CN105256047A - 检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

一种检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法，该方法以烟草黑胫病菌中的5.8S？ribosomal？RNA及其相邻的ITS？区域片段设计引物；正向引物为：5’-TGAACGCATATTGCACTTCC-3’；反向引物：？？5’-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3’；LNA修饰位点以下划线表示。通过普通引物PCR扩增、克隆获得阳性重组质粒，然后以已知浓度的含有目的基因的质粒作为模板同时以LNA修饰的引物进行荧光定量PCR反应，作出标准曲线图以及标准曲线，通过样品检测结果与标准曲线对比，确定待测样品中的黑胫病菌的数量。该检测方法适用于烟草种植土壤中黑胫病菌定殖的检测，高效、简单易行、价格低廉，检测只需在4~5小时内即可完成，具有较高的检测灵敏度，能为我国黑胫病的防控起到一定的作用。

Description

检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法，适用于各种植烟土壤中的烟草黑胫病菌孢子数量的定量检测。
背景技术
烟草黑胫病是一种毁灭性土传真菌病害。有报导表明在我国烟草黑胫病平均发病率为10％～20％，发病率高的田块高达75％（刘晓霞等，2004），较为严重的甚至造成绝收（陈瑞泰等，1997；苏德成，1992）。我国每年烟草因黑胫病引起的损失超过2亿元（赵振山，2005），烟草黑胫病（Tobaccoblackshank）是疫霉菌烟草变种引起的一种土传病害，其中受土壤环境和栽培措施影响较大，在河南、山东和安徽、云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等烟区发生。
以前较为传统的植物病害诊断方法常根据病组织的症状和病原菌的特征进行，但是效率较低且耗时较多。近年来血清学和核酸技术的应用，为植物病原的快速检测提供了不少新技术。有人采用RFLPs技术对F.axysporumf.sp.pisi的3个生理小种进行研究，差异明显（Coddington，1992)。Kistler(1989)等人对mtDNAs的差异进行分析，能够区别出尖镰孢Fusariumoxysporum的不同转化型；谢勇等根据从GeneBank数据库获得的引起黑胫病的疫霉属真菌rDNAITS区段序列，合成了1对17bpDNA特异引物进行了不同病原菌、病组织及土壤中寄生疫霉菌(Parasiticavar.nicotianae)的特异扩增试验，创制了一套快速检测的PCR方法。目前的检测方法灵敏度较低，研制敏感性更高的烟草黑胫病菌检测方法是当务之急。
锁核酸(Lockednucleicacid,LNA)是一种近年来开始被人们关注的新型的寡核酸衍生物,在药学研究方面引起了人们的广泛关注，有望成为分子治疗一些疾病如癌症的突破口。其结构中B-D-呋喃核糖的2-O,4-C位通过缩水作用构成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型,形成了刚性的缩合结构。L环形桥锁定了呋喃糖的N构型,降低核糖结构的柔韧性,增加磷酸盐骨架的稳定性。在寡核苷酸中加入锁（LNA）修饰碱基可显著增强寡核苷酸与DNA的结合能力；含有LNA修饰的碱基的引物已经广泛应用于荧光PCR反应体系。但目前尚未发现此类技术应用于烟草黑胫病菌在植烟土壤中的检测方面。
发明内容
本发明的目的正是基上述现有状况提供了一种LNA增敏的植烟土壤黑胫病菌孢子数量的荧光定量PCR检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测烟草黑胫病菌在植烟土壤中定殖数量的方法，包括如下步骤，
（1）以黑胫病菌数量对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读出的Ct值为Y轴，绘制数量对数与Ct值的标准曲线：
采用LNA增敏的定量PCR方法将烟草黑胫病菌特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp时，即得到烟草黑胫病菌特异区DNA；
