５９)およびｐＢＲ３２２：ＨＰＶ６１
(ＨＰＶ６１)であった。

【００６３】プローブとして使用する実施例１３からの
すべてのオリゴヌクレオチドに、ライゲーションからの
遠位末端に化学標識を共有結合により結合させた。これ
らの標識は、５'−フルオレセイン−ＬＣＲ５Ａ、３'−
フルオレセイン−ＬＣＲ５Ａ'、３'−ビオチン−ＬＣＲ
５Ｂおよび５'−ビオチン−ＬＣＲ５Ｂ'であった。共有
結合は、公知の方法、すなわちカンサルらのTet. Lette
rs ２９：５５３７〜５５４０(１９８８)に記載の方法
に実質的に従ってアミン末端オリゴヌクレオチドをＦＩ
ＴＣまたはビオチン−ＮＨＳ−エステルと反応させるこ
とにより行った。使用した熱サイクラーは、コイ・ラボ
ラトリー・プロダクツ、アンアーバー、ミシガン州より
入手したものであった。

【００６４】実施例６および７に記載のＬＣＲ法に従
い、標準型のＩＭｘ^R装置(アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ州)を用い、下記微細粒子酵
素イムノアッセイのプロトコールに従って混合物を分析
した。ＬＣＲ混合物の４０μＬアリコートを蒸留水で
１：１に希釈した。この希釈混合物を抗フルオレセイン
抗体結合ポリスチレン微細粒子(５０μＬ)とともに５分
間インキュベートして、微細粒子上の免疫複合体の懸濁
液を生成させた。ついで、この懸濁液を不活性ガラス繊
維マトリックスに移すと、微細粒子は該マトリックスに
結合した。このマトリックスを緩衝液(０.３ＭＮａＣ
ｌ、１０ｍＭＴＲＩＳ、ｐＨ８.０、０.１％ＮａＮ₃)
で洗浄した。４−メチルウンベリフェロンの加水分解を
触媒するアルカリホスファターゼ標識結合体を用い、ガ
ラスマトリックスに結合した免疫複合体を検出した。マ
トリックス上に４−メチルウンベリフェロンが生成する
速度は、反応混合物中に生成したＬＣＲ生成物の濃度に
比例した。

【００６５】図９のグラフは、１０⁷分子の目的配列に
ついてＬＣＲを行って得られた結果を示す。図９に示す
速度は、４−メチルウンベリフェロンの生成速度であ
り、蛍光カウント／秒／秒として表してある。ヒト胎盤
ＤＮＡの増幅により示されるように、バックグラウンド
シグナルは約１０ｃ／ｓ／ｓである。バックグラウンド
を越える値が得られた唯一のものは、ＨＰＶ１６を含有
する試料からのものであり、その値はバックグラウンド
シグナルの約６０倍である。

【００６６】実施例１５下記配列が、ＨＰＶ１８型のＥ６領域部位に特異的であ
ることが決定された。

【化２１】

【００６７】実施例１６ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
するプラスミドを目的配列として用いた。使用したプラ
スミドは、実施例１４に記載したものと同じであった。
プローブとして使用する実施例１５で得たすべてのオリ
ゴヌクレオチドに、ライゲーションからの遠位末端にて
化学標識を共有結合により結合させた。熱サイクラー
は、コイ・ラボラトリー・プロダクツ、アンアーバー、
ミシガン州からのものであった。

【００６８】実施例６および７に記載のＬＣＲ法に従
い、標準型のＩＭｘ^R装置(アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ州)を用い、実施例１４に記
載のようにして混合物を分析した。図１０のグラフは、
１０⁷分子の目的配列についてＬＣＲを行って得られた
結果を示す。図１０に示す速度は、４−メチルウンベリ
フェロンの生成速度であり、蛍光カウント／秒／秒とし
て表してある。ヒト胎盤ＤＮＡの増幅により示されるよ
うに、バックグラウンドシグナルは約１５ｃ／ｓ／ｓで
ある。バックグラウンドを越える値が得られた唯一のも
のは、ＨＰＶ１８を含有する試料からのものであり、そ
の値はバックグラウンドシグナルの約４０倍である。

