CN113817876B - 用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物及试剂盒。所述扩增引物组合物包括第一引物组与第二引物组，所述第一引物组包括第一正向引物及第一反向引物，所述第二引物组包括第二正向引物及第二反向引物，并且，所述第一正向引物、第一反向引物、第二正向引物、第二反向引物的每个序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是3'末端碱基，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3‑6个碱基，经锁核酸修饰的碱基为腺嘌呤和/或胸腺嘧啶。本发明还公开了用于检测新型冠状病毒的试剂盒。本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，可用于新型冠状病毒肺炎的快速检测，应用前景广阔。

Description

用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物，尤其涉及经锁核酸修饰、化学基团标记的用于新型冠状病毒PCR扩增结合核酸分子捕获的特异性引物，及相应的试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒（简称2019-nCoV）在系统分类上属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。冠状病毒属的病毒是具囊膜（envelope）、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。
目前检测2019-nCoV的常见方法有：酶联免疫法，但是该方法灵敏度低，假阳性高，易造成误检；荧光定量PCR法，该方法灵敏度较高，但仪器成本投入较大，对操作人员要求较高；血常规及CT检测法，该方法比较直观，但同样存在仪器成本大，操作繁琐，对医务人员操作要求高，且耗时较长，不够便捷快速。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物，其包括：
第一引物组，所述第一引物组适于特异性扩增ORF1ab基因靶标区域；
第二引物组，所述第二引物组适于特异性扩增N基因靶标区域；
其中，所述第一引物组包括：
第一正向引物，所述第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
第一反向引物，所述第一反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述第二引物组包括：
第二正向引物，所述第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
第二反向引物，所述第二反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
并且，所述第一正向引物、第一反向引物、第二正向引物、第二反向引物的每个序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是相应序列的3'末端碱基，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3-6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为腺嘌呤和/或胸腺嘧啶。
本发明实施例还提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其包括：前面所述的用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1）本发明提供的用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物中的各引物具有极高的扩增效率和特异性，能够高效率、特异性地扩增出目的基因片段；
2）本发明采用锁核酸修饰ORF1ab基因、N基因对应的上下游引物，锁核酸修饰后，大幅度提高了引物的Tm值和PCR扩增的退火温度，从而高效率地降低引物二聚体和非特异性扩增片段的形成，提高了扩增的特异性，避免了胶体金试条检测的假阳性；
3）本发明采用化学基团标记ORF1ab基因、N基因对应的上下游引物，上下游引物采用不同化学基团标记，分别与试条上对应的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，进一步提高了该种检测方法的特异性；
4）与ELISA和免疫胶体金技术相比，本发明充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件。本发明提供的试剂盒能够用于新型冠状病毒肺炎的快速定性检测，且检测方法具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，为2019-nCoV的检测提供了一种更为灵敏、更为准确、更为便捷、更为快速的检测方法，应用前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型方案中核酸捕获金标试纸条的原理示意图；
图2是2019-nCoV快速检测试纸条的结构示意图截面图；
图3是金标试纸条判读结果标准图；
