JP2001321168A - Ｈｐｖ感染型の同定方法 - Google Patents
Ｈｐｖ感染型の同定方法Info
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- JP2001321168A JP2001321168A JP2000140602A JP2000140602A JP2001321168A JP 2001321168 A JP2001321168 A JP 2001321168A JP 2000140602 A JP2000140602 A JP 2000140602A JP 2000140602 A JP2000140602 A JP 2000140602A JP 2001321168 A JP2001321168 A JP 2001321168A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】従来検出感度が低いか、検出されなかった、Ｐ
ＣＲ法を改良し、グループ特異的プローブを用いて、グ
ループ別の粘膜型ＨＰＶの型が検出できる同定方法、こ
れに用いる同定試薬およびこれを用いたキットの提供。 【解決手段】下記（１）〜（８）のＤＮＡ配列を用いて
ＨＰＶ感染型を同定する方法。 （１）ＬＣＲＦ−１：ＷＷＡＲＧＧＷＧＴＲＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （２）ＬＣＲＦ−２：ＷＷＷＧＧＧＴＣＳＡＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （３）ＬＣＲＦ−３：ＷＲＧＧＫＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （４）ＬＣＲＦ−４：ＧＴＡＲＧＧＹＲＡＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＲＣＧＧ （５）Ｅ７Ｒ−１：ＴＣＭＫＣＣＴＣＴＫＣＹＴＣＴＧ
ＡＧＹＴＧＴ （６）Ｅ７Ｒ−２：ＴＣＷＴＣＭＴＣＨＴＣＲＴＣＴＧ
ＡＧＣＴＧＴ （７）Ｅ７Ｒ−３：ＣＡＣＷＡＷＡＴＴＫＴＧＴＧＡＣ
ＧＣＴＧＴＧＧおよび （８）Ｅ７Ｒ−４：ＡＴＧＡＹＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＴＡＲＲＣ ここで、Ｃ，Ａ，Ｔ，Ｇはそれぞれシントン、アデニ
ン、チミン、グアニンを表わしＲ，Ｗ，Ｙ，Ｋは以下の
デジェネレシイ（degeneracy）を表わす。 Ｒ：Ａ／Ｇ Ｗ：Ａ／Ｔ Ｙ：Ｃ／Ｔ Ｋ：Ｇ／
Ｔ
ＣＲ法を改良し、グループ特異的プローブを用いて、グ
ループ別の粘膜型ＨＰＶの型が検出できる同定方法、こ
れに用いる同定試薬およびこれを用いたキットの提供。 【解決手段】下記（１）〜（８）のＤＮＡ配列を用いて
ＨＰＶ感染型を同定する方法。 （１）ＬＣＲＦ−１：ＷＷＡＲＧＧＷＧＴＲＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （２）ＬＣＲＦ−２：ＷＷＷＧＧＧＴＣＳＡＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （３）ＬＣＲＦ−３：ＷＲＧＧＫＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （４）ＬＣＲＦ−４：ＧＴＡＲＧＧＹＲＡＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＲＣＧＧ （５）Ｅ７Ｒ−１：ＴＣＭＫＣＣＴＣＴＫＣＹＴＣＴＧ
ＡＧＹＴＧＴ （６）Ｅ７Ｒ−２：ＴＣＷＴＣＭＴＣＨＴＣＲＴＣＴＧ
ＡＧＣＴＧＴ （７）Ｅ７Ｒ−３：ＣＡＣＷＡＷＡＴＴＫＴＧＴＧＡＣ
ＧＣＴＧＴＧＧおよび （８）Ｅ７Ｒ−４：ＡＴＧＡＹＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＴＡＲＲＣ ここで、Ｃ，Ａ，Ｔ，Ｇはそれぞれシントン、アデニ
ン、チミン、グアニンを表わしＲ，Ｗ，Ｙ，Ｋは以下の
デジェネレシイ（degeneracy）を表わす。 Ｒ：Ａ／Ｇ Ｗ：Ａ／Ｔ Ｙ：Ｃ／Ｔ Ｋ：Ｇ／
Ｔ
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はヒトパピローマウイ
ルス（以下、ＨＰＶという）の診断法に関し、デジエネ
レイトさせたプライマーを用いてＨＰＶ感染型の同定を
行う方法およびこの方法に用いるプライマー混合物であ
るＨＰＶ感染型同定試薬およびこれを用いたキットに関
する。
ルス（以下、ＨＰＶという）の診断法に関し、デジエネ
レイトさせたプライマーを用いてＨＰＶ感染型の同定を
行う方法およびこの方法に用いるプライマー混合物であ
るＨＰＶ感染型同定試薬およびこれを用いたキットに関
する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトパピローマウイルス（human papill
omavirus；ＨＰＶ）は、カプソメア構造をとるＤＮＡ型
ウイルスであり、皮膚における疣の起因ウイルスとして
知られていた。近年の分子生物学的研究や分子生物学的
手法を応用した診断法の確立によって、子宮頸部、陰茎
などの生殖器や咽頭、食道、肛門など消化器粘膜におけ
る癌発生や疣贅状表皮発育異常症(epidermodys・plasia
verruciformis：ＥＶ）患者における皮膚癌など扁平上
皮系悪性腫瘍の発生に関与していることが明らかとなっ
てきた。特に、子宮頸癌とＨＰＶ感染との間には強い相
関関係が疫学的に証明されており、頸癌予防のためのＨ
ＰＶワクチンの開発も現在進行しつつある。
omavirus；ＨＰＶ）は、カプソメア構造をとるＤＮＡ型
ウイルスであり、皮膚における疣の起因ウイルスとして
知られていた。近年の分子生物学的研究や分子生物学的
手法を応用した診断法の確立によって、子宮頸部、陰茎
などの生殖器や咽頭、食道、肛門など消化器粘膜におけ
る癌発生や疣贅状表皮発育異常症(epidermodys・plasia
verruciformis：ＥＶ）患者における皮膚癌など扁平上
皮系悪性腫瘍の発生に関与していることが明らかとなっ
てきた。特に、子宮頸癌とＨＰＶ感染との間には強い相
関関係が疫学的に証明されており、頸癌予防のためのＨ
ＰＶワクチンの開発も現在進行しつつある。
【０００３】現在、８０のタイプ以上のＨＰＶが分離さ
れており、生殖器粘膜に感染する粘膜型ＨＰＶだけでも
３５タイプ以上知られている。これらのうち、ＨＰＶ１
６，１８型は子宮頸癌組織から分離され、ＨＰＶ６，１
１型は良性の尖形コンジローマから分離されることか
ら、前者は高リスク型 (high-risk,type) 、後者は低リ
スク型(low- risk type)という分類がなされている (Lo
rincz ＡＴ,Reid Ｒ,Jenson ＡＢ,et al : Obstet Gyne
col ７９：３２８−３３７，１９９２）
れており、生殖器粘膜に感染する粘膜型ＨＰＶだけでも
３５タイプ以上知られている。これらのうち、ＨＰＶ１
６，１８型は子宮頸癌組織から分離され、ＨＰＶ６，１