将黑胫病菌特异区DNA插入到感受态大肠杆菌载体pMD18-T载体后，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，氨苄青霉素在LB培养基中的质量浓度为100ng/mL；培养24h后采用质粒试剂盒（TAKARA公司）制备烟草黑胫病菌特异区DNA质粒（制备过程按照该公司提供的说明书）；
将步制备好的质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度，然后用灭菌后的超纯水稀释，得到母液逐级稀释液；
将步得到的逐级稀释液，采用荧光定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出251bp产物时，记录该Ct值，以每级稀释液拷贝数对数值为X轴，CT值为Y轴，即绘制出拷贝数与Ct值得标准曲线；
（2）从烟区进行感染黑胫病烟株附近土壤的取样后，提取DNA；
（3）采用LNA增敏的荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp的产物时，记录此时待测DNA的Ct值，将该Ct值带入到步骤（1）绘制出的标准曲线当中，得到PCR反应体系中黑胫病菌拷贝数，根据如下公式计算出黑胫病菌在土壤中的定殖数量；
Copies=CPCR×(VDNA/VPCR)×(1/WEXT)
Cpcr为PCR反应得到的黑胫病菌数量，VDNA为植烟土壤提取DNA得到的最终溶解量，VPCR为定量PCR的加样量，WEXT为提取DNA所使用的植烟土壤重量。
所述步骤（1）和步骤（3）中荧光定量PCR扩增方法中所用的试剂包括12.5μl的2×荧光定量PCR反应混合液（购买于罗氏公司），浓度均为10umol/L的正向引物、反向引物各1μl,1ul的黑胫病菌特异区DNA质粒溶液或待测黑胫病菌DNA溶液，超纯水补至25μl。
所述的LNA修饰的正向引物和反向引物的序列如下：正向引物为：5’-TGAACGCATATTGCACTTCC-3’；反向引物：5’-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3’；LNA修饰位点以下划线表示。
所述的步骤（1）和步骤（3）的反应条件为95℃热启动8分钟预变性后；进入扩增循环：95℃30秒，60℃10秒，72℃20秒循环45次。
本发明的重要效果是，通过对烟草黑胫病菌特异区域DNA进行引物设计，能够准确地单一检测出黑胫病菌的定殖量，而且采用的LNA增敏的荧光定量PCR扩增方法，黑胫病菌在每个拷贝数量级上都有相应的Ct值，该PCR检测方法高效省时，操作方便快捷。
本发明以5.8SribosomalRNA及其相邻的ITS区域片段为目标检测序列，采用LNA技术合成覆盖目标片段的引物序列，结合定量核酸扩增技术，建立了一种锁核苷酸（LNA）增敏的烟草黑胫病菌实时荧光定量PCR检测方法。
本发明的锁核苷酸（LNA）增敏的烟草黑胫病菌实时荧光定量PCR检测方法适用于各种植烟土壤中的黑胫病菌定殖量的定量检测，且具有以下优势：
灵敏度较高：以配置好的标准品为例，检测阈值可以达到10个拷贝/μl。
检测时间短，从植烟土壤DNA的提取到结果获得，可在4~5小时之内完成。
本发明的方法对模板DNA的要求较低，无论是沙质土，壤土、红土等都能取得较好的检测结果。
定量PCR检测的样本量较大，在4~5小时内最多可以检测384例。
本发明建立的锁核苷酸（LNA）增敏的烟草黑胫病菌实时荧光定量PCR检测方法，具有较高的检测灵敏度，对于土壤中极微量的黑胫病菌定殖量的检测能够起到极大的促进作用。
附图说明
图1、PCR反应中不同温度梯度对LNAPCR扩增的影响；
图1中：M为DL500marker，泳道1~7分别为55℃、55.8℃、57.4℃、59.7℃、62.6℃、65℃、66.3℃的退火温度下菌丝DNA扩增产物的电泳结果，泳道8为阴性对照。
图2、普通DNA引物和LNA引物在不同退火温度下的PCR扩增产物的电泳图像；
图2中：M为DL500marker，1为LNA引物的阴性对照，2为普通DNA引物的阴性对照，L1~L7和D1~D7分别为LNA引物和DNA引物在55℃、55.8℃、57.4℃、59.7℃、62.6℃、65℃、66.3℃退火温度下的PCR扩增结果。
图3、含有5.8SribosomalRNA及其相邻的ITS区域片段质粒的10倍稀释液的扩增曲线；