图4A和图4B是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中零个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4C和图4D是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中一个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4E和图4F是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中两个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4G和图4H是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中三个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图4I和图4J是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图5A和图5B是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中连续四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图6A和图6B是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中只有G和C碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图；
图7A和图7B是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中是否修饰引物的3'末端碱基对引物二聚体的影响图；
图8A是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图；
图8B是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中零个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图；
图9是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测灵敏度实验结果图；
图10A是本发明一典型方案中2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图；
图10B是本发明一典型方案中2019-nCoV-N引物中零个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图；
图11是本发明一典型方案中2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测灵敏度实验结果图；
图12A是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图；
图12B是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中零个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图；
图13是本发明一典型方案中2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测特异性实验结果图；
图14A是本发明一典型方案中2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图；
图14B是本发明一典型方案中2019-nCoV-N引物中零个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图；
图15是本发明一典型方案中2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测特异性实验结果图。
附图说明：1-衬板，2-样品垫，3-金标结合垫，4-包被膜，5-检测印迹线，6-对照印迹线，7-吸水垫，8-1-样品浸入端保护膜，8-2-手柄端保护膜。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是利用PCR扩增与核酸捕获金标试纸条相结合的方法，对2019-nCoV的ORF1ab基因和N基因的保守区域重新设计、锁核酸修饰、化学基团标记特异性引物，优化反应体系，以核酸捕获金标试纸条为载体对PCR扩增产物进行检测，检测原理示意可参阅图1。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
作为本发明实施例的一个方面，本发明提供了一种用于检测2019新型冠状病毒（以下可简称为2019-nCoV）的扩增引物组合物，其包括：
第一引物组，所述第一引物组适于特异性扩增ORF1ab基因靶标区域；
第二引物组，所述第二引物组适于特异性扩增N基因靶标区域；
其中，所述第一引物组包括：
第一正向引物（下文也可称为上游引物），所述第一正向引物的核苷酸序列如SEQID No.1所示；
第一反向引物（下文也可称为下游引物），所述第一反向引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示；
所述第二引物组包括：
第二正向引物，所述第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
第二反向引物，所述第二反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，本发明提供的用于2019-nCoV PCR扩增和核酸捕获的特异性引物根据2019-nCoV的ORF1ab基因和N基因的保守区域设计，用以2019-nCoV的定性检测。
进一步地，所述扩增引物组合物中ORF1ab基因、N基因分别对应的上游引物具有下列序列表1中2019-nCoV-ORF1ab-F（即前述的第一正向引物）和2019-nCoV-N-F（即前述的第二正向引物）所示的核苷酸序列，ORF1ab基因、N基因分别对应的下游引物具有下列序列表1中2019-nCoV-ORF1ab-R（即前述的第一反向引物）和2019-nCoV-N-R（即前述的第二反向引物）所示的核苷酸序列。
表1
Figure 199230DEST_PATH_IMAGE001
本发明所设计的以上各引物能够高效率、特异性地扩增出目的基因片段。
