CN117802267A - 一种烟草疫霉菌的定量检测方法及其增殖预测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了烟草疫霉菌的定量检测方法及其增殖预测系统，所述方法包括：采用所述的ITS上引物、ITS下引物和荧光探针配置反应体系进行微滴式数字PCR扩增，获得烟草疫霉菌DNA样本的ITS片段拷贝数浓度x，乘以提取的DNA样本体积得到该样本的总拷贝数（copies），除以相应样本称量质量g，即得到单位质量下的烟草疫霉菌含量，即copies/g。并基于实际侵染样本的定量结果建立了科学预测烟草疫霉菌增殖规律的数学模型，为该真菌的准确鉴定、定量，以及对烟草黑胫病的有效防控提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，特别涉及烟草疫霉菌的定量检测方法及其增殖预测系统。
背景技术
烟草（Nicotiana tabacum L.）属于双子叶茄科烟草属植物，是我国经济作物中重要的组成部分。近年来，受有限的耕地及生产栽培条件的制约，我国烟草产业不断向规模化和集约化方向发展，导致土传病害在烤烟主产区危害呈加重趋势，对我国烟草的产量与品质造成了严重损害。烟草黑胫病是由寄生疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染引起的烟草生产上最具毁灭性的土传病害之一，该病主要危害烟草的根和茎基部，其典型症状为叶片萎蔫，植株矮化，根茎部坏死，其分布范围广，发病率高。因此，对烟草黑胫病害的早期诊断，成为病害防治的重中之重。
从感染烟草的形态学观察到真菌得分分离鉴定，再到分子水平的定性和定量检测，新技术的发展不断推动了烟草疫霉菌的诊断水平。其中实时荧光定量PCR（qPCR）因特异性好，灵敏度较高，已经目前最有效的检测技术。该技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或探针，通过荧光信号的变化实时监测整个扩增过程,最后基于样本的Ct（thresholdcycle）值确定样本中目标核酸片段的相对含量。如果进行绝对定量，需要通过已知绝对浓度的标准品制备标准曲线获得实际未知样品的核酸含量。通过qPCR技术进行实际样本的绝对定量时存在以下问题：（1）DNA提取时可能在样品中引入杂质，可能包含PCR反应的抑制物，造成实际扩增效率偏低。因此以标准品为模板制备的标准曲线来定量检测样本浓度时往往低于实际值；（2）当样本目标核酸片段含量很低时，其含有的PCR抑制物容易造成qPCR反应的“假阴性”。上述原因造成基于qPCR技术难以实现对核酸样本的精确定量和高效鉴定。
同时研究表明，疫霉菌侵染烟草后的增殖速度与田间的天气条件（温度和湿度）密切相关。在烟草生长的周期（5月-9月），随着温度湿度等条件的变化，烟草黑胫病的发病程度不断改变。如果不同年份相同时期天气条件变化不大，则该地区的烟草黑胫病发病程度呈相似的规律；而不同地区因天气条件的差异，则发病程度显著不同。目前缺乏准确定量烟草疫霉菌的方法，且无法对侵染烟草后疫霉菌的增殖情况和发病规律进行有效的监控。
因此，有必要提供一种能定量检测烟草疫霉菌的方法以及对侵染烟草后疫霉菌的增殖情况和发病规律进行有效的监控的系统，为烟草黑胫病的科学防控提供技术支撑。
发明内容
本发明目的是提供烟草疫霉菌的定量检测方法及其增殖预测系统，具有良好的特异性，可实现烟草疫霉菌的精确定量，并基于该方法定量检测获得的实际烟草侵染样本的烟草疫霉菌含量，结合烟草生长田间的环境因素即温度和湿度条件，建立科学预测烟草生长周期中疫霉菌增殖的数学模型，从而实现对侵染烟草后疫霉菌的增殖情况和发病规律进行有效的预测和监控。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种烟草疫霉菌的定量检测试剂盒，所述定量检测试剂盒包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ITS 上引物，
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ITS 下引物，
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。
进一步地，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
进一步地，所述ITS 上引物和所述ITS 下引物的浓度均为500 ±10 nmol/L，所述荧光探针的浓度为250 ±10 nmol/L。
在本发明的第二方面，提供了一种烟草疫霉菌的定量检测方法，所述方法包括：
采用所述的ITS 上引物、ITS 下引物和荧光探针，并加入ddPCR Supermix和烟草疫霉菌DNA样本以配置反应体系进行微滴式数字PCR扩增，
获得烟草疫霉菌DNA样本的ITS片段拷贝数浓度(copies/μL)；
将所述ITS片段拷贝数浓度乘以提取的DNA样本的总体积(μL)得到该样本的总拷贝数（copies），再除以相应样本称量质量g，即得到单位质量下的烟草疫霉菌含量。
进一步地，所述微滴式数字PCR扩增中的退火温度为56℃~60℃。