【００６９】実施例１７下記配列が、ＨＰＶ１８型のＥ６領域部位に特異的であ
ることが決定された。

【化２２】

【００７０】実施例１８ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
するプラスミドを目的配列として用いた。使用したプラ
スミドは、実施例１４に記載したものと同じであった。
プローブとして使用する実施例１７で得たすべてのオリ
ゴヌクレオチドに、ライゲーションからの遠位末端にて
化学標識を共有結合により結合させた。熱サイクラー
は、実施例１６に記載したものと同じであった。実施例
６および７に記載のＬＣＲ法に従い、標準型のＩＭｘ^R
装置(アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イ
リノイ州)を用い、実施例１４に記載のようにして混合
物を分析した。図１１のグラフは、１０⁷分子の目的配
列についてＬＣＲを行って得られた結果を示す。図１１
に示す速度は、４−メチルウンベリフェロンの生成速度
であり、蛍光カウント／秒／秒として表してある。ヒト
胎盤ＤＮＡの増幅により示されるように、バックグラウ
ンドシグナルは約１５ｃ／ｓ／ｓである。バックグラウ
ンドを越える値が得られた唯一のものは、ＨＰＶ１８を
含有する試料からのものであり、その値はバックグラウ
ンドシグナルの約８０倍である。

【００７１】実施例１９下記配列が、ＨＰＶ１６型のＥ６領域部位に特異的であ
ることが決定された。

【化２３】

【００７２】実施例２０ｐＧＥＭ３中に完全長のパピローマウイルス挿入を含有
するプラスミドを目的配列として用いた。使用したプラ
スミドは、実施例１４に記載したものと同じであった。
プローブとして使用する実施例１９で得たすべてのオリ
ゴヌクレオチドに、ライゲーションからの遠位末端にて
化学標識を共有結合により結合させた。熱サイクラー
は、実施例１６に記載したものと同じであった。

【００７３】実施例６および７に記載のＬＣＲ法に従
い、標準型のＩＭｘ^R装置(アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ州)を用い、実施例１４に記
載のようにして混合物を分析した。図１２のグラフは、
１０⁷分子の目的配列についてＬＣＲを行って得られた
結果を示す。図１２に示す速度は、４−メチルウンベリ
フェロンの生成速度であり、蛍光カウント／秒／秒とし
て表してある。ヒト胎盤ＤＮＡの増幅により示されるよ
うに、バックグラウンドシグナルは約１０ｃ／ｓ／ｓで
ある。バックグラウンドを越える値が得られた唯一のも
のは、ＨＰＶ１６を含有する試料からのものであり、そ
の値はバックグラウンドシグナルの約３６倍である。

【００７４】実施例２１本実施例では、下記に示すように本発明の配列を公知配
列に配置させて開示する。下記にＨＰＶ６型、１１型、
１６型、１８型、３１型および３３型の配列を示す。ま
た、これらＨＰＶ配列に対して本発明の配列がどこに対
応するかをも示す。さらに、１９９０年９月２８日現在
で本発明者らに知られ他の出願人もしくは研究者によっ
てクレームされまたは開示された他の配列がＨＰＶ配列
に対してどこに対応するかをも示す（配列中、conは共
通配列を示す）。

【００７５】なお、配列中の略語は以下の通りである。１．本発明の配列および領域：ＰＣＲ＝実施例１〜４による配列ＪＪ＝実施例５による領域ＬＣＲ＝実施例６〜２０による配列

【００７６】２．他の出願人によってクレームされた配
列および領域(イタリック体はアンチセンス配列を示
す)：ＡＵＳ＝国際出願ＰＣＴ／ＡＵ８８／０００４７(ＷＯ
８８／０６６３４)(オーストラリア人による) ＷＬ＝国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／００６２９(ＷＯ８
６／０５８１６)[ウエイン・ランカスター(Wayne Lanca
ster)、ウエイン州立大学] ＢＥ＝ヨーロッパ特許出願第８９−０３３８３４(Ｘ＝
ＴまたはＵ)(ベルギー人による)

【００７７】Ｃ＝国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３７４
７(ＷＯ／９０／０２８２１)(シータス) Ｏ＝国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１３１８(ＷＯ／８
９／０９９４０)(オンカー(Oncor)) ３．他の研究者により開示された配列および領域：Ｓ＝サーカー(Sarkar, F.H.)およびクリスマン(Chrissm
an, J.D.)、Biotechniques９、１８０〜１８４(１９９
０)(イタリックはアンチセンス配列を示す)