并且，本发明提供的扩增引物组合物中第一正向引物、第一反向引物、第二正向引物、第二反向引物的每个序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是相应序列的3'末端碱基，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3-6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为腺嘌呤A和/或胸腺嘧啶T。经过该种锁核酸方法修饰后，大幅度提高了引物的Tm值和PCR扩增的退火温度，从而高效率地降低引物二聚体和非特异性扩增片段的形成，提高了扩增的特异性，避免了胶体金试条检测的假阳性。
在一些优选实施方案中，从5’末端到3'末端方向，所述第一正向引物（即2019-nCoV-ORF1ab-F）中锁核酸的修饰位点可以分别是第6位的胸腺嘧啶T、第12位的腺嘌呤A、第18位的腺嘌呤A、第24位的胸腺嘧啶T，具体可以参见表2所示。
在一些优选实施方案中，从5’末端到3'末端方向，所述第一反向引物（即2019-nCoV-ORF1ab-R）中锁核酸的修饰位点可以分别是第6位的胸腺嘧啶T、第11位的胸腺嘧啶T、第16位的腺嘌呤A、第21位的腺嘌呤A，具体可以参见表2所示。
在一些优选实施方案中，从5’末端到3'末端方向，所述第二正向引物（即2019-nCoV-N-F）中锁核酸的修饰位点可以分别是第7位的腺嘌呤A、第12位的腺嘌呤A、第17位的腺嘌呤A、第21位的胸腺嘧啶T，具体可以参见表2所示。
在一些优选实施方案中，从5’末端到3'末端方向，所述第二反向引物（即2019-nCoV-N-R）中锁核酸的修饰位点可以分别是第2位的胸腺嘧啶T、第9位的胸腺嘧啶T、第14位的胸腺嘧啶T、第19位的胸腺嘧啶T，具体可以参见表2所示。
表2 修饰引物序列表（+N碱基为锁核酸修饰）
Figure 54054DEST_PATH_IMAGE002
在一些优选实施方案中，所述第一正向引物、第一反向引物、第二正向引物、第二反向引物的5’末端均经过化学基团标记。
进一步地，所述第一正向引物、第二正向引物的5’末端所标记的化学基团与所述第一反向引物、第二反向引物的5’末端所标记的化学基团不同。
其中具体的，所述第一正向引物、第二正向引物的5’末端标记的是Biotin基团。而所述第一反向引物、第二反向引物的5’末端标记的是FITC基团。
本发明以上各上下游引物两端采用不同化学基团标记，分别与试条上包被的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，进一步提高了该种检测方法的特异性。
作为本发明实施例的另一个方面，本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其包括：前面所述的用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物。
进一步地，本发明所提供的试剂盒包括用于对2019-nCoV核酸进行PCR扩增的扩增引物组合物，以及对其PCR扩增产物进行检测的金标试纸条。
因此，本发明还提供了一种特异性强、灵敏度高，能快速、简便地检测2019-nCoV的核酸捕获金标试纸条及其检测方法。该方法是以待检样品中的核酸为检测对象，特异性及灵敏度均较好。
在一些实施方案之中，请参阅图2所示，本发明提供的一种用于2019-nCoV核酸捕获的金标试纸条含有长条型衬板1，衬板1的上表面从一端到另一端依次粘贴有样品垫2、吸附有FITC金标抗体的金标结合垫3、包被膜4及吸水垫7，包被膜4上印制有Biotin抗体的隐形检测印迹线5和羊抗鼠二抗的隐形对照印迹线6，所述的吸水垫7是滤纸或滤油纸。
进一步地，所述衬板1为硬质PVC塑胶条。
进一步地，所述样品垫2为聚酯膜。
进一步地，所述包被膜4为硝酸纤维素膜。
进一步地，所述金标试纸条的两端覆有保护膜，一端的样品浸入端保护膜8-1覆盖在样品垫2和金标结合垫3上，样品浸入端保护膜8-1上印制有样品标识线；另一端的手柄端保护膜8-2覆盖在吸水垫7上。
进一步地，所述金标试纸条还设有由底座和面板组成的外壳，底座上设有衬板1的试纸芯定位槽，面板上设有观察窗和加样孔，底座和面板之间以面板凹槽和凸条插接相连。
进一步地，所述包被膜4上的隐性检测印迹线5和隐性对照印迹线6为线条型。
本发明提供的金标试纸条的检测线包被上游引物标记化学基团的抗体，金垫上干燥有胶体金偶联下游引物标记化学基团的抗体。由于该试纸条采用了核酸捕获的方法，经PCR扩增后样本含量得到了几何级数的放大，因此大大提高了试纸条的检测灵敏度。并且，通过对PCR产物进行一定量的稀释，再进行上样，可极大提高胶体金试纸条的检测灵敏度。
综上，藉由上述技术方案，本发明充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件。本方法使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，为2019-nCoV的检测提供了一种更为灵敏、更为准确、更为便捷、更为快速的检测方法。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一、对2019-nCoV进行PCR的引物设计
参照GenBank收录的2019-nCoV基因组序列，选择2019-nCoV的ORF1ab基因和N基因保守区域，采用ABI PrimerExpress 3.0 PCR引物设计软件，设计合成引物，最终所获各引物序列如下。
Figure 505895DEST_PATH_IMAGE003
二、锁核酸修饰PCR引物
本实施例采用的引物修饰为：各上游引物和下游引物分别有四个碱基经过锁核酸修饰（+N碱基为锁核酸修饰）。
2.1 2019-nCoV-ORF1ab 锁核酸修饰引物
2.1.1 2019-nCoV-ORF1ab 四个碱基锁核酸修饰引物（详见前文表2）
F：5’-AATGT+TAATGC+ACTTTT+ATCTAC+T-3’
R：5’-AACCG+TTCAA+TCATA+AGTGT+A-3’
2.1.2 2019-nCoV-ORF1ab 零个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-AATGTTAATGCACTTTTATCTACT-3’
R：5’-AACCGTTCAATCATAAGTGTA-3’