１型は良性の尖形コンジローマから分離されることか
ら、前者は高リスク型 (high-risk,type) 、後者は低リ
スク型(low- risk type)という分類がなされている (Lo
rincz ＡＴ,Reid Ｒ,Jenson ＡＢ,et al : Obstet Gyne
col ７９：３２８−３３７，１９９２）
【０００４】しかしながら、国や地域によってそれぞれ
ＨＰＶタイプの頻度に差がみられるため、上記以外の多
くのＨＰＶタイプについての臨床悪性度の評価は完全に
は定まっていない。特に、欧米と日本では頻度が高いＨ
ＰＶタイプは異なっていると言われているため、わが国
独自のデータの集積が重要な課題となってきた。また、
欧米では子宮頸癌細胞診の偽陽性率を減らす目的でＨＰ
Ｖ遺伝子診断を取り入れることが勧められており、わが
国でもＨＰＶ遺伝子診断の臨床導入の機運も高まってき
ている。
ＨＰＶタイプの頻度に差がみられるため、上記以外の多
くのＨＰＶタイプについての臨床悪性度の評価は完全に
は定まっていない。特に、欧米と日本では頻度が高いＨ
ＰＶタイプは異なっていると言われているため、わが国
独自のデータの集積が重要な課題となってきた。また、
欧米では子宮頸癌細胞診の偽陽性率を減らす目的でＨＰ
Ｖ遺伝子診断を取り入れることが勧められており、わが
国でもＨＰＶ遺伝子診断の臨床導入の機運も高まってき
ている。
【０００５】最近、多くのＨＰＶ−ＤＮＡを一度のＰＣ
Ｒで増幅できるコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ
法が開発されている。そのうち、Ｅ６，Ｅ７遺伝子領域
のコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ法として、藤
永らの方法（コンセンサスプライマー：ｐＵ１Ｍ−ｐＵ
２Ｒ）がある。この方法で検出できるＨＰＶのタイプは
少ないが、簡便であり頻度の高い高リスク型、低リスク
型、ＨＰＶの検出に優れている。
Ｒで増幅できるコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ
法が開発されている。そのうち、Ｅ６，Ｅ７遺伝子領域
のコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ法として、藤
永らの方法（コンセンサスプライマー：ｐＵ１Ｍ−ｐＵ
２Ｒ）がある。この方法で検出できるＨＰＶのタイプは
少ないが、簡便であり頻度の高い高リスク型、低リスク
型、ＨＰＶの検出に優れている。
【０００６】また、本発明者等は、ＬＣＲとＥ７領域を
はさむ３つのコンセンサスプライマーを同時に用いた M
ultiplex ＬＣＲ−Ｅ７ ＰＣＲ法を開示した。（笹川
等、臨床検査 ｖｏｌ．４３ ｎｏ．：３：３２９−３
４１，１９９９）。
はさむ３つのコンセンサスプライマーを同時に用いた M
ultiplex ＬＣＲ−Ｅ７ ＰＣＲ法を開示した。（笹川
等、臨床検査 ｖｏｌ．４３ ｎｏ．：３：３２９−３
４１，１９９９）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしこの方法でも、
ＨＰＶ４０，５４，５７型は全く検出できず、ＨＰＶ３
０，３２，３３，５１，５６，６６，７０，７２型など
の検出感度が低いという問題があった。
ＨＰＶ４０，５４，５７型は全く検出できず、ＨＰＶ３
０，３２，３３，５１，５６，６６，７０，７２型など
の検出感度が低いという問題があった。
【０００８】これらのすべてのタイプをほぼ完全に検出
できれば、より詳細にＨＰＶ感染の型を分析することが
できる。詳細な型の分析が可能となればＨＰＶ型の経過
を追うことによって前癌状態の検出や、悪性病変に移行
するかどうかについての詳細な分析が可能となり、より
正確な質的診断が可能となると共に学術的研究ツールと
しても有用である。
できれば、より詳細にＨＰＶ感染の型を分析することが
できる。詳細な型の分析が可能となればＨＰＶ型の経過
を追うことによって前癌状態の検出や、悪性病変に移行
するかどうかについての詳細な分析が可能となり、より
正確な質的診断が可能となると共に学術的研究ツールと
しても有用である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、特定のＤ
ＮＡ配列よりなるプライマーを組み合わせることによ
り、多数の異なるＨＰＶの型が検出でき、これにより、
例えば低リスク型か高リスク型のどちらに感染している
かが正確に診断可能となり、より正確な病態を把握でき
ると共に、前癌状態から癌へと移行するメカニズムの解
明に有用であることを知見し、本発明に至った。すなわ
ち本発明は、下記（１）〜（８）のＤＮＡ配列を混合し
て用いてすべての粘膜型ＨＰＶ感染型を同定する方法を
提供する。 （１）ＬＣＲＦ−１：ＷＷＡＲＧＧＷＧＴＲＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （２）ＬＣＲＦ−２：ＷＷＷＧＧＧＴＣＳＡＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （３）ＬＣＲＦ−３：ＷＲＧＧＫＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （４）ＬＣＲＦ−４：ＧＴＡＲＧＧＹＲＡＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＲＣＧＧ （５）Ｅ７Ｒ−１：ＴＣＭＫＣＣＴＣＴＫＣＹＴＣＴＧ
ＡＧＹＴＧＴ （６）Ｅ７Ｒ−２：ＴＣＷＴＣＭＴＣＨＴＣＲＴＣＴＧ
ＡＧＣＴＧＴ （７）Ｅ７Ｒ−３：ＣＡＣＷＡＷＡＴＴＫＴＧＴＧＡＣ
ＧＣＴＧＴＧＧおよび （８）Ｅ７Ｒ−４：ＡＴＧＡＹＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＴＡＲＲＣ ここで、Ｃ，Ａ，Ｔ，Ｇはそれぞれシントン、アデニ
ン、チミン、グアニンを表わしＲ，Ｗ，Ｙ，Ｋは以下の
デジェネレシイ（degeneracy）を表わす。 Ｒ：Ａ／Ｇ Ｗ：Ａ／Ｔ Ｙ：Ｃ／Ｔ Ｋ：Ｇ／
Ｔ 表１に、（１）〜（８）のプライマーとそれらに相補性
を有するHPV 型の領域を示した。PCR 増幅に必要なプラ
イマーペアーのうち、5'- プライマーをLCRF、3'- プラ
イマーをE7R と命名し、 LCR1, 2, 3, 4とE7R1, 2, 3,4
のそれぞれ４組のプライマーペアーを（１）〜（８）で
示すように設定した。例えば、LCRF1 は、１〜２０まで
記したHPV 型に相補性があり、もしHPV16 型を増幅した
い場合は、表１に示すように、このLCRF1 とE7R2プライ
マーとの組み合わせでPCR を行うと増幅できる。本発明
者は、（１）〜（８）のプライマーを混ぜて用いてPCR
を行うことで、多くの型のHPV を１つの反応液で検出で
きることを証明した。図２および図３はその１例であ
る。
ＮＡ配列よりなるプライマーを組み合わせることによ
り、多数の異なるＨＰＶの型が検出でき、これにより、
