CN103509791B - 水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记及其应用，所述Bph14的基因标记Bph14-M1正反引物序列如下：正向引物为(5′-3′)AGCCACTTGGTGAACTTATT，反向引物(5′-3′)GATTGACGATGAGGAGACTT。所述应用方法包括1)提取水稻基因组DNA；2)使用所述正反引物序列，PCR扩增水稻基因组DNA；3)电泳检测扩增产物。本发明通过该标记辅助选择，可以准确地将B5中的抗褐飞虱基因Bph14转育到褐飞虱敏感品种中去，极大地提高抗褐飞虱品种的选育效率。

Description

水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种水稻品种的基因标记及其应用，具体涉及一种水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记及其应用。

背景技术

稻褐飞虱是危害水稻产量最严重的害虫之一，近十年来，我国褐飞虱连年爆发，平均每年造成水稻产量损失高达277万t。2010年农业部农作物重大病虫发生防治周报(第23期)报道，该年我国褐飞虱累计发生3.02亿亩次，严重威胁着水稻的高产和稳产。利用抗褐飞虱基因来培育抗褐飞虱品种，是控制稻褐飞虱危害最为经济有效和环境友好的途径。

国际水稻研究所自1973年利用常规手段，先后选育出一系列带有Bph1、Bph2和Bph3等抗褐飞虱主基因的水稻品种，但数年后随着褐飞虱新生物型的产生，这些品种的抗性都出现了退化。因此，发现并利用新的抗褐飞虱基因或聚合抗性基因，已成为控制褐飞虱危害的关键所在。

由于抗褐飞虱鉴定的复杂性，采用常规育种方法很难有效选育出抗虫品种，而利用与抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记进行辅助选择，结合常规育种技术，则可以高效选择目的基因，培育抗虫品种。

迄今为止，水稻上报道了26个抗褐飞虱主效基因，其中Bph14被成功克隆，目前分子标记辅助选择育种中，对该基因的选择主要利用与之连锁的标记，如MRG2329、MRG2346、MRG2684、R1925和R2443等，而基因标记还未见报道，这在一定程度上影响了利用Bph14进行抗褐飞虱育种过程中的选择效率和准确性。

发明内容

本发明的目的是提供水稻品种B5抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记及其应用，在分子标记辅助选择育种中提高选育效率。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记Bph14-M1，其正反引物序列如下：

正向引物(5′-3′)AGCCACTTGGTGAACTTATT

反向引物(5′-3′)GATTGACGATGAGGAGACTT

本发明还公开了所述基因标记Bph14-M1的应用方法，包括：

1、提取水稻基因组DNA；

2、使用所述正反引物序列，PCR扩增水稻基因组DNA，具体操作为：PCR采用10μL反应体系：模板DNA1.0μL，10×PCRBuffer1.0μL，25mM的MgCl₂1.0μL，2mM的dNTP1.0μL，0.3μM的引物1.0μL，Taq酶0.2U，加ddH₂O补至10μL；PCR扩增条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增32个循环3)72℃延伸5min，16℃保温；

3、电泳检测扩增产物，如果出现307bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的抗褐飞虱基因Bph14；如果出现432bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的褐飞虱敏感等位基因bph14；如果有307bp和432bp两条带，则表示水稻品种为Bph14/bph14杂合体。

本发明的优点是：

1)本发明所获得的标记是根据Bph14基因内部的碱基缺失设计的，为基因自身标记，故不存在遗传交换，不需要作表型鉴定。

2)本发明的标记为共显性标记，可鉴别Bph14基因座位的杂合体和纯合体，实验重复性好，结果可靠。

3)利用本发明的标记进行辅助选择育种，不仅节约成本，而且能够准确、高效地将抗褐飞虱品种B5中的Bph14基因转育到褐飞虱敏感品种中去。

附图说明

图1为Bph14的部分序列(含第一内含子)在褐飞虱抗性品种B5和敏感品种Nipponbare(日本晴)间的比对。下划线箭头表示标记Bph14-M1的前后引物序列位置；虚线表示缺失的核苷酸序列。