【００７８】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【化２８】

【化２９】

【化３０】

【化３１】

【００７９】

【化３２】

【化３３】

【化３４】

【化３５】

【化３６】

【化３７】

【化３８】

【化３９】

【化４０】

【００８０】

【化４１】

【化４２】

【化４３】

【化４４】

【化４５】

【化４６】

【化４７】

【００８１】

【化４８】

【化４９】

【化５０】

【化５１】

【化５２】

【化５３】

【化５４】

【００８２】

【化５５】

【化５６】

【化５７】

【化５８】

【化５９】

【化６０】

【化６１】

【化６２】

【化６３】

【００８３】

【化６４】

【化６５】

【化６６】

【化６７】

【化６８】

【化６９】

【化７０】

【化７１】

【化７２】

【化７３】

【００８４】

【化７４】

【化７５】

【化７６】

【化７７】

【化７８】

【化７９】

【化８０】

【化８１】

【化８２】

【化８３】

【００８５】

【化８４】

【化８５】

【化８６】

【化８７】

【化８８】

【化８９】

【化９０】

【化９１】

【化９２】

【化９３】

【００８６】

【化９４】

【化９５】

【化９６】

【化９７】

【化９８】

【化９９】

【化１００】

【化１０１】

【化１０２】

【化１０３】

【００８７】

【化１０４】

【化１０５】

【化１０６】

【化１０７】

【化１０８】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類: 他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CAGATGTCTC TGTGGCGGCC TAGTG 25 配列番号：２配列の長さ: ２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CGTTTTCCAT ATTTTTTTGC AGATG 25 配列番号：３配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAGTTGTAAG CACCGATGAA TATGT 25 配列番号：４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AATGTACCCT AAATACCCTA TATTG 25 配列番号：５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AGGTGTCAGG AAAACCAAAT TTATT 25 配列番号：６配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GAATTAGTTA GACCATTTAA AAG 23 配列番号：７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GGGGAAACAC CAGAATGGAT A 21 配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATCATATGCC CACTGTACCA T 21 配列番号：９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GGATATGGCT ATTCTGAAGT GGAA 24 配列番号：１０配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTTTTATCAC TTTTAAATGG TCTAACTAA 29 配列番号：１１配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAGCGCCCAC AAACAGTGTA CGG 23 配列番号：１２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAGCAGTAGA CGACAGCACC CGA 23 配列番号：１３配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AGGGCGCCAT GAGACTGAAA CAC 23 配列番号：１４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CTACAAATGG CGAACATGGC GGC 23 配列番号：１５配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CTAGTGGGGT GGGGGATGAT TCA 23 配列番号：１６配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAAAATGCAA TTGTGACTGT AACAT 25 配列番号：１７配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CAATGGTAGT GCCTTCCACC TTAGG 25 配列番号：１８配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CTACTATATT GTTACCACAC AGCAA 25 配列番号：１９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATTGTGCAAA CGCAACAATA ATGGT 25 配列番号：２０配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATGACAAATC TTGATACTGC ATCCA 25 配列番号：２１配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AATATTGGTG GGATACATGA CAATG 25 配列番号：２２配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ACAGCATATG ACACAACAAG AGTAA 25 配列番号：２３配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TTTATGGATA TTATTGGTTT ACATAG 26 配列番号：２４配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TCTGAAAAAA AATAGGGAAT ACGTTT 26 配列番号：２５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CCCTGTTACA AATATATCAG ATACA 25 配列番号：２６配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TTCTGTTACA CAGTCTTATC TTACC 25 配列番号：２７配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CCATCTGTAC CCTCTACATC TTTAT 25 配列番号：２８配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CCTTTGCATT TTTTAAATAT TCGCC 25 配列番号：２９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATAATGTACA CACCCCAATG CAACA 25 配列番号：３０配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AGGGCTGGTA CTGTGGGGGA AACTGT 26 配列番号：３１配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GCTTTTTGTA GCCAATATGG TTTATT 26 配列番号：３２配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AATTAAGGGT AGTGGAAATC GCACG 25 配列番号：３３配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GGTAAAAGGG GGTAATAACA GATCA 25 配列番号：３４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTCTACTGCA AATTTAGCCA GTTCA 25 配列番号：３５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TATGCCTGCT TCACCTGGCA GCTGT 25 配列番号：３６配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ACTACTGCCT CTATTCAAAG CAGTG 25 配列番号：３７配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AATTAGNGAA TATAGACATT 20 配列番号：３８配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TATGGCTATT CTGAAGTGGA AGCTGNNNNN CNACAGAT 38 配列番号：３９配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TTAGTTAGAC CATTTAAAAG TGATAAAACA ACNTGTNCAG ATTGG 45 配列番号：４０配列の長さ：４２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TGGATANAAA GACAAACNGT TATACAACAT AGTTTNGATG AT 42 配列番号：４１配列の長さ：４６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TGGATAAAAT ATAGATGTNC TAAAATAGAT GATGGAGGAA ATTGGA 46 配列番号：４２配列の長さ：４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CATTTTTAAG TGCATTAAAA TTATTTTTGC AAGGNACNAA NAAAAAAAA 49 配列番号：４３配列の長さ：４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTTGGACATA TATNGATACN TATATGAGAA ATGCGTTAGA TGG 43 配列番号：４４配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TCAAAGACTA AAGCACATAA AGCNATTGAA CTGCAAATGG 40 配列番号：４５配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CATTTAAAAG GTGANTCNAA