例えば低リスク型か高リスク型のどちらに感染している
かが正確に診断可能となり、より正確な病態を把握でき
ると共に、前癌状態から癌へと移行するメカニズムの解
明に有用であることを知見し、本発明に至った。すなわ
ち本発明は、下記（１）〜（８）のＤＮＡ配列を混合し
て用いてすべての粘膜型ＨＰＶ感染型を同定する方法を
提供する。 （１）ＬＣＲＦ−１：ＷＷＡＲＧＧＷＧＴＲＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （２）ＬＣＲＦ−２：ＷＷＷＧＧＧＴＣＳＡＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （３）ＬＣＲＦ−３：ＷＲＧＧＫＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （４）ＬＣＲＦ−４：ＧＴＡＲＧＧＹＲＡＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＲＣＧＧ （５）Ｅ７Ｒ−１：ＴＣＭＫＣＣＴＣＴＫＣＹＴＣＴＧ
ＡＧＹＴＧＴ （６）Ｅ７Ｒ−２：ＴＣＷＴＣＭＴＣＨＴＣＲＴＣＴＧ
ＡＧＣＴＧＴ （７）Ｅ７Ｒ−３：ＣＡＣＷＡＷＡＴＴＫＴＧＴＧＡＣ
ＧＣＴＧＴＧＧおよび （８）Ｅ７Ｒ−４：ＡＴＧＡＹＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＴＡＲＲＣ ここで、Ｃ，Ａ，Ｔ，Ｇはそれぞれシントン、アデニ
ン、チミン、グアニンを表わしＲ，Ｗ，Ｙ，Ｋは以下の
デジェネレシイ（degeneracy）を表わす。 Ｒ：Ａ／Ｇ Ｗ：Ａ／Ｔ Ｙ：Ｃ／Ｔ Ｋ：Ｇ／
Ｔ 表１に、（１）〜（８）のプライマーとそれらに相補性
を有するHPV 型の領域を示した。PCR 増幅に必要なプラ
イマーペアーのうち、5'- プライマーをLCRF、3'- プラ
イマーをE7R と命名し、 LCR1, 2, 3, 4とE7R1, 2, 3,4
のそれぞれ４組のプライマーペアーを（１）〜（８）で
示すように設定した。例えば、LCRF1 は、１〜２０まで
記したHPV 型に相補性があり、もしHPV16 型を増幅した
い場合は、表１に示すように、このLCRF1 とE7R2プライ
マーとの組み合わせでPCR を行うと増幅できる。本発明
者は、（１）〜（８）のプライマーを混ぜて用いてPCR
を行うことで、多くの型のHPV を１つの反応液で検出で
きることを証明した。図２および図３はその１例であ
る。
【００１０】ここで、R, W, Y, Kは、それぞれＡかＧ、
ＡかＴ、ＣかＴ、ＧかＴの組み合わせを示しており、例
えば WWARの配列は、A/T-A/T-A-A/G を示しており、DN
A 合成の時には、AAAA, ATAA, ATAG, AAAG, TAAA, TAA
G, TTAA, TTAGの８組のDNA が合成される。このように
塩基配列に微妙な違いをとりいれたプライマーは、Dege
nerated primerと呼ばれる。特定のプライマーの組合せ
を用いることによって、より多くのＨＰＶのDNA 配列に
結合することが可能となる。35タイプ以上ある粘膜型HP
V のE6遺伝子領域は、低リスク型、中間型、高リスク型
それぞれで機能が著しく異なるため、共通配列が少ない
ので、従来法の検出法では、すべての型を検出すること
が出来なかった。本発明では、特定の４組のプライマー
とそのそれぞれをDegenerateさせたプライマーを用いる
事によって、すべての粘膜型ＨＰＶ感染型を同定できる
事を始めて知見した。理論上ＬＣＲ１、２、３、４プラ
イマーは、 それぞれ３２、１６、８、１６組のプライマ
ーが出来る。一方、Ｅ７Ｒ１、２、３、４プライマーは
それぞれ、３２、２４、８、８組のプライマーが出来
る。本発明の同定試薬はこれらのプライマーの任意の組
合せを含む。検体中に含まれるＨＰＶの型が予め予想で
きる場合があり、 そのような場合は、 これらのプライマ
ーの特定の組合せを用いる事によってより精度が高く、
またより短時間でＨＰＶの型を決定する事が出来る。プ
ライマーの組合せ方法は、 当業者の試行実験や経験によ
っても行う事ができるが、コンピュータを使って最も効
率のよい組合せを計算することも出来る。
ＡかＴ、ＣかＴ、ＧかＴの組み合わせを示しており、例
えば WWARの配列は、A/T-A/T-A-A/G を示しており、DN
A 合成の時には、AAAA, ATAA, ATAG, AAAG, TAAA, TAA
G, TTAA, TTAGの８組のDNA が合成される。このように
塩基配列に微妙な違いをとりいれたプライマーは、Dege
nerated primerと呼ばれる。特定のプライマーの組合せ
を用いることによって、より多くのＨＰＶのDNA 配列に
結合することが可能となる。35タイプ以上ある粘膜型HP
V のE6遺伝子領域は、低リスク型、中間型、高リスク型
それぞれで機能が著しく異なるため、共通配列が少ない
ので、従来法の検出法では、すべての型を検出すること
が出来なかった。本発明では、特定の４組のプライマー
とそのそれぞれをDegenerateさせたプライマーを用いる
事によって、すべての粘膜型ＨＰＶ感染型を同定できる
事を始めて知見した。理論上ＬＣＲ１、２、３、４プラ
イマーは、 それぞれ３２、１６、８、１６組のプライマ
ーが出来る。一方、Ｅ７Ｒ１、２、３、４プライマーは
それぞれ、３２、２４、８、８組のプライマーが出来
る。本発明の同定試薬はこれらのプライマーの任意の組
合せを含む。検体中に含まれるＨＰＶの型が予め予想で
きる場合があり、 そのような場合は、 これらのプライマ
ーの特定の組合せを用いる事によってより精度が高く、
またより短時間でＨＰＶの型を決定する事が出来る。プ
ライマーの組合せ方法は、 当業者の試行実験や経験によ
っても行う事ができるが、コンピュータを使って最も効
率のよい組合せを計算することも出来る。
【００１１】E6遺伝子は、癌抑制遺伝子のp53 と結合
し、これを不活性化することによって癌遺伝子としての
機能を発揮し、癌を発生させると考えられているため、
各HPV型のE6遺伝子の配列の違いは、臨床上、非常に重
要な意味を持っている。すなわち、本方法で検出された
HPV がまだ報告されていない新しい型であった場合に
は、増幅されたE6遺伝子の塩基配列から臨床的悪性度の
推定が可能となるからである。
し、これを不活性化することによって癌遺伝子としての
機能を発揮し、癌を発生させると考えられているため、
各HPV型のE6遺伝子の配列の違いは、臨床上、非常に重
要な意味を持っている。すなわち、本方法で検出された
HPV がまだ報告されていない新しい型であった場合に
は、増幅されたE6遺伝子の塩基配列から臨床的悪性度の
推定が可能となるからである。
【００１２】また, 本発明は, 上記の（１）〜（８）の
混合物であるＨＰＶ感染型同定試薬を提供する。また、
上記の同定試薬を備えるＨＰＶ感染型同定キットを提供
する。キットには同定試薬が、好ましくは、凍結乾燥さ
れて備えられていればよい。さらに、必要な場合には、
ＰＣＲ装置、Dot blotやSouthern blot 、ELISA (EIA）