2.1.3 2019-nCoV-ORF1ab 一个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-AATGTTAATGCACTTTTATCTAC+T-3’
R：5’-AACCGTTCAATCATAAGTGT+A-3’
2.1.4 2019-nCoV-ORF1ab 二个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-AATGTTAATGC+ACTTTTATCTAC+T-3’
R：5’-AACCGTTCAA+TCATAAGTGT+A-3’
2.1.5 2019-nCoV-ORF1ab 三个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-AATGTTAATGCAC+TTTTA+TCTAC+T-3’
R：5’-AACCGTTCA+ATCATA+AGTGT+A-3’
2.1.6 2019-nCoV-ORF1ab 连续四个碱基锁核酸修饰引物
F：5’-AATGTTAA+T+G+C+ACTTTTATCTACT-3’
R：5’-AACCGTT+C+A+A+TCATAAGTGTA-3’
2.1.7 2019-nCoV-ORF1ab 只有GC碱基锁核酸修饰引物
F：5’-AAT+GTTAAT+GCA+CTTTTATCTA+CT-3’
R：5’-AAC+CGTT+CAAT+CATAAGT+GTA-3’
2.1.8 2019-nCoV-ORF1ab 非3’末端碱基锁核酸修饰引物
F：5’-AATGTT+AATGC+ACTTT+TATCT+ACT-3’
R：5’-AACCG+TTCA+ATCAT+AAGTG+TA-3’
2.2 2019-nCoV-N 锁核酸修饰引物（详见前文表2）
F：5’-GCCTTG+AATAC+ACCAA+AAGA+T-3’
R：5’-C+TGCCGCC+TCTGC+TCCCT+T-3’
三、化学基团标记PCR引物
所述的引物化学基团标记方法为：各上游引物采用Biotin基团标记，各下游引物采用FITC基团标记。
3.1 2019-nCoV-ORF1ab化学基团标记引物（详见前文表2）
F：5’-Biotin-AATGTTAATGCACTTTTATCTACT -3’ 24bp
R：5’-FITC-AACCGTTCAATCATAAGTGTA -3’ 21bp
3.2 2019-nCoV-N化学基团标记引物（详见前文表2）
F：5’-Biotin-GCCTTGAATACACCAAAAGAT -3’ 21bp
R：5’-FITC-CTGCCGCCTCTGCTCCCTT -3’ 19bp
四、胶体金试纸条制作
该制作方法可以参考现有相关文献。
五、核酸制备
5.1无菌条件下将样本液体混合均匀后，取300μL样品于1.5mL洁净离心管中，加入500μL裂解液和10μL蛋白酶K，56℃水浴30min。
5.2磁珠使用前须于37℃温育10min，用手轻轻摇匀使之呈现悬浮状态。
5.3经水浴裂解完毕的样品中，加入15μL已加热混匀的磁珠，再加入250μL的结合液，涡旋混匀。
5.4将离心管于混合仪旋转混合10min（转速0.83 ~ 0.85转/s）。
5.5混合完毕，于磁力架固定吸附，肉眼观察，磁珠完全被吸附至磁铁一侧即可（约需要10 ~ 15s），用移液器吸去离心管内清液，加入500μL漂洗液漂洗磁珠，每次注入漂洗液后轻轻摇匀5s，再次固定于磁力架，10s后再次完全吸去清液，重复漂洗三次。
5.6将离心管从磁力架上取下，开盖放置5min使乙醇完全挥发。
5.7加入100μL洗脱液，超声分散附着在离心管壁的磁珠（超声时间大约45s，时间不宜过长以免RNA断裂），期间不断取出摇匀肉眼观察分散情况。
5.8水浴65℃，10min，然后置于磁力架上分离磁珠，用移液器吸取清液至新的洁净1.5mL离心管中，即得到RNA溶液。
也可按照市面上商品化核酸制备试剂盒进行核酸提取。
六、PCR实验
6.1 PCR反应体系
Figure 570278DEST_PATH_IMAGE004
6.2 PCR反应条件
90℃预变性30秒；60℃反转录5分钟；95℃预变性1分钟；95℃变性10秒，64℃退火20秒，40个循环；4℃保存。
七、判读标准
7.1试纸条上样
取6μL PCR产物，加入54μL上样稀释液，混匀后垂直缓慢滴加于试条样品孔中，3-5分钟之间观察结果。
7.2结果判定
试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为阳性。试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性，详见图3。
7.3表述
阳性：2019-nCoV-ORF1ab试纸条质控线（C线）变红色，且检测线（T线）变红色，则检测结果为检出2019新型冠状病毒ORF1ab基因；2019-nCoV-N试纸条质控线（C线）变红色，且检测线（T线）变红色，则检测结果为检出2019新型冠状病毒N基因。只有当2019-nCoV-ORF1ab基因和2019-nCoV-N基因都被同时检出，才能判定为2019新型冠状病毒阳性。
阴性：2019-nCoV-ORF1ab和2019-nCoV-N试纸条质控线（C线）变红色，且检测线（T线）不变色，检测结果为阴性，判定为未检出2019新型冠状病毒ORF1ab基因和2019新型冠状病毒N基因。
疑似：2019新型冠状病毒ORF1ab基因阳性，且2019新型冠状病毒N基因阴性，或者2019新型冠状病毒ORF1ab基因阴性，且2019新型冠状病毒N基因阳性，都只能判定为疑似样本，需要复检。
7.4质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
A)空白对照：质控线变红，检测线未变红。
B)阴性对照：质控线变红，检测线未变红。
C)阳性对照：质控线变红，检测线变红。
对比例1 引物中锁核酸修饰碱基数量对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中锁核酸修饰碱基的数量对引物二聚体的影响，以2019-nCoV-ORF1ab引物为例，对2019-nCoV-ORF1ab引物进行了不同碱基数量的锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。
PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4A-图4J，具体的，图4A和图4B为2019-nCoV-ORF1ab零个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图（退火温度为50℃），图4C和图4D为2019-nCoV-ORF1ab一个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图（退火温度为54℃），图4E和图4F为2019-nCoV-ORF1ab两个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图（退火温度为54℃），图4G和图4H为2019-nCoV-ORF1ab三个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图（退火温度为64℃），图4I和图4J示出了2019-nCoV-ORF1ab四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图（退火温度为64℃），其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；+：103copy/μl阳性质粒核酸；++：104copy/μl阳性质粒核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别有零、一、二、三个碱基经过锁核酸修饰时，不能有效消减引物二聚体的产生，且会导致胶体金试条检测假阳性的产生。而当上下游引物分别有四个碱基经过锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
对比例2 引物中锁核酸修饰碱基的间距对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中锁核酸修饰碱基的间距对引物二聚体的影响，以2019-nCoV-ORF1ab引物为例，对2019-nCoV-ORF1ab引物进行四个3-6个碱基间距的碱基锁核酸修饰和连续四个碱基锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4I和图4J、图5A和图5B，图5A和图5B为2019-nCoV-ORF1ab引物中连续四个碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图（退火温度为64℃），其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；+：103copy/μl阳性质粒核酸；++：104copy/μl阳性质粒核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别有连续四个碱基被锁核酸修饰时，不仅不能有效消减引物二聚体的产生，还会导致胶体金试条检测假阳性的产生，而且引物的灵敏度与有四个3-6个碱基间距的碱基经过锁核酸修饰的引物相比，下降了一个数量级。而当上下游引物分别有四个3-6个碱基间距的碱基经过锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
另外，本案发明人还尝试了锁核酸修饰碱基的间距1个或者2个碱基，其结果与连续四个碱基锁核酸修饰的结果一样，存在空间位阻，灵敏度下降了一个数量级。
对比例3 引物中修饰的碱基种类为A和T或者G和C对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中修饰的碱基种类为A和T或者G和C对引物二聚体的影响，以2019-nCoV-ORF1ab引物为例，对2019-nCoV-ORF1ab引物进行只有A和T碱基锁核酸修饰或者只有G和C碱基锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4I和图4J、图6A和图6B，图6A和图6B为2019-nCoV-ORF1ab引物中只有G和C碱基锁核酸修饰对引物二聚体的影响图（退火温度为64℃），其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；+：103copy/μl阳性质粒核酸；++：104copy/μl阳性质粒核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别只有G和C碱基被锁核酸修饰时，不仅不能有效消减引物二聚体的产生，导致胶体金试条检测假阳性的产生，而且引物的灵敏度与只有A和T碱基锁核酸修饰引物相比，下降了一个数量级。当上下游引物分别只有A和T碱基经过锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
对比例4 引物中是否修饰引物的3'末端碱基对引物二聚体的影响
本案发明人为了探究引物中是否修饰引物的3'末端碱基对引物二聚体的影响，以2019-nCoV-ORF1ab引物为例，对2019-nCoV-ORF1ab引物进行3'末端碱基锁核酸修饰和非3'末端碱基锁核酸修饰，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测和PCR-试纸条检测结果见图4I和图4J、图7A和图7B，图7A和图7B是2019-nCoV-ORF1ab引物中修饰引物的非3'末端碱基对引物二聚体的影响图（退火温度为64℃），其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；+：103copy/μl阳性质粒核酸；++：104copy/μl阳性质粒核酸。
以上结果表明，当上下游引物分别进行非3'末端碱基锁核酸修饰时，不仅不能有效消减引物二聚体的产生，还会导致胶体金试条检测假阳性的产生，而且引物的灵敏度与进行3'末端碱基锁核酸修饰引物相比，下降了一个数量级。而当上下游引物分别进行3'末端碱基锁核酸修饰时，引物的Tm值和PCR扩增的退火温度都大幅度提高，引物二聚体的数量有效地降低，避免了胶体金试条检测的假阳性。