TAGTTTAAAA TGTTTAAGAT ATAGCAGATT 50 配列番号：４６配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TCTATTGTGT CNTTAATNGA AGAATCTAGT NTTATTAATG CAGGTGCACC 50 配列番号：４７配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TACATAGGCC TGCTATAACN TCCAGNCGTG GTNNTGTGCG NTTTAGTAGA 50 配列番号：４８配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CGTAAACGTN TTCCCTATTT TTTTNCAGAT GTCTNTGTGG CGGCCTAGTG A 51 配列番号：４９配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTTGTNANCA CGGATGANTA TGTTACTCGC ACAA 34 配列番号：５０配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTTGGACATC CATATTTT 18 配列番号：５１配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CAATATAGGG TATTTAGGGT NCNGTTACC 29 配列番号：５２配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AATAAATTTG GATTNCCTGA CACCTCNNTT TATAAT 36 配列番号：５３配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GATGGTGATA TGGTTGATAC AGGCTTTGGT GCTATGGA 38 配列番号：５４配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CATTNCANGC NAATAAANGT GATGTTCCTN TNGATATTTG T 41 配列番号：５５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAATATCCAG ATTATTTANA AATGG 25 配列番号：５６配列の長さ：５２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTTACNTCTG ANGCNAATT ATTTAATAAAC CATATTGGCT ACAANNNGCA CA 52 配列番号：５７配列の長さ：４８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AATGGTATTT GTTGGGGTAA TCAATTATTT GTTACTGTGG TAGATACC 48 配列番号：５８配列の長さ：４７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TTTTGGGAGG TTAATTTAAA NGAAAAGTTT TCTGCAGANT TAGATCA 47 配列番号：５９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAGTTGTAAG CACGGATGAA TATGT 25 配列番号：６０配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ACATATTCAT CCGTGCTTAC AACT 24 配列番号：６１配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TGCACGCACA AACATATATT ATCA 24 配列番号：６２配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATGATAATAT ATGTTTGTGC GTGCA 25 配列番号：６３配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ACCTGTTGGT AAAAGGGGGT AATAA 25 配列番号：６４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TTATTACCCC CTTTTACCAA CAGG 24 配列番号：６５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CAGATCATCT GTAGCTAGTA GTAT 24 配列番号：６６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATACTACTAG CTACAGATGA TCTG 24 配列番号：６７配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATTTATACAT TAAAGGCTCT GGGTC 25 配列番号：６８配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GACCCAGAGC CTTTAATGTA TAAA 24 配列番号：６９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TACTGCAAAT TTAGCCAGTT CAAA 24 配列番号：７０配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATTTGAACTG GCTAAATTTG CAGTA 25 配列番号：７１配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CCTTATATAT TAAAGGCACA GGTAT 25 配列番号：７２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATACCTGTGC CTTTAATATA TAAG 24 配列番号：７３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GCCTGCTTCA CCTGGCAGCT GTGT 24 配列番号：７４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の型：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CACACAGCTG CCAGGTGAAG CAGGC 25 配列番号：７５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AGGGGGTAAT AACAGATCAT CTGT 24 配列番号：７６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ACAGATGATC TGTTATTACC CCCT 24 配列番号：７７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AGGCTCTGGG TCTACTGCAA ATTT 24 配列番号：７８配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAATTTGCAG TAGACCCAGA GCCT 24 配列番号：７９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AGGCACAGGT ATGCCTGCTT CACC 24 配列番号：８０配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GGTGAAGCAG GCATACCTGT GCCT 24 配列番号：８１配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GCTGCAAACA ACTATACATG ATATAA 26 配列番号：８２配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TTATATCATG TATAGTTGTT TGCAGC 26 配列番号：８３配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TATTAGAATG TGTGTACTGC AAGCA 25 配列番号：８４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TGCTTGCAGT ACACACATTC TAATA 25 配列番号：８５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CTTCACTGCA AGACATACAA ATAA 24 配列番号：８６配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TTATTTCTAT GTCTTGCAGT GAA 23 配列番号：８７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CCTGTGTATA TTGCAAGACA GTAT 24 配列番号：８８配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TACTGTCTTG CAATATACAC AGG 23 配列番号：８９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TATATTGCAA GACAGTATTG GAAC 24 配列番号：９０配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTTCCAATAC TGTCTTGCAA TTTA 24 配列番号：９１配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列ＴＴＡＣＡＧＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴ
２５配列番号：９２配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AATGCAAATT CAAATACCTC TGTAA 25 配列番号：９３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 GTATGGAACA ACATTAGAAC AGCA 24 配列番号：９４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 TGCTGTTCTA ATGTTGTTCC ATAC 24 配列番号：９５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 ATACAACAAA CCGTTGTGTG ATTT 24 配列番号：９６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 AAATCACACA ACGGTTTGTT GTAT 24