进一步地，所述ITS 上引物和所述ITS 下引物的浓度均为500 ±10 nmol/L，所述荧光探针的浓度为250 ±10 nmol/L。
在本发明的第三方面，提供了一种疫霉菌增殖的预测模型的建立方法，所述方法包括：
采用所述的方法对田间烟草整个生长周期中采集及提取的样本的烟草疫霉菌含量进行定量检测，获得每个样本的单位质量下的烟草疫霉菌含量；
将每个样本对应采样当天的气象数据，包括当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量分别设为x1、x2、x3、x4、x5。将单位质量实际侵染样本的烟草疫霉菌含量（copies/g）作为y，将各样本对应的x1、x2、x3、x4、x5作为变量，通过1stopt软件采用通用全局优化算法进行拟合运算，拟合的模型公式为y = a×x1 n1+b×x2 n2+c×x3 n3+d×x4 n4+e×x5 n5，
将100个根部采样数据和100个茎部采样数据分别代入该公式后，计算出根部和茎部两组数学模型的各参数值，从而建立预测烟草生长周期中疫霉菌增殖的数学模型。
在本发明的第四方面，提供了一种烟草生长周期中根部的疫霉菌增殖的预测系统，包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
输入当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量、x1、x2、x3、x4、x5，并代入如下计算公式中，获得单位质量下的烟草疫霉菌含量y值；
y =360.4813×x1 2.189+(-0.068)×x2 5.162+34.968×x3 3.091+(-0.004)×x4 4.582+56.400×x5 2.822。
在本发明的第五方面，提供了一种烟草生长周期中茎部的疫霉菌增殖的预测系统，所述烟草生长周期中茎部的疫霉菌增殖的预测系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
输入当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量、x1、x2、x3、x4、x5，并代入如下计算公式中，获得单位质量下的烟草疫霉菌含量y值；
y=(-0.111)×x1 5.274+0.300×x2 5.870+(-59864.674)×x3 1.186+(-20.852)×x4 3.676+(-177159.155)×x5 0.040。
在本发明的第五方面，提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时使用所述方法的步骤。
在本发明的第六方面，提供了一种计算机程序产品，包括计算机程序/指令，其特征在于，所述计算机程序/指令被处理器执行时实现所述方法的步骤。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的烟草疫霉菌的定量检测方法，设计了特异识别烟草疫霉菌ITS片段的引物和探针，特异性强。该方法定量重复性好（各浓度梯度定量的RSD小）。最小定量限（LOQ）低，仅为12拷贝，低于qPCR的LOQ，因此对微量核酸样本也可准确定量。
具有良好的特异性，可实现烟草疫霉菌的精确定量：该数字PCR方法在12~1×105拷贝数量级范围的相对偏差（RSD）小于25%，即在此范围内定量检测重复性良好，最小定量限(LOQ)为12拷贝。
2、本发明的烟草生长周期中根部的疫霉菌增殖的预测系统以及烟草生长周期中茎部的疫霉菌增殖的预测系统为基于烟草疫霉菌的定量检测方法获得的实际烟草侵染样本的烟草疫霉菌含量，结合烟草生长田间的环境因素即温度和湿度条件，建立科学预测烟草生长周期中疫霉菌增殖的数学模型，能有效预测计算烟草在正常生长周期（5月-9月）内根部和茎部烟草疫霉菌侵染烟草增殖情况和含量的变化，从而为烟草黑胫病的防治提供参考；且对上述数学模型进行验证实测值和估算值结果高度一致，表明该预测系统准确率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为引物/探针的特异性验证结果。图中序号1-8依次表示：腐霉菌、炭疽病菌、白粉病菌、丝核菌、链格孢菌、烟草空茎病菌、烟草立枯病菌和茄假单胞杆菌。
图2为引物探针浓度的优化结果。
图3为退火温度的优化结果。
图4为数字PCR定量的线性关系的结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例及实验数据对本申请进行详细说明。本发明实施例中的 ITS的genbank登录号Gene ID:OR295119，nad 11的genbank登录号Gene ID: NC_035725.1（c28968-26959），rpl6的genbank登录号Gene ID: NC_035725.1:35662-36267，rps2的genbank登录号Gene ID: NC_035725.1:36278-36871，rps3的genbank登录号Gene ID: NC_035725.1:32329-33144。
实施例1、烟草疫霉菌的定量检测方法
1、设计特异的引物、探针序列