另外，本案发明人还参照2019-nCoV-ORF1ab引物的对照试验，设计了2019-nCoV-N引物的对照试验，并获得了类似的结论，即：2019-nCoV-N-F、2019-nCoV-N-R序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，每相邻两个经锁核酸修饰的碱基之间的间距为3-6个碱基，经锁核酸修饰的碱基的种类为A和T，且锁核酸修饰于3'末端碱基。因此，只有前述特定的四个碱基被锁核酸修饰了才能达成最优的效果。
测试例1 2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N PCR四个碱基经锁核酸修饰引物的灵敏度实验
为了验证2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N四个碱基锁核酸修饰这两对引物对的灵敏度，本案发明人将2019-nCoV的质粒DNA进行梯度浓度稀释，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。其中，2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图可以参见图8A，2019-nCoV-ORF1ab引物中零个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图可以参见图8B，2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图可以参见图10A，2019-nCoV-N引物中零个碱基锁核酸修饰引物灵敏度实验PCR产物电泳示意图可以参见图10B。其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；+：103copy/μl阳性质粒核酸；++：104copy/μl阳性质粒核酸。以上结果表明，2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N四个碱基锁核酸修饰这两对引物对的灵敏度都能达到103copy/μl，但是2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N零个碱基锁核酸修饰这两对引物的灵敏度只能达到104copy/μl，较四个碱基锁核酸修饰的引物降低了一个数量级。
2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测灵敏度实验结果图可以参见图9，2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测灵敏度实验结果图可以参见图11。其中，阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；+：103copy/μl阳性质粒核酸；++：104copy/μl阳性质粒核酸。以上结果表明，当质粒DNA浓度为103copy/μl时，2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N四个碱基锁核酸修饰引物试纸条质控线和检测线依然能显示红色条带，电泳检测结果与试纸条检测结果保持一致。综上所述，本实施例的2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N四个碱基锁核酸修饰两对引物对，电泳检测和试条检测的灵敏度都可达到103copy/μl，且比2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N零个碱基锁核酸修饰两对引物对的灵敏度高一个数量级。
测试例2 2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N PCR产物试纸条检测特异性实验
为了验证2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N四个碱基锁核酸修饰两对引物的特异性，本案发明人用2019-nCoV的质粒DNA作为阳性质控，人的核酸作为宿主，DEPC水作为阴性对照，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图可以参见图12A，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；宿主：人的核酸；103copy：103copy/μl阳性质粒核酸；104copy：104copy/μl阳性质粒核酸。2019-nCoV-ORF1ab引物中零个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图可以参见图12B，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；阳：阳性质粒核酸。2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图可以参见图14A，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；宿主：人的核酸；103copy：103copy/μl阳性质粒核酸；104copy：104copy/μl阳性质粒核酸。2019-nCoV-N引物中零个碱基锁核酸修饰引物特异性实验PCR产物电泳示意图可以参见图14B，其中，M：分子量参照物；阴：无核酸酶的水；人：人的核酸；阳：阳性质粒核酸。以上结果表明，2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N四个碱基锁核酸修饰两对引物对除了阳性质控泳道有目的条带，其他泳道均没有任何条带，2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N零个碱基锁核酸修饰引物对与宿主人的核酸产生杂交，出现很多非特异性扩增片段。