【図面の簡単な説明】

【図１】プライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ５を用いて
選択プラスミドを増幅させた場合の結果を示す、電気泳
動後のゲルの写真の模式図である(ＨＰＶ６はレーン１
に、ＨＰＶ１１はレーン２に、ＨＰＶ１６はレーン３
に、ＨＰＶ１８はレーン４に、ＨＰＶ３１はレーン５
に、ＨＰＶ３３はレーン６に、ＨＰＶ６１はレーン７
に、分子量標準はレーン８にそれぞれ示す)。

【図２】プライマーＰＣＲ１、ＰＣＲ２、ＰＣＲ３、
ＰＣＲ４およびＰＣＲ５を用いてプラスミドｐ６５.１
６.８(ＨＰＶ１６)を増幅させた場合の結果を示す、電
気泳動後のゲルの写真の模式図である。

【図３】増幅ＰＣＲ生成物を得るためにＰＣＲ１４お
よびＰＣＲ１５をＩＷＤＯとともに用いた場合の臭化エ
チジウム染色ゲルの写真の模式図である。

【図４】ＰＣＲ１Ａ、ＰＣＲ１Ａ'、ＰＣＲ１Ｂおよ
びＰＣＲ１Ｂ'を用いてプラスミドｐ６５.１６.８を２
つの異なるプラスミド濃度にて増幅させた場合の結果を
示すオートラジオグラムの写真の模式図である。

【図５】ＬＣＲプライマーＬＣＲ１Ａ、ＬＣＲ１
Ａ'、ＬＣＲ１ＢおよびＬＣＲ１Ｂ'をフルオレセインと
ともに、ビオチンとともにまたはシグナル生成化合物な
しで用いた場合のニトロセルロースストリップの写真の
模式図である。

【図６】ＬＣＲ２Ａ、ＬＣＲ２Ａ'、ＬＣＲ２Ｂおよ
びＬＣＲ２Ｂ'とｐＳＰ６５.１１.５との反応から得ら
れたＬＣＲ生成物の量を示す写真の模式図である。

【図７】ＬＣＲ３Ａ、ＬＣＲ３Ａ'、ＬＣＲ３Ｂおよ
びＬＣＲ３Ｂ'とｐＳＰ１６.８との反応から得られたＬ
ＣＲ生成物の量を示す写真の模式図である。

【図８】ＬＣＲ４Ａ、ＬＣＲ４Ａ'、ＬＣＲ４Ｂおよ
びＬＣＲ４Ｂ'とｐＧ３Ｇ３ＨＰＶ１８Ｈ(−)との反応
から得られたＬＣＲ生成物の量を示すグラフである。

【図９】ＬＣＲ５Ａ、ＬＣＲ５Ａ'、ＬＣＲ５Ｂおよ
びＬＣＲ５Ｂ'を用い、１０⁷分子の選択した目的配列上
でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４−メ
チルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウント／秒
／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロットして
ある。