图3中：曲线1~5表示黑胫病菌质粒浓度分别为1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×102个/μl。
图4、根据含有5.8SribosomalRNA及其相邻的ITS区域片段质粒的10倍稀释液定量PCR扩增结果构建的标准曲线图。
图5、植烟土壤DNA定量PCR扩增的扩增曲线图。
图6、植烟土壤DNA定量PCR扩增的溶解曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明内容做进一步的说明。
实施例1、土壤取样与土壤DNA的提取
选取黑胫病发病较重的田块，在感染黑胫病烟株靠近根茎结合部附近取样2~3克土壤，将其装入50ml离心管以备DNA提取使用。
实验中对植烟土壤DNA的提取采用美国MOBIO公司的POWERSOILDNAisolationkit(专门用于提取DNA的试剂盒)，提取方法如下：将0.25g土壤加入到PowerBead管中，涡旋混匀；后加入60μlC1溶液，颠倒数次混匀；将PowerBead管固定于涡旋仪上，涡旋振荡10分钟；室温10000g离心30秒后转移上清至干净的2ml收集管中，加入250μlC2溶液到上清中，涡旋混匀5秒，室温10000g离心1分钟；转移大约600μl的上清到新的收集管中，加200μl溶液C3到上清中涡旋混匀；4℃放置5分钟；室温10000g离心1分钟，转移约750μl上清到新的收集管中；加1200μlC4溶液到上清中，涡旋混匀5秒；取约675μl上清到SpinFilter中，室温10000g离心1分钟，弃滤液；然后将500μl溶液C5加入SpinFilter中，室温10000g离心30秒，弃去滤液。将SpinFilter转移到2ml收集管中；加入100μlC6溶液到SpinFilter的白色滤膜中心，室温10000g离心30秒，流出液即为含有土壤DNA的溶液，保存至-20℃冰箱备用。其中的C1-C6均为试剂盒中所含试剂。
实施例2、建立LNA定量PCR反应体系并进行土壤中黑胫病菌数量检测
将黑胫病菌与其它疫霉菌不同种采用CLASTAL方法对基因序列进行比较，获取烟草黑胫病菌的特异性基因组序列区域，从Genebank数据库中选择提交所有的黑胫病菌的5.8SribosomalRNA及其相邻的ITS区域的序列，对其设计荧光定量PCR引物，通过NCBIBlast程序比较所设计的引物序列与其它生物种是否有显著同源性；同时每条引物选择两个位点进行锁核苷酸标记。
（1）以黑胫病菌数量对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读出的Ct值为Y轴，绘制数量对数与Ct值的标准曲线：
采用LNA增敏的定量PCR扩增方法将黑胫病菌特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp时，即得到黑胫病菌特异区DNA；
将黑胫病菌特异区DNA插入到感受态大肠杆菌载体pMD18-T载体后，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，氨苄青霉素在LB培养基中的质量浓度为100ng/mL；培养24h后采用质粒试剂盒（TAKARA公司）制备烟草黑胫病菌特异区DNA质粒。
将步制备好的质粒经紫外分光光度计定量，测得质粒母液浓度，然后用灭菌后的超纯水稀释，得到母液逐级稀释液，即不同浓度标准品，浓度分别为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102等拷贝/μl；
将步得到的逐级稀释液，采用荧光定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出251bp产物时，记录该Ct值，以每级稀释液拷贝数对数值为X轴，Ct值为Y轴，即绘制出拷贝数与Ct值的标准曲线（见图3）。
（2）按实施例1中所述对从烟区采集的植烟土壤提取DNA,将0.25克土壤提取的DNA溶解于试剂盒提供的100ul溶液C6中。
（3）取1ul土壤样品DNA，采用LNA增敏的荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp的产物时，记录此时待测DNA的Ct值，植烟土壤DNA的扩增曲线和溶解曲线见图4,将各个模板的Ct值与标准曲线对照，得到1μL模板中烟草黑胫病菌的个数，1g土样中烟草黑胫病菌数量（个）=1μl模板黑胫病菌数量×100μl×4，经计算（表1）得出：在本实验采集的河南省植烟土样中，1g土壤中的烟草黑胫病菌的定殖数量大约为2.76×103~5.20×104个。