法等の測定装置、標識試薬やメンブラン用の資材等の少
なくとも１つを備えていてもよく、標識としては、アイ
ソトープ標識や酵素標識等を備えていてもよい。
混合物であるＨＰＶ感染型同定試薬を提供する。また、
上記の同定試薬を備えるＨＰＶ感染型同定キットを提供
する。キットには同定試薬が、好ましくは、凍結乾燥さ
れて備えられていればよい。さらに、必要な場合には、
ＰＣＲ装置、Dot blotやSouthern blot 、ELISA (EIA）
法等の測定装置、標識試薬やメンブラン用の資材等の少
なくとも１つを備えていてもよく、標識としては、アイ
ソトープ標識や酵素標識等を備えていてもよい。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】
【表３】
【００１６】
【表４】
【００１７】
【表５】
【００１８】
【表６】
【００１９】
【表７】
【００２０】
【表８】
【００２１】ここで、表中の記号は、 Ｒ：Ａ／Ｇ Ｗ：Ａ／Ｔ Ｙ：Ｃ／Ｔ Ｋ：Ｇ／Ｔ Ｓ：Ｇ／Ｃ Ｖ：Ｇ／Ａ／Ｃ Ｈ：Ａ／Ｔ／Ｃ Ｂ：Ｇ／Ｔ／Ｃ Ｎ：Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ 黒四角で囲った文字：ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ を表す。
【００２２】ＨＰＶの型はウイルスゲノム（Ｅ６，Ｅ
７，Ｌ１−ＤＮＡ）の相同性から分類され、発見された
順にアラビア数字で型決定されている。相同性が９０％
以上を同じタイプとし、２〜１０％の違いは subtypeと
して小文字のアルファベットで併記される（例えば、Ｈ
ＰＶ６ｂ，６ｃ）。また２％未満の違いは variantとし
て扱われる。Bernard らは、ＨＰＶの後期遺伝子（Ｌ
１）領域のＤＮＡのうち約２００塩基の相同性から系統
図を作成し、ＨＰＶタイプを大きくGroup Ａ−Ｅに分類
した（Bernard ＨＵ，et al ：Ｊ Infec Dis１７０：１
０７７−１０８５，１９９４）これを図１に示す。Grou
p Ａは、さらに１１タイプに細分化され、このうち、Gr
oup Ａ９に属するＨＰＶ１６型グループ、Group Ａ７の
ＨＰＶ１８型グループ、Group Ａ６のＨＰＶ５６型グル
ープなどが子宮頸癌の発生に関与する高リスク型と一般
に考えられている。一方、Group Ａ１０に属するＨＰＶ
６，１１，４２，４４，５５型などは良性の尖型コンジ
ローマや子宮頸部低悪性度病変（low-grade squamous i
ntraepithelial lesion ：ＬＳＩＬ）にのみ検出される
ため低リスク型と考えられている。また、ＣＩＮに検出
されるが頸癌では検出されないタイプを中間型としてさ
らに細分化する分類法もある。
７，Ｌ１−ＤＮＡ）の相同性から分類され、発見された
順にアラビア数字で型決定されている。相同性が９０％
以上を同じタイプとし、２〜１０％の違いは subtypeと
して小文字のアルファベットで併記される（例えば、Ｈ
ＰＶ６ｂ，６ｃ）。また２％未満の違いは variantとし
て扱われる。Bernard らは、ＨＰＶの後期遺伝子（Ｌ
１）領域のＤＮＡのうち約２００塩基の相同性から系統
図を作成し、ＨＰＶタイプを大きくGroup Ａ−Ｅに分類
した（Bernard ＨＵ，et al ：Ｊ Infec Dis１７０：１
０７７−１０８５，１９９４）これを図１に示す。Grou
p Ａは、さらに１１タイプに細分化され、このうち、Gr
oup Ａ９に属するＨＰＶ１６型グループ、Group Ａ７の
ＨＰＶ１８型グループ、Group Ａ６のＨＰＶ５６型グル
ープなどが子宮頸癌の発生に関与する高リスク型と一般
に考えられている。一方、Group Ａ１０に属するＨＰＶ
６，１１，４２，４４，５５型などは良性の尖型コンジ
ローマや子宮頸部低悪性度病変（low-grade squamous i
ntraepithelial lesion ：ＬＳＩＬ）にのみ検出される
ため低リスク型と考えられている。また、ＣＩＮに検出
されるが頸癌では検出されないタイプを中間型としてさ
らに細分化する分類法もある。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明の方法は, 少なくとも上記
の（１）〜（８）のＤＮＡ配列を４組のプライマーとし
て用いる方法であればよく、その方法はいずれでもよ
い。代表的には、以下の方法が例示できる。 １）サンプルＤＮＡを採取する。 対象例に対してサイトブラシで擦過細胞（scraped cel
l）を採取したり、組織、 尿沈渣等ヒト細胞を採取し,
ＰＢＳ（リン酸緩衝液）に入れて、 低温例えば−２０℃
で保存する。次に、サンプルからフェノール・クロロホ
ルム法でＤＮＡを抽出する。 ２）ＰＣＲ法 採取したサンプルＤＮＡを本発明の４組のプライマーを
用いてＰＣＲ法を使って増幅する。本発明の４組のプラ
イマーを用いるとサンプルＤＮＡ中の従来検出できなか
った多種類のＤＮＡ配列を増幅することができる。
の（１）〜（８）のＤＮＡ配列を４組のプライマーとし
て用いる方法であればよく、その方法はいずれでもよ
い。代表的には、以下の方法が例示できる。 １）サンプルＤＮＡを採取する。 対象例に対してサイトブラシで擦過細胞（scraped cel
l）を採取したり、組織、 尿沈渣等ヒト細胞を採取し,
ＰＢＳ（リン酸緩衝液）に入れて、 低温例えば−２０℃
で保存する。次に、サンプルからフェノール・クロロホ
ルム法でＤＮＡを抽出する。 ２）ＰＣＲ法 採取したサンプルＤＮＡを本発明の４組のプライマーを
用いてＰＣＲ法を使って増幅する。本発明の４組のプラ
イマーを用いるとサンプルＤＮＡ中の従来検出できなか
った多種類のＤＮＡ配列を増幅することができる。
【００２４】ＰＣＲ法の条件は、特に限定されないが、
好ましいＰＣＲ法の条件を、以下に例示する。抽出した
DNA と必要なPCR 反応溶液、dNTP, ８種類のプライマー
を混ぜた反応液後を、ＰＣＲを開始する前に、一旦温度
を上げて、その温度で保持した後、急冷する。例えば、
95-100℃、約３分加熱したのち、氷で急冷する。その後
に、耐熱性ポリメラーゼを加えて、PCR を開始する。こ
の操作法は、本発明のこのMultiplex PCR 法にとって非
常に有効である。この操作をしないと、時々、いくつか
のHPV 型のDNA を増幅できない場合がある。この理由
は、不明であるが、多くのプライマーを混ぜていると、
プライマー同士が結合しやすく、プライマーダイマーを
形成してPCR 反応が阻害されることによる可能性がある
と本発明者は考えている。上記の操作をすると、ほぼ10
0% PCR 反応がうまくいくことが実験で確認された。PC
R 反応は、TOYOBOのKOD Dashという耐熱性ポリメラーゼ
を用いた場合には、９５℃、1 分間の denaturing step
の後に５５〜６０℃、1 分, および７４℃、１分の反応
を 25- 35 サイクル行う。
好ましいＰＣＲ法の条件を、以下に例示する。抽出した