图2为Bph14的基因结构及标记Bph14-M1在基因中的位置。

图3为标记Bph14-M1对14个水稻品种的基因型检测结果。M为DNAmarker，1～14分别为：B5、93-11、桂朝2号、R7954、R402、R752、龙特甫B、中花11、日本晴、秀水63、02428、武育粳3号、宁恢8号、Lemont。

具体实施方式

1、供试材料

2、DNA提取

在苗期取水稻叶片，基因组DNA的提取参照Scott等(1988)的CTAB法，改进如下：

1)取约0.1g叶片，置于2.0mL离心管中，加入1粒钢珠及500μL2×CTABDNA提取液(20gCTAB，12.1gTris-Base，7.44gEDTA-Na，81.9gNaCl，溶解于1L蒸馏水中)，使用组织研磨仪打碎叶片，65℃水浴30min，期间振动混匀数次；

2)从水浴中取出离心管，加入约500μL氯仿(CHCl₃)，充分震荡混匀，在10000rpm下离心5min；

3)转移上清液至一新的1.5mL的离心管中，加入上清体积0.7～1倍的异丙醇，将离心管轻微混匀后于-20℃冰箱中放置半小时后，10000rpm离心5min；

4)弃上清液，管底的乳白色沉淀用70％的酒精洗涤两次。将离心管中的酒精倒出后，倒置于干净的吸水纸上自然晾干；

5)晾干后的DNA加双蒸水溶解，调节最终浓度为100～1000ng/μL，置于-20℃冰箱内保存备用。

3、抗褐飞虱基因标记的设计

将抗褐飞虱品种B5所携带的基因Bph14与敏感品种日本晴的等位基因bph14进行序列比对，发现二者之间存在众多差异，其中，Bph14相比bph14在第一内含子3′端和第二外显子5′端分别发生了119bp和6bp的缺失(图1)，根据该差异采用在线软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计了基因标记Bph14-M1(图2)，正反引物序列如下：

正向引物(5′-3′)AGCCACTTGGTGAACTTATT

反向引物(5′-3′)GATTGACGATGAGGAGACTT

4、基因型分析

利用标记Bph14-M1对14份供试水稻品种进行基因型检测，PCR采用10μL反应体系：模板DNA1.0μL，10×PCRBuffer1.0μL，25mM的MgCl₂1.0μL，2mM的dNTP1.0μL，0.3μM的引物1.0μL，Taq酶0.2U，加ddH₂O补至10μL。

PCR扩增条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，16℃保温。

PCR反应产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上拍照。抗褐飞虱品种B5扩增出预期的307bp的片段，在其余13份褐飞虱敏感品种中扩增出约432bp的片段(图3)，电泳谱带清晰、特异，表明利用该基因标记可以很好地区分Bph14基因座上的两种等位基因型，可用于水稻抗褐飞虱基因Bph14的标记辅助选择育种。

Claims (3)

1.一种水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记Bph14-M1，其正反引物序列如下：

正向引物(5′-3′)AGCCACTTGGTGAACTTATT，

反向引物(5′-3′)GATTGACGATGAGGAGACTT。

2.权利要求1所述基因标记Bph14-M1的应用方法，包括以下步骤：

1)提取水稻基因组DNA；

2)使用所述正反引物序列，PCR扩增水稻基因组DNA；

3)电泳检测扩增产物，如果出现307bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的抗褐飞虱基因Bph14；如果出现432bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的褐飞虱敏感等位基因bph14；如果有307bp和432bp两条带，则表示水稻品种为Bph14/bph14杂合体。

3.如权利要求2所述基因标记Bph14-M1的应用方法，其中，步骤2)中具体操作为：PCR采用10μL反应体系：模板DNA1.0μL，10×PCRBuffer1.0μL，25mM的MgCl₂1.0μL，2mM的dNTP1.0μL，0.3μM的引物1.0μL，Taq酶0.2U，加ddH₂O补至10μL；PCR扩增条件为：(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增32个循环；(3)72℃延伸5min，16℃保温。