2019-nCoV-ORF1ab引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测特异性实验结果图可以参见图13，2019-nCoV-N引物中四个碱基锁核酸修饰PCR产物试纸条检测特异性实验结果图可以参见图15，其中，阴：无核酸酶的水；宿主：人的核酸；103copy：103copy/μl阳性质粒核酸；104copy：104copy/μl阳性质粒核酸。以上结果表明，除了阳性对照试纸条质控线和检测线依然能显示红色条带，其他均只有质控线能显示红色条带，与电泳结果保持一致。综上所述，本实施例的2019-nCoV-ORF1ab、2019-nCoV-N四个碱基锁核酸修饰两对引物对的特异性好，能有效地扩增出目的片段，且没有非特异性扩增片段产生。
实施例2 2019-nCoV PCR扩增结合核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒
将用于对2019新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸进行PCR检测的锁核酸修饰引物2019-nCoV-ORF1ab-F（10μM）40μL，2019-nCoV-ORF1ab-R（10μM）40μL，2019-nCoV-N-F（10μM）40μL，2019-nCoV-N-R（10μM）40μL以及预混液 250μL、2mM 脱氧核糖核苷酸 250μL、Mn2+ 60μL、扩增酶 15μL、2019-nCoV质粒DNA（30ng/μL）20μL、超纯水1.5mL、上样样品稀释液5mL、成品试纸条48条共同包装，得到2019新型冠状病毒（2019-nCoV）PCR产物核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒。
综上所述，本发明提供的试剂盒及检测方法具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，可用于2019新型冠状病毒肺炎的快速检测，应用前景广阔。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/ 或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 苏州蝌蚪生物技术有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒的扩增引物组合物及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
aatgttaatg cacttttatc tact 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
aaccgttcaa tcataagtgt a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gccttgaata caccaaaaga t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ctgccgcctc tgctccctt 19

Claims (6)

1.一种用于检测SARS-CoV-2的扩增引物组合物，其特征在于，包括：
第一引物组，所述第一引物组适于特异性扩增ORF1ab基因靶标区域；
第二引物组，所述第二引物组适于特异性扩增N基因靶标区域；
其中，所述第一引物组包括：
第一正向引物，所述第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
第一反向引物，所述第一反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述第二引物组包括：
第二正向引物，所述第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
第二反向引物，所述第二反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
并且，所述第一正向引物、第一反向引物、第二正向引物、第二反向引物的每个序列中均有四个碱基是经过锁核酸修饰的，该四个碱基中的一个碱基是相应序列的3'末端碱基，在所述第一正向引物中从5’末端到3'末端方向，锁核酸的修饰位点分别为第6位的胸腺嘧啶、第12位的腺嘌呤、第18位的腺嘌呤、第24位的胸腺嘧啶，在所述第一反向引物中从5’末端到3'末端方向，锁核酸的修饰位点分别为第6位的胸腺嘧啶、第11位的胸腺嘧啶、第16位的腺嘌呤、第21位的腺嘌呤，在所述第二正向引物中从5’末端到3'末端方向，锁核酸的修饰位点分别为第7位的腺嘌呤、第12位的腺嘌呤、第17位的腺嘌呤、第21位的胸腺嘧啶，在所述第二反向引物中从5’末端到3'末端方向，锁核酸的修饰位点分别为第2位的胸腺嘧啶、第9位的胸腺嘧啶、第14位的胸腺嘧啶、第19位的胸腺嘧啶。
2.根据权利要求1所述的用于检测SARS-CoV-2的扩增引物组合物，其特征在于：所述第一正向引物、第一反向引物、第二正向引物、第二反向引物的5’末端均标记有化学基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测SARS-CoV-2的扩增引物组合物，其特征在于：所述第一正向引物、第二正向引物的5’末端所标记的化学基团与所述第一反向引物、第二反向引物的5’末端所标记的化学基团不同。
4.根据权利要求3所述的用于检测SARS-CoV-2的扩增引物组合物，其特征在于：所述第一正向引物、第二正向引物的5’末端均标记有Biotin基团。
5.根据权利要求3所述的用于检测SARS-CoV-2的扩增引物组合物，其特征在于：所述第一反向引物、第二反向引物的5’末端均标记有FITC基团。
6.一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1-5中任一项所述的用于检测SARS-CoV-2的扩增引物组合物。
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