DNA と必要なPCR 反応溶液、dNTP, ８種類のプライマー
を混ぜた反応液後を、ＰＣＲを開始する前に、一旦温度
を上げて、その温度で保持した後、急冷する。例えば、
95-100℃、約３分加熱したのち、氷で急冷する。その後
に、耐熱性ポリメラーゼを加えて、PCR を開始する。こ
の操作法は、本発明のこのMultiplex PCR 法にとって非
常に有効である。この操作をしないと、時々、いくつか
のHPV 型のDNA を増幅できない場合がある。この理由
は、不明であるが、多くのプライマーを混ぜていると、
プライマー同士が結合しやすく、プライマーダイマーを
形成してPCR 反応が阻害されることによる可能性がある
と本発明者は考えている。上記の操作をすると、ほぼ10
0% PCR 反応がうまくいくことが実験で確認された。PC
R 反応は、TOYOBOのKOD Dashという耐熱性ポリメラーゼ
を用いた場合には、９５℃、1 分間の denaturing step
の後に５５〜６０℃、1 分, および７４℃、１分の反応
を 25- 35 サイクル行う。
【００２５】３）ＤＮＡ検出 ｉ）増幅したＤＮＡは、電気泳動で流して目的とするサ
イズのＤＮＡバンドを確認する。 ii）特定のＨＰＶの型のＤＮＡ配列のプローブを用い
て、Dot blot法やSouthernblot 法でＤＮＡの型を検出
する。
イズのＤＮＡバンドを確認する。 ii）特定のＨＰＶの型のＤＮＡ配列のプローブを用い
て、Dot blot法やSouthernblot 法でＤＮＡの型を検出
する。
【００２６】４）ＨＰＶの型の決定 ｉ）RFLP（restriction fragment length polymorphis
m）：適当な制限酵素で切断しその泳動パターンの違い
を見て、ＨＰＶの型を決定する。制限酵素は、ＡｖａI
I、ＲｓａＩ、ＤｄｅＩ、ＡＣＣＩ、ＢａｍＨＩ等が挙
げられる。図３は、 表２に示す制限酵素を用いてRFLP法
によりＨＰＶの型を決定した１例の泳動パターンを示し
ている。 ii）ハイブリダイゼーション法 それぞれのＨＰＶの型に特異的なＤＮＡプローブで増幅
したＤＮＡとハイブリダイズさせ型決定を行う。Dot bl
otやSouthern blot 、ELISA(EIA)法を用いる。標識とし
ては、アイソトープ標識、酵素標識等を用いる事が
出来る。
m）：適当な制限酵素で切断しその泳動パターンの違い
を見て、ＨＰＶの型を決定する。制限酵素は、ＡｖａI
I、ＲｓａＩ、ＤｄｅＩ、ＡＣＣＩ、ＢａｍＨＩ等が挙
げられる。図３は、 表２に示す制限酵素を用いてRFLP法
によりＨＰＶの型を決定した１例の泳動パターンを示し
ている。 ii）ハイブリダイゼーション法 それぞれのＨＰＶの型に特異的なＤＮＡプローブで増幅
したＤＮＡとハイブリダイズさせ型決定を行う。Dot bl
otやSouthern blot 、ELISA(EIA)法を用いる。標識とし
ては、アイソトープ標識、酵素標識等を用いる事が
出来る。
【００２７】本発明者は、HPV のコピー数の少ない臨床
検体からもHPV DNA を検出する為に、スクリーニングに
FITC標識した合成DNA プローブを用いた、PCR/ Souther
n blot法で検出を行った。好ましい合成プローブと配列
を以下に例示する。これらのプローブは、少なくとも１
つ用いればよいが、組合せて用いる事もできる。 １．HPV16-アンチセンスプローブ (H16ASPB)：5'-AATTG
CTCATARCAGTAKAGRTCAGTTG-3' ２．HPV18-アンチセンスプローブ(H18ASPB) ：5'-TCWYT
AAAWGCAAATTCAWATACCTC-3' ３．HPV-51/56-アンチセンスプローブ (H51/56ASPB) ：
5'-AATTGYTCRTWGCATTGYAGGTCA-3' ４．HPV-6/11- アンチセンスプローブ (H6/11ASPB)：5'
-CAATGDAARCAGCGACCCTTCCA-3'
検体からもHPV DNA を検出する為に、スクリーニングに
FITC標識した合成DNA プローブを用いた、PCR/ Souther
n blot法で検出を行った。好ましい合成プローブと配列
を以下に例示する。これらのプローブは、少なくとも１
つ用いればよいが、組合せて用いる事もできる。 １．HPV16-アンチセンスプローブ (H16ASPB)：5'-AATTG
CTCATARCAGTAKAGRTCAGTTG-3' ２．HPV18-アンチセンスプローブ(H18ASPB) ：5'-TCWYT
AAAWGCAAATTCAWATACCTC-3' ３．HPV-51/56-アンチセンスプローブ (H51/56ASPB) ：
5'-AATTGYTCRTWGCATTGYAGGTCA-3' ４．HPV-6/11- アンチセンスプローブ (H6/11ASPB)：5'
-CAATGDAARCAGCGACCCTTCCA-3'
【００２８】
【実施例】以下に実施例により本発明を説明するが、 本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 １）材料：患者の細胞診を行った後、サイトブラシで擦
過細胞（scraped cell）を採取し、ＰＢＳに入れ−２０
℃で保存した。 ２）ＤＮＡ抽出：保存したサンプルから細胞成分を遠沈
した後、フェノール・クロロホルム法でＤＮＡを抽出し
た。 ３）ＰＣＲ：をテンプレートとして加えて、 以下の条件
でＰＣＲを行った。抽出したDNA と必要なPCR 反応溶
液、dNTP, 8 種類のプライマー｛コンセンサスプライマ
ー（本発明の（１）〜（８）のＤＮＡ）｝を混ぜた反応
液を、ＰＣＲを開始する前に、95-100℃、約３分加熱し
たのち、氷で急冷した。その後に、耐熱性ポリメラーゼ
を加えて、PCR を開始する。PCR 反応は、TOYOBOのKOD
Dashという耐熱性ポリメラーゼを用いて、95°C 、１分
間の denaturing stepの後に５５〜６０℃、1 分, およ
び７４℃、１分の反応を 25- 35 サイクル行った。
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 １）材料：患者の細胞診を行った後、サイトブラシで擦
過細胞（scraped cell）を採取し、ＰＢＳに入れ−２０
℃で保存した。 ２）ＤＮＡ抽出：保存したサンプルから細胞成分を遠沈
した後、フェノール・クロロホルム法でＤＮＡを抽出し
た。 ３）ＰＣＲ：をテンプレートとして加えて、 以下の条件
でＰＣＲを行った。抽出したDNA と必要なPCR 反応溶
液、dNTP, 8 種類のプライマー｛コンセンサスプライマ
ー（本発明の（１）〜（８）のＤＮＡ）｝を混ぜた反応
液を、ＰＣＲを開始する前に、95-100℃、約３分加熱し
たのち、氷で急冷した。その後に、耐熱性ポリメラーゼ
を加えて、PCR を開始する。PCR 反応は、TOYOBOのKOD
Dashという耐熱性ポリメラーゼを用いて、95°C 、１分
間の denaturing stepの後に５５〜６０℃、1 分, およ
び７４℃、１分の反応を 25- 35 サイクル行った。