选择烟草疫霉菌的内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer， ITS）核酸片段，和其他4种不同片段nad 11、rpl6、rps2和rps3设计品种特异的引物和探针序列，所述引物和探针其核苷酸序列如表1所示：
表1. 引物和探针序列信息
2、特异性验证
选择烟草疫霉菌相近的其他8种病菌，分别提取DNA并作为模板，通过ddPCR体系对上述5种针对不同片段的引物/探针组合进行特异性验证。结果如图1所示，除了ITS对应的引物探针外，其他4个组合在其他8种相近病原菌中都出现了非特异的扩增，存在交叉反应。因此后续选择ITS 的引物探针组进行烟草疫霉菌的ddPC特异性定量检测。
3、优化数字PCR体系，包括引物和探针浓度的优化、退火温度的优化。
DNA提取：使用酵母基因组DNA提取试剂盒 （天根生化科技公司），按照试剂盒和仪器使用说明从培养的烟草疫霉菌中提取DNA。用100 μL TE缓冲液将其充分溶解，置于-80℃备用。
采用所述的引物和探针，配置反应体系，并进行数字PCR反应体系的优化。
引物和探针浓度的优化：引物浓度800 nmol/L、600 nmol/L、500 nmol/L、400nmol/L，探针浓度400 nmol/L、300 nmol/L、250 nmol/L、200 nmol/L。加入ddPCR Supermixfor Probes （美国伯乐公司）10 mL，用灭菌水补足至20 μl，进行微滴式数字PCR（ddPCR）扩增。扩增条件如下表2所示：
表2.数字PCR扩增条件
通过比较ddPCR的阴性阳性信号分离程度和中间弱阳性“雨滴”的数量来确定最佳引物和探针浓度。如图2所示，上述4个组合下阴阳性信号均能清晰分离，“雨滴”数量无显著差异，因此，最终选择引物和探针的浓度为500 nmol/L、250 nmol/L。
4、一种烟草疫霉菌的定量检测试剂盒
由上可知，所述定量检测试剂盒包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ITS 上引物，
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ITS 下引物，
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。
所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
所述ITS 上引物和所述ITS 下引物的浓度均为500 ±10 nmol/L，所述荧光探针的浓度为250 ±10 nmol/L。
优选地，所述试剂盒还包括ddPCR Supermix for Probes。
作为一种可选的实施方式，所述定量检测试剂盒还可包括酵母基因组DNA提取试剂盒。
5、烟草疫霉菌的定量检测试剂盒的使用方法（数字PCR方法）
（1）提取获得烟草疫霉菌DNA样本：使用酵母基因组DNA提取试剂盒 （天根生化科技公司），按照试剂盒和仪器使用说明从培养的烟草疫霉菌中提取DNA。用100 μL TE缓冲液将其充分溶解，置于-80℃备用。
（2）采用所述的ITS 上引物、ITS 下引物和荧光探针，并加入ddPCR Supermix和烟草疫霉菌DNA样本以配置反应体系进行微滴式数字PCR扩增，获得烟草疫霉菌DNA样本的ddPCR的ITS片段拷贝数；作为一种可选的实施方式，所述反应体系为20μl，在其他实施方式中，反应体系可以进行调整，如15 μl，25 μl，50 μl等。不同反应体系下ddPCR Supermixfor Probes的加入量为反应体系总体积的1/3~1/2均可，最后加入灭菌水补足至反应体系总体积。
（3）将所述烟草疫霉菌DNA样本的ITS片段的拷贝数浓度（copies/μl）,乘以提取的DNA样本体积(μl)得到该样本的总拷贝数（copies），再除以相应样本称量质量g，即得到单位质量下的烟草疫霉菌含量，即copies/g。
6、测定数字PCR定量检测的线性关系、最小定量限（LOQ）和重复性
根据前期ddPCR定量结果，将提取的烟草疫霉DNA系列稀释获得6个浓度梯度，浓度范围为6~105拷贝。每个梯度样本进行4次ddPCR反应，每次3个重复，统计分析各个浓度梯度下重复测量的RSD。结果如图3和表3所示。
表3. 定量重复性分析
由图3和表3可知，该数字PCR方法在12~1×105 拷贝数量级范围的相对偏差（RSD）小于25%，即在此范围内重复性良好，最小定量限(LOQ)为12拷贝。上述结果说明该数字PCR方法可对烟草疫霉菌DNA样本进行精确定量。
实施例2、建立烟草生长周期中疫霉菌增殖的预测模型
1、采样：5月初将健康的烟草幼苗移栽到已发生烟草疫霉菌的病土中，移栽一周后开始取样：感染烟株的茎部和根部，每间隔7天采样一次，每次1 g。并记录采样当天的气象数据，采样时间、当日气温、田间温度（℃）、田间湿度（湿度单位是rh）、降雨量。
2、DNA提取：对不同时间的根部和茎部的烟草样本，称取0.5 g，采用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
3、对实际侵染烟草样本疫霉菌含量的ddPCR定量