表11g植烟土样中烟草黑胫病菌的定殖数量
（4）一种锁核苷酸增敏的检测黑胫病菌在植烟土壤中定殖数量的荧光定量PCR方法，步骤（1）和步骤（3）中荧光定量PCR扩增方法中所用的试剂包括12.5μl的2×荧光定量PCR反应混合液，浓度均为10umol/L的正向引物、反向引物各1μl,1ul的黑胫病菌特异区DNA质粒溶液或待测黑胫病菌DNA溶液，超纯水补至25μl。
（5）所述的LNA修饰的正向引物和反向引物的序列如下：
正向引物为：5’-TGAACGCATATTGCACTTCC-3’；反向引物：5’-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3’；LNA修饰位点以下划线表示。
（6）所述的步骤（1）和步骤（3）的PCR反应条件为95℃热启动8分钟预变性后；进入扩增循环：95℃30秒，60℃10秒，72℃20秒循环55次。
最后还需要说明的是，上面列举的仅是本发明的具体实施例。本发明保护的是一种LNA增敏的植烟土壤中烟草黑胫病数量检测的定量PCR方法。本发明不限于上面实施例，还有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，
（1）以黑胫病菌数量对数值为X轴，定量PCR扩增仪上测读出的Ct值为Y轴，绘制数量对数与Ct值的标准曲线：
采用LNA增敏的定量PCR法将烟草黑胫病菌特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp时，即得到烟草黑胫病菌特异区DNA；
将黑胫病菌特异区DNA插入到载体pMD18-T载体后，然后转化大肠杆菌，接种有氨苄青霉素的LB平板上，氨苄青霉素在LB平板中的质量浓度为100ng/mL；培养24h后采用质粒试剂盒制备黑胫病菌特异区DNA质粒；
将步制备好的质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度，后用灭菌后的超纯水稀释，得到母液逐级稀释液；
将步得到的逐级稀释液，采用定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出251bp产物时，记录该Ct值，以每级稀释液拷贝数对数值为X轴，Ct值为Y轴，即绘制出拷贝数与Ct值的标准曲线；
（2）从对植烟土壤进行相关取样后进行DNA的提取工作；
（3）采用LNA增敏的定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为251bp的产物时，记录待测DNA的Ct值，将该Ct值带入到步骤（1）得出的标准曲线当中，获得PCR反应中黑胫病菌的拷贝数，根据如下公式计算出黑胫病菌在土壤中的定殖数量；
Copies=CPCR×(VDNA/VPCR)×(1/WEXT)
Cpcr为PCR反应得到的黑胫病菌数量，VDNA为植烟土壤提取DNA得到的最终溶解量，VPCR为定量PCR的加样量，WEXT为提取DNA所使用的植烟土壤重量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（3）中荧光定量PCR扩增中所用的试剂包括12.5μl的2×荧光定量PCR反应混合液，浓度均为10umol/L的正向引物、反向引物各1μl,1ul的黑胫病菌特异区DNA质粒溶液或待测黑胫病菌DNA溶液，超纯水补至25μl。
3.根据权利要求２所述的检测方法，其特征在于，所述的LNA修饰的正向引物和反向引物的序列如下：正向引物为：5’-TGAACGCATATTGCACTTCC-3’；反向引物：5’-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3’；LNA修饰位点以下划线表示。
4.根据权利１所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（1）和步骤（3）的反应条件为95℃热启动8分钟预变性后；进入扩增循环：95℃30秒，60℃10秒，72℃20秒循环45次。
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