【００２９】４）型決定 制限酵素、ＡｖａII、ＲｓａＩ、ＤｄｅＩ、ＡＣＣＩ、
ＢａｍＨＩを用いて、上記で増幅されたＰＣＲ産物であ
るＤＮＡを切断し、寒天ゲルで電気泳動し、それをナイ
ロンメンブレンにトランスファーしたものに、FITC標識
した合成DNA プローブを用いた、PCR/ Southern blot法
で検出を行った。この方法は、HPV のコピー数の少ない
臨床検体からもHPV DNA を検出するのに有用である。ス
クリーニングに用いたプローブと配列は、以下のもので
あった。 １．HPV16-アンチセンスプローブ (H16ASPB)：5'-AATTG
CTCATARCAGTAKAGRTCAGTTG-3' ２．HPV18-アンチセンスプローブ(H18ASPB) ：5'-TCWYT
AAAWGCAAATTCAWATACCTC-3' ３．HPV-51/56-アンチセンスプローブ (H51/56ASPB) ：
5'-AATTGYTCRTWGCATTGYAGGTCA-3' ４．HPV-6/11- アンチセンスプローブ (H6/11ASPB)：5'
-CAATGDAARCAGCGACCCTTCCA-3'
ＢａｍＨＩを用いて、上記で増幅されたＰＣＲ産物であ
るＤＮＡを切断し、寒天ゲルで電気泳動し、それをナイ
ロンメンブレンにトランスファーしたものに、FITC標識
した合成DNA プローブを用いた、PCR/ Southern blot法
で検出を行った。この方法は、HPV のコピー数の少ない
臨床検体からもHPV DNA を検出するのに有用である。ス
クリーニングに用いたプローブと配列は、以下のもので
あった。 １．HPV16-アンチセンスプローブ (H16ASPB)：5'-AATTG
CTCATARCAGTAKAGRTCAGTTG-3' ２．HPV18-アンチセンスプローブ(H18ASPB) ：5'-TCWYT
AAAWGCAAATTCAWATACCTC-3' ３．HPV-51/56-アンチセンスプローブ (H51/56ASPB) ：
5'-AATTGYTCRTWGCATTGYAGGTCA-3' ４．HPV-6/11- アンチセンスプローブ (H6/11ASPB)：5'
-CAATGDAARCAGCGACCCTTCCA-3'
【００３０】PCR 産物を、寒天ゲルで電気泳動し、それ
をナイロンメンブレンにトランスファーさせたものに、
上記プローブを (Tm= −１０℃）の条件でハイブリダイ
ズさせ、結合したプローブを、ビオチン標識抗FITC抗
体、ステレプトアビジンペルオキシダーゼ法にて化学発
色させる方法（アマシャムECL-DNA 検出キット）を用い
てPCR/ Southern blot hybridizationを行った。それぞ
れのアンチセンスプローブをもちいて、ハイブリダイゼ
ーションを行うと、HPV16 型グループ（A9）、HPV18 型
グループ（A7）、HPV51/56型グループ（A5/ A6）、HPV6
/11 型グループ（A10 ）、それぞれのグループ別型決定
が可能である。最初のスクリーニングには、すべてのブ
ローブを混合して行い、陽性症例を確定した。そののち
のHPV 型決定は、原則としてRFLP法にて行ったが、コピ
ー数の少ない症例や混合型感染症例に対しては、上記の
それぞれのプローブを用いて個別にSouthern blot を行
い、グループ特異的な型判定を行った。図１に示したよ
うに、グループA7/ A9は高リスク型、A5/ A6は高リスク
型か中間型、A10 は低リスク型といわれており、これら
のプローブでHPV グループを判別することによって、臨
床に役立てる可能性が期待される。ＲＦＬＰ法に用いた
切断パターンを表２に示し、得られた結果を図２で示し
た。
をナイロンメンブレンにトランスファーさせたものに、
上記プローブを (Tm= −１０℃）の条件でハイブリダイ
ズさせ、結合したプローブを、ビオチン標識抗FITC抗
体、ステレプトアビジンペルオキシダーゼ法にて化学発
色させる方法（アマシャムECL-DNA 検出キット）を用い
てPCR/ Southern blot hybridizationを行った。それぞ
れのアンチセンスプローブをもちいて、ハイブリダイゼ
ーションを行うと、HPV16 型グループ（A9）、HPV18 型
グループ（A7）、HPV51/56型グループ（A5/ A6）、HPV6
/11 型グループ（A10 ）、それぞれのグループ別型決定
が可能である。最初のスクリーニングには、すべてのブ
ローブを混合して行い、陽性症例を確定した。そののち
のHPV 型決定は、原則としてRFLP法にて行ったが、コピ
ー数の少ない症例や混合型感染症例に対しては、上記の
それぞれのプローブを用いて個別にSouthern blot を行
い、グループ特異的な型判定を行った。図１に示したよ
うに、グループA7/ A9は高リスク型、A5/ A6は高リスク
型か中間型、A10 は低リスク型といわれており、これら
のプローブでHPV グループを判別することによって、臨
床に役立てる可能性が期待される。ＲＦＬＰ法に用いた
切断パターンを表２に示し、得られた結果を図２で示し
た。
【００３１】
【表９】
【００３２】
【表１０】
【００３３】図３は、HPV29 タイプについて、PCR 後に
Southern blot hybridization 法を行った結果を示す。
上記の４つのアンチセンスプローブにて27タイプが検出
された。HPV71, 73 はいずれのプローブでも検出できな
かった。HPV44, 55 はすべてに反応し、HPV40, 70 は、
HPV16/18混合プローブとHPV6/11 プローブ、HPV52 はHP
V16/18混合プローブとHPV51/56プローブの両方に反応し
たが、高リスク型は、HPV16/18混合プローブ、中間型は
HPV51/56プローブ、低リスク型はHPV6/11 プローブにそ
れぞれ強く反応する傾向がみられた。図２、図３の結果
から、従来検出感度が低いか、検出されなかった、ＨＰ
Ｖの型である４０、 ５４、 ３０、 ３２、 ３３、 ５６、６
６、７０、 ７２型が検出できた事がわかる。
Southern blot hybridization 法を行った結果を示す。
上記の４つのアンチセンスプローブにて27タイプが検出
された。HPV71, 73 はいずれのプローブでも検出できな
かった。HPV44, 55 はすべてに反応し、HPV40, 70 は、
HPV16/18混合プローブとHPV6/11 プローブ、HPV52 はHP
V16/18混合プローブとHPV51/56プローブの両方に反応し
たが、高リスク型は、HPV16/18混合プローブ、中間型は
HPV51/56プローブ、低リスク型はHPV6/11 プローブにそ
れぞれ強く反応する傾向がみられた。図２、図３の結果
から、従来検出感度が低いか、検出されなかった、ＨＰ
Ｖの型である４０、 ５４、 ３０、 ３２、 ３３、 ５６、６
６、７０、 ７２型が検出できた事がわかる。
【００３４】５）ハイブリッドキャプチャーアッセイHy
brid Capture assay法により, 同様の測定を行い比較例
として表３に示した。三菱化学ジーシーエルの装置を用