采用建立的ddPCR方法对上述提取样本的烟草疫霉菌含量进行定量检测，获得田间烟草整个生长周期（5月到9月）中采集的200个样本（100个根部和100个茎部样本）的定量数据。将测的每个样本的ITS片段的拷贝数浓度(copies/μL)乘以提取的DNA样本体积(μl)得到该样本的总拷贝数（copies），再除以相应样本称量质量（g），即得到单位质量下的烟草疫霉菌含量（copies/g），设为y。
4、构建根据田间天气预测烟草生长周期中疫霉菌增殖的数学模型
将每个样本对应采样当天的气象数据，包括当日最高气温（℃）、当日最低气温（℃）、田间温度（℃）、田间湿度（rh）和降雨量（毫米/平方米）分别设为x1、x2、x3、x4、x5。将单位质量实际侵染样本的烟草疫霉菌含量（copies/g）作为y，将各样本对应的x1、x2、x3、x4、x5作为变量，通过1stopt软件采用通用全局优化算法(UGO1)，进行拟合运算。
拟合的模型公式为y = y = a×x1 n1+b×x2 n2+c×x3 n3+d×x4 n4+e×x5 n5，将100个根部采样数据和100个茎部采样数据分别代入该公式后，计算出根部和茎部两组数学模型的各参数值，从而建立预测烟草生长周期中疫霉菌增殖的数学模型。其中构建数学模型的整体信息和拟合运算得到的参数如表4、表5所示。
预测烟草生长周期中根部疫霉菌增殖的数学模型：
y =360.4813×x1 2.189+(-0.068)×x2 5.162+34.968×x3 3.091+(-0.004)×x4 4.582+56.400×x5 2.822（1）
预测烟草生长周期中茎部疫霉菌增殖的数学模型：
y=(-0.111)×x1 5.274+0.300×x2 5.870+(-59864.674)×x3 1.186+(-20.852)×x4 3.676+(-177159.155)×x5 0.040 （2）
表4. 通过1stopt构建数学模型的整体信息
表5. 拟合运算得到的各参数值
5、数学模型的验证
随机取茎部和根部各4个数据（单位质量烟草疫霉菌含量的测量值），和各自采样当日的最高气温、最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量数据。将采样当日的最高气温、最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量数据作为x1、x2、x3、x4、x5分别带入根部和茎部相应的数学模型（公式1和公式2）。结果如表6所示。
表6
由表6可知，实测值和估算值结果高度一致。因此上述数学模型能有效预测计算烟草在正常生长周期（5月-9月）内根部和茎部烟草疫霉菌侵染烟草增殖情况和含量的变化，从而为烟草黑胫病的防治提供参考。
实施例3、一种烟草生长周期中根部的疫霉菌增殖的预测系统
所述烟草生长周期中根部的疫霉菌增殖的预测系统，包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
输入当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量、x1、x2、x3、x4、x5，并代入如下计算公式中，获得单位质量下的烟草疫霉菌含量y值；
y =360.4813×x1 2.189+(-0.068)×x2 5.162+34.968×x3 3.091+(-0.004)×x4 4.582+56.400×x5 2.822。
实施例4、一种烟草生长周期中茎部的疫霉菌增殖的预测系统
所述烟草生长周期中茎部的疫霉菌增殖的预测系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
输入当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量、x1、x2、x3、x4、x5，并代入如下计算公式中，获得单位质量下的烟草疫霉菌含量y值；
y=(-0.111)×x1 5.274+0.300×x2 5.870+(-59864.674)×x3 1.186+(-20.852)×x4 3.676+(-177159.155)×x5 0.040。
实施例5、计算机可读存储介质
本发明实施例提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现实施例3方法和/或实施例4方法的步骤。
当然，本发明实施例所提供的一种包含计算机可执行指令的存储介质，其计算机可执行指令不限于如上所述的方法操作，还可以执行本发明任意实施例所提供的方法中的相关操作。
通过以上关于实施方式的描述，所属领域的技术人员可以清楚地了解到，本发明可借助软件及必需的通用硬件来实现，当然也可以通过硬件实现，但很多情况下前者是更佳的实施方式。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品可以存储在计算机可读存储介质中，如计算机的软盘、只读存储器 (Read-Only Memory，ROM)、随机存取存储器(RandomAccess Memory， RAM)、闪存(FLASH)、硬盘或光盘等，包括若干指令用以使得一台电子设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述的方法。