【図１０】ＬＣＲ６Ａ、ＬＣＲ６Ａ'、ＬＣＲ６Ｂお
よびＬＣＲ６Ｂ'を用い、１０⁷分子の選択した目的配列
上でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４−
メチルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウント／
秒／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロットし
てある。

【図１１】ＬＣＲ７Ａ、ＬＣＲ７Ａ'、ＬＣＲ７Ｂお
よびＬＣＲ７Ｂ'を用い、１０⁷分子の選択した目的配列
上でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４−
メチルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウント／
秒／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロットし
てある。

【図１２】ＬＣＲ８Ａ、ＬＣＲ８Ａ'、ＬＣＲ８Ｂお
よびＬＣＲ８Ｂ'を用い、１０⁷分子の選択した目的配列
上でＬＣＲを行って得られた結果のグラフである。４−
メチルウンベリフェロンの反応速度は、蛍光カウント／
秒／秒で表してあり、目的ＨＰＶ型に対してプロットし
てある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スタンリー・アール・ボーマアメリカ合衆国60060イリノイ州マンデレイン、レインジ・ストリート834番 (72)発明者ロナルド・エル・マーシャルアメリカ合衆国60099イリノイ州ザイオン、ウィンスロープ・コート900番 (72)発明者トーマス・ジー・ラフラーアメリカ合衆国60048イリノイ州リバティービル、パインハースト・コート1964番Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA03 HA14 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR56 QS25 QS26 QS33 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】４つのオリゴヌクレオチドプローブのセ
ットからなり、該プローブのセットが下記オリゴヌクレ
オチドのセットよりなる群から選ばれたものである、試
料中に存在するヒトパピローマウイルス１８型のＤＮＡ
を増幅させるためのＬＣＲに使用するのに有用な組成
物。【化１】【化２】および【化３】
【請求項２】請求項１に記載の組成物およびリガーゼ
からなることを特徴とする、試料中のヒトパピローマウ
イルスＤＮＡの存在を検出するためのキット。
【請求項３】該リガーゼが熱安定性のものである、請
求項２に記載のキット。
【請求項４】試料中に存在するヒトパピローマウイル
スＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに使用するのに有用
な組成物であって、該ヒトパピローマウイルスＤＮＡの
アンチセンス鎖とハイブリダイズすることができ、長さ
が約１０〜約３０ヌクレオチドであり、下記配列よりな
る群から選ばれた配列を有するセンス方向の第一核酸プ
ライマー；【化４】および、該ヒトパピローマウイルスＤＮＡのセンス鎖と
ハイブリダイズすることができ、長さが約１０〜約３０
ヌクレオチドであり、下記配列よりなる群から選ばれた
配列を有するアンチセンス方向の第二核酸プライマー；【化５】からなり、該第一核酸プライマーおよび該第二核酸プラ
イマーは、それぞれのアンチセンス鎖およびセンス鎖へ
のハイブリダイズにおいて、伸長方向においてそれぞれ
の３'末端が重複せず、それぞれの５'末端が３'末端よ
りも離れて位置するような仕方でハイブリダイズする、
ことを特徴とする組成物。
【請求項５】該第一プライマーおよび該第二プライマ
ーが、下記オリゴヌクレオチド配列のペアよりなる群か
ら選ばれたものである、請求項４に記載の組成物；ＳＥ
ＱＩＤＮｏ.１と４、１と５、１と１０、１と１７、
１と３１、２と４、２と５、２と１０、２と１７、２と
３１、３と４、３と５、３と１０、３と１７、３と３
１、６と４、６と５、６と１７、６と２４、６と３１、
７と４、７と５、７と１７、７と２４、７と３１、９と
４、９と５、９と１０、９と１７、９と２４、９と３
１、１６と４、１６と５、１６と１７、１６と２４、１
６と３１、２３と４、２３と５、２３と１０、２３と２
４、２３と３１、３０と１０、３０と１７、３０と３
１、５９と６２、６３と６６、６７と７０、７１と７
４、８１と８４、８５と８８、８９と９２、および９３
と９６。
【請求項６】請求項４または５に記載の組成物および
ポリメラーゼからなることを特徴とする、試料中のヒト
パピローマウイルスＤＮＡの存在の検出用キット。
【請求項７】該ポリメラーゼが熱安定性のものである
請求項６に記載のキット。
【請求項８】長さが約１０〜約６０ヌクレオチドであ
り、下記配列：【化６】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス６型、１１
型、１６型、１８型および３３型とハイブリダイズさせ
るための共通オリゴヌクレオチド。
【請求項９】さらにヒトパピローマウイルス３１型お
よび６１型とハイブリダイズすることができ、下記配
列：【化７】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有す
る、請求項８に記載の共通オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】下記配列：【化８】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス６型の存在
を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】下記配列：【化９】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス１６型の存
在を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】下記配列：【化１０】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス１８型の存
在を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】下記配列：【化１１】およびその相補体よりなる群から選ばれた配列を有する
ことを特徴とする、ヒトパピローマウイルス３３型の存