いた。この方法は、サンプルＤＮＡを変性したのち各種
ＨＰＶに特異的なＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ
たＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをプレート上に固相化
し、 抗ＤＮＡ／ＲＮＡ抗体で反応させ化学発光による吸
光度を測定して、ＨＰＶの型を決定する方法である。こ
の方法をコントロールとして用いて、感度の比較を行っ
た。結果を表３に示した。
brid Capture assay法により, 同様の測定を行い比較例
として表３に示した。三菱化学ジーシーエルの装置を用
いた。この方法は、サンプルＤＮＡを変性したのち各種
ＨＰＶに特異的なＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ
たＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをプレート上に固相化
し、 抗ＤＮＡ／ＲＮＡ抗体で反応させ化学発光による吸
光度を測定して、ＨＰＶの型を決定する方法である。こ
の方法をコントロールとして用いて、感度の比較を行っ
た。結果を表３に示した。
【００３５】
【表１１】
【００３６】
【発明の効果】従来検出感度が低いか、検出されなかっ
た、ＰＣＲ法が改良され、本発明方法によれば、グルー
プ特異的プローブを用いて、グループ別の粘膜型ＨＰＶ
の型がすべて判別できる。
た、ＰＣＲ法が改良され、本発明方法によれば、グルー
プ特異的プローブを用いて、グループ別の粘膜型ＨＰＶ
の型がすべて判別できる。
【図１】 ＨＰＶの型を示す模式図である。
【図２】 RFLP法によるＨＰＶの型を決定した結果の泳
動パターンの写真のコピーを示す模式図である。
動パターンの写真のコピーを示す模式図である。
【図３】 HPV29 タイプについて、PCR 後にSouthern b
lot hybridization 法を行った結果の泳動パターンの写
真 (検出可能なＨＰＶ型と、このアッセイ系の検出感度
を示した）のコピーを示す模式図である。
lot hybridization 法を行った結果の泳動パターンの写
真 (検出可能なＨＰＶ型と、このアッセイ系の検出感度
を示した）のコピーを示す模式図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 下記（１）〜（８）のＤＮＡ配列を用い
てＨＰＶ感染型を同定する方法。 （１）ＬＣＲＦ−１：ＷＷＡＲＧＧＷＧＴＲＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （２）ＬＣＲＦ−２：ＷＷＷＧＧＧＴＣＳＡＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （３）ＬＣＲＦ−３：ＷＲＧＧＫＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （４）ＬＣＲＦ−４：ＧＴＡＲＧＧＹＲＡＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＲＣＧＧ （５）Ｅ７Ｒ−１：ＴＣＭＫＣＣＴＣＴＫＣＹＴＣＴＧ
ＡＧＹＴＧＴ （６）Ｅ７Ｒ−２：ＴＣＷＴＣＭＴＣＨＴＣＲＴＣＴＧ
ＡＧＣＴＧＴ （７）Ｅ７Ｒ−３：ＣＡＣＷＡＷＡＴＴＫＴＧＴＧＡＣ
ＧＣＴＧＴＧＧおよび （８）Ｅ７Ｒ−４：ＡＴＧＡＹＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＴＡＲＲＣ ここで、Ｃ，Ａ，Ｔ，Ｇはそれぞれシントン、アデニ
ン、チミン、グアニンを表わしＲ，Ｗ，Ｙ，Ｋは以下の
デジェネレシイ（degeneracy）を表わす。 Ｒ：Ａ／Ｇ Ｗ：Ａ／Ｔ Ｙ：Ｃ／Ｔ Ｋ：Ｇ／
Ｔ - 【請求項２】（１）ＬＣＲＦ−１：ＷＷＡＲＧＧＷＧＴ
ＲＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧ （２）ＬＣＲＦ−２：ＷＷＷＧＧＧＴＣＳＡＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （３）ＬＣＲＦ−３：ＷＲＧＧＫＴＴＡＧＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＡＣＧＧ （４）ＬＣＲＦ−４：ＧＴＡＲＧＧＹＲＡＧＡＣＣＧＡ
ＡＡＲＣＧＧ （５）Ｅ７Ｒ−１：ＴＣＭＫＣＣＴＣＴＫＣＹＴＣＴＧ
ＡＧＹＴＧＴ （６）Ｅ７Ｒ−２：ＴＣＷＴＣＭＴＣＨＴＣＲＴＣＴＧ
ＡＧＣＴＧＴ （７）Ｅ７Ｒ−３：ＣＡＣＷＡＷＡＴＴＫＴＧＴＧＡＣ
ＧＣＴＧＴＧＧおよび （８）Ｅ７Ｒ−４：ＡＴＧＡＹＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧ
ＴＡＲＲＣを含有するＨＰＶ感染型同定試薬。 ここで、Ｃ，Ａ，Ｔ，Ｇはそれぞれシントン、アデニ
ン、チミン、グアニンを表わしＲ，Ｗ，Ｙ，Ｋは以下の
デジェネレシイ（degeneracy）を表わす。 Ｒ：Ａ／Ｇ Ｗ：Ａ／Ｔ Ｙ：Ｃ／Ｔ Ｋ：Ｇ／
Ｔ - 【請求項３】請求項２の同定試薬を備えることを特徴と
するＨＰＶ感染型同定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000140602A JP2001321168A (ja) | 2000-05-12 | 2000-05-12 | Ｈｐｖ感染型の同定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000140602A JP2001321168A (ja) | 2000-05-12 | 2000-05-12 | Ｈｐｖ感染型の同定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001321168A true JP2001321168A (ja) | 2001-11-20 |
Family
ID=18647860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000140602A Pending JP2001321168A (ja) | 2000-05-12 | 2000-05-12 | Ｈｐｖ感染型の同定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001321168A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7354719B2 (en) | 2004-12-08 | 2008-04-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| JP2008524983A (ja) * | 2004-10-04 | 2008-07-17 | グッジェン インク | ヒトパピローマウイルスのプローブおよびそれを使用するｄｎａチップ |