值得注意的是，上述实施例中，所包括的各个单元和模块只是按照功能逻辑进行划分的，但并不局限于上述的划分，只要能够实现相应的功能即可；另外，各功能单元的具体名称也只是为了便于相互区分，并不用于限制本发明的保护范围。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种烟草疫霉菌的定量检测试剂盒，其特征在于，所述定量检测试剂盒包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ITS 上引物，
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ITS 下引物，
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。
2. 根据权利要求1所述的烟草疫霉菌的定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。
3. 根据权利要求1所述的烟草疫霉菌的定量检测试剂盒，其特征在于，所述ITS 上引物和所述ITS 下引物的浓度均为500 ±10 nmol/L，所述荧光探针的浓度为250 ±10nmol/L。
4.一种烟草疫霉菌的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求1-3任一所述的ITS 上引物、ITS 下引物和荧光探针，并加入ddPCRSupermix和烟草疫霉菌DNA样本以配置反应体系进行微滴式数字PCR扩增，获得烟草疫霉菌DNA样本的ddPCR的ITS片段拷贝数；
将所述烟草疫霉菌DNA样本的ddPCR的ITS片段拷贝数带入所述线性关系中，获得烟草疫霉菌DNA样本的ITS片段拷贝数浓度copies/μL；
将所述ITS片段拷贝数浓度乘以提取的DNA样本的总体积得到该样本的总拷贝数copies，再除以相应样本称量质量g，即得到单位质量下的烟草疫霉菌含量。
5. 根据权利要求4所述的一种烟草疫霉菌的定量检测方法，其特征在于，所述微滴式数字PCR扩增中的退火温度为56℃~60℃，所述ITS 上引物和所述ITS 下引物的浓度均为500 ±10 nmol/L，所述荧光探针的浓度为250 ±10 nmol/L。
6.一种疫霉菌增殖的预测模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求4或5所述的方法对田间烟草整个生长周期中采集及提取的样本的烟草疫霉菌含量进行定量检测，获得每个样本的单位质量下的烟草疫霉菌含量；
将每个样本对应采样当天的气象数据，包括当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量分别设为x1、x2、x3、x4、x5。将单位质量实际侵染样本的烟草疫霉菌含量作为y，将各样本对应的x1、x2、x3、x4、x5作为变量，通过1stopt软件采用通用全局优化算法进行拟合运算，拟合的模型公式为y = a×x1 n1+b×x2 n2+c×x3 n3+d×x4 n4+e×x5 n5，
将100个根部采样数据和100个茎部采样数据分别代入该公式后，计算出根部和茎部两组数学模型的各参数值，从而建立预测烟草生长周期中疫霉菌增殖的数学模型。
7.一种烟草生长周期中根部的疫霉菌增殖的预测系统，其特征在于，所述烟草生长周期中根部的疫霉菌增殖的预测系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
输入当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量、x1、x2、x3、x4、x5，并代入如下计算公式中，获得单位质量下的烟草疫霉菌含量y值；
y =360.4813×x1 2.189+(-0.068)×x2 5.162+34.968×x3 3.091+(-0.004)×x4 4.582+56.400×x5 2.822。
8.一种烟草生长周期中茎部的疫霉菌增殖的预测系统，其特征在于，所述烟草生长周期中茎部的疫霉菌增殖的预测系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
输入当日最高气温、当日最低气温、田间温度、田间湿度和降雨量、x1、x2、x3、x4、x5，并代入如下计算公式中，获得单位质量下的烟草疫霉菌含量y值；
y=(-0.111)×x1 5.274+0.300×x2 5.870+(-59864.674)×x3 1.186+(-20.852)×x4 3.676+(-177159.155)×x5 0.040。
9.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时使用权利要求7或8所述方法的步骤。
10.一种计算机程序产品，包括计算机程序/指令，其特征在于，所述计算机程序/指令被处理器执行时实现权利要求7或8所述方法的步骤。
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