在を決定するための型特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】長さが約１０〜約６０ヌクレオチドで
あり、下記配列：【化１２】 (式中、Ｎは非特定ヌクレオチドを示す)およびその相補
体よりなる群から選ばれた配列を有することを特徴とす
る、ヒトパピローマウイルス６型、１１型、１６型、１
８型および３３型とハイブリダイズさせるための共通オ
リゴヌクレオチド。
【請求項１５】請求項１４に記載のオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも１種を検出用に標識したものと、該オリ
ゴヌクレオチドを検出するための手段とからなることを
特徴とする、ヒトパピローマウイルスの検出用キット。
【請求項１６】ポリメラーゼおよびリガーゼから選ば
れた、試料ＤＮＡを増幅させるための酵素をさらに含
む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】 (a)試料中のＤＮＡを、請求項１４に
記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出可能
なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合させ
たものとハイブリダイズさせ、ついで(b)生成したシグ
ナルを検出することによりヒトパピローマウイルスの存
在を決定することを特徴とする、試料中のヒトパピロー
マウイルスの存在の決定方法。
【請求項１８】該ハイブリダイズ工程の前または該ハ
イブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請求
項１７に記載の方法。
【請求項１９】該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲであ
る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】 (a)試料中のＤＮＡを、請求項８に記
載の共通オリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出可
能なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合さ
せたものとハイブリダイズさせ、ついで(b)生成したシ
グナルを検出することによりヒトパピローマウイルスの
存在を決定することを特徴とする、試料中のヒトパピロ
ーマウイルスの存在の決定方法。
【請求項２１】該ハイブリダイズ工程の前または該ハ
イブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請求
項２０に記載の方法。
【請求項２２】該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲであ
る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】 (a)試料中のＤＮＡを、請求項１０に
記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出可能
なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合させ
たものとハイブリダイズさせ、ついで(b)生成したシグ
ナルを検出することによりヒトパピローマウイルス６型
の存在を決定することを特徴とする、試料中のヒトパピ
ローマウイルスの存在の決定方法。
【請求項２４】該ハイブリダイズ工程の前または該ハ
イブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請求
項２３に記載の方法。
【請求項２５】該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲであ
る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】 (a)試料中のＤＮＡを、請求項１１に
記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出可能
なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合させ
たものとハイブリダイズさせ、ついで(b)生成したシグ
ナルを検出することによりヒトパピローマウイルスの存
在を決定することを特徴とする、試料中のヒトパピロー
マウイルス１６型の存在の決定方法。
【請求項２７】該ハイブリダイズ工程の前または該ハ
イブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請求
項２６に記載の方法。
【請求項２８】該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲであ
る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】 (a)試料中のＤＮＡを、請求項１２に
記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出可能
なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合させ
たものとハイブリダイズさせ、ついで(b)生成したシグ
ナルを検出することによりヒトパピローマウイルスの存
在を決定することを特徴とする、試料中のヒトパピロー
マウイルス１８型の存在の決定方法。
【請求項３０】該ハイブリダイズ工程の前または該ハ
イブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請求
項２９に記載の方法。
【請求項３１】該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲであ
る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】 (a)試料中のＤＮＡを、請求項１３に
記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を検出可能
なシグナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合させ
たものとハイブリダイズさせ、ついで(b)生成したシグ
ナルを検出することによりヒトパピローマウイルスの存
在を決定することを特徴とする、試料中のヒトパピロー
マウイルス３３型の存在の決定方法。
【請求項３３】該ハイブリダイズ工程の前または該ハ
イブリダイズ工程と同時にさらに増幅工程を行う、請求
項３２に記載の方法。
【請求項３４】該増幅工程がＰＣＲまたはＬＣＲであ
る、請求項３３に記載の方法。