| JP2009533030A (ja) * | 2006-04-11 | 2009-09-17 | ビオ−ラド・パストゥール | リアルタイムマルチプレックス増幅によるｈｐｖ検出および定量化 |
-
2000
- 2000-05-12 JP JP2000140602A patent/JP2001321168A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6010011705, Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．， ６７［２］ ｐ．１２７−１３９ （Ａｐｒｉｌ ２０００） * |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008524983A (ja) * | 2004-10-04 | 2008-07-17 | グッジェン インク | ヒトパピローマウイルスのプローブおよびそれを使用するｄｎａチップ |
| US8835114B2 (en) | 2004-12-08 | 2014-09-16 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, reaction mixtures and methods for detecting nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US10047407B2 (en) | 2004-12-08 | 2018-08-14 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US7682792B2 (en) | 2004-12-08 | 2010-03-23 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| US8026066B2 (en) | 2004-12-08 | 2011-09-27 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| US8334098B2 (en) | 2004-12-08 | 2012-12-18 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| US8828660B2 (en) | 2004-12-08 | 2014-09-09 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, reaction mixtures and methods for detecting nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US8574841B2 (en) | 2004-12-08 | 2013-11-05 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, reaction mixtures and methods for detecting nucleic acids from type A1 and/or type C1 human papillomavirus |
| US9074263B2 (en) | 2004-12-08 | 2015-07-07 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and reaction mixtures for the detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US11624096B2 (en) | 2004-12-08 | 2023-04-11 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US10968494B2 (en) | 2004-12-08 | 2021-04-06 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US8785125B2 (en) | 2004-12-08 | 2014-07-22 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, reaction mixtures and methods for detecting nucleic acids from type A1 and/or type C1 human papillomavirus |
| US9328392B2 (en) | 2004-12-08 | 2016-05-03 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and reaction mixtures for the detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US9765407B2 (en) | 2004-12-08 | 2017-09-19 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US11359252B2 (en) | 2004-12-08 | 2022-06-14 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US10465255B2 (en) | 2004-12-08 | 2019-11-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US10640836B2 (en) | 2004-12-08 | 2020-05-05 | Gen-Probe Incorporated | Separation of human papillomavirus nucleic acids from biological samples |
| US10711317B2 (en) | 2004-12-08 | 2020-07-14 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomavirus |
| US7354719B2 (en) | 2004-12-08 | 2008-04-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
| JP2009533030A (ja) * | 2006-04-11 | 2009-09-17 | ビオ−ラド・パストゥール | リアルタイムマルチプレックス増幅によるｈｐｖ検出および定量化 |
| US8518639B2 (en) | 2006-04-11 | 2013-08-27 | Bio-Rad Innovations | HPV detection and quantification by real-time multiplex amplification |
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