CN103525822B - 一种仔猪腹泻抗性相关的分子标记检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用于猪腹泻抗性性状相关的分子标记的检测及应用。所述的分子标记由基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所述。在序列表SEQ？ID？NO：1的第625bp处有一个G/T的碱基突变，导致PCR-RFLP-BshN1多态性。本发明还公开了扩增基因DNA序列所用的引物以及用于多态性的检测方法。本发明为猪腹泻抗性性状标记辅助选择提供了新的分子标记。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种包含如SEQIDNO：1所示仔猪基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。
背景技术
研究表明，GPI与生物体很多疾病有关。已知的与人沉积在老年性痴呆、感染性蛋白质疾病(包括人的Creutzfeld-Jakob病，Gerstmann-straussler-scheinker综合症，库鲁病和绵羊及山羊的瘙痒症等)、类风湿关节炎、非洲昏睡病、疟疾、阵发性夜间血红蛋白尿症、慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等有直接关系。
在白念珠菌耐药基因研究中，GPI1被认为与耐药有关(麻志萍等，2008)。在朊蛋白的有关研究中，GPI锚定位点的移除可减少对感染性朊蛋白疾病的易感性，保护了可溶性的PrPc转变为支持感染性朊蛋白复制的分子(张太翔，2008)。还有研究表明，缺氧状态下，YC-1抑制人胰腺癌PC-3细胞血管内皮生长因子(VEGF)和GPI基因转录与其抑制HIF-1α蛋白的表达有关，YC-1能够抑制人胰腺癌PC-3细胞生长和增殖。同时有实验表明，在鼠的肝脏内腔隙中存在GPI-PLD，在移去肝脏以后，酶的活性明显下降，在紧接着移植入肝后，酶的活性明显增加，在严重肝疾病时，酶的活性依赖于肝的合成储备功能，说明肝是其主要来源。在病毒性肝炎及支气管炎肺炎时，其活性明显上升，说明GPI-PLD也可作为一个急性期反应物。竞争性RT-PCR监测在不同恶性程度肿瘤细胞中GPI-PLDmRNA的表达水平，发现释放大量肿瘤可溶性预后标记物的卵巢癌细胞与释放少量标记物的卵巢癌细胞相比，其GPI-PLDmRNA的表达水平明显增加(XiaoGuang-fen，2010)。
人的GPI1基因包含11个外显子，定位于16pl3.3，靠近α血红蛋白基因座，GPI1基因在组织和细胞中的表达无所不在，尤其在骨髓、胎儿肝脏等造血组织中的表达显著高于其他组织。GPI1基因目前已被确认是GPI生物合成的必需组成部分。GPI编码产物与糖基磷脂酰肌醇的合成密切相关。在生物体的免疫、代谢等多个方面发挥重要的作用。可以预见，由于GPI1基因对于GPI合成的重要性，GPI1基因对于生物体的疾病有着非常重要的调控作用。而目前对猪GPI1基因的结构和功能的研究却还不太深入。
本发明选择猪GPI1基因作为猪腹泻抗性性状的候选基因，以3个外来猪种(杜洛克猪、大白猪、长白猪)和1个本地猪种（宁乡猪）为试验材料，采用PCR-RFLP方法对GPI1基因G/T位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传结构，初步探讨该基因与腹泻抗性性状的相关性。目前国内外关于猪GPI1基因的相关研究很少。本发明将找到与仔猪腹泻抗性有关的遗传标记，为筛选ETECF4抗性猪提供可行的标记辅助选择方法，为选育ETECF4抗性猪配套系提供理论研究依据。
发明内容
本发明的目的在于找到与仔猪腹泻抗性有关的遗传标记，为筛选ETECF4抗性猪提供可行的标记辅助选择方法，为ETECF4抗性猪的早期选种提供依据，为选育ETECF4抗性猪配套系提供理论研究依据。
本发明通过以下技术方案实现：
利用比较基因组学方法，根据发明人提交到GenBank的GPI1基因序列（收录号为JX125039）和人的GPI1基因的保守区设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序技术发现SNP，并利用PCR－RFLP进行基因分型，再利用独立性卡方检验对检测的该基因SNPs与腹泻抗性的关联度进行分析，以检验该SNPs的实际应用效果。
（1）PCR引物设计与序列获得
利用PrimerPremier软件，根据不同物种的GPI1基因的保守序列制备了检测上述序列表SEQIDNO：1基因片段突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5′-CTTGGAGCTAAGCAGTGATGTG-3′，反向引物为5′-CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3′。该引物对的退火温度为62℃，以猪的基因组DNA为模板，构建20μL的扩增体系，经过预变性、变性－退火－延伸33个循环以及后延伸的反应过程，获得了目的片段，片段核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。
（2）SNP发现与检测方法建立
发明人通过对扩增序列测序，得到了一种与仔猪腹泻抗性相关的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。序列表SEQIDNO：1序列的625bp处有1个G/T的碱基突变，导致PCR-RFLP-BshN1多态性，PCR产物经BshN1酶切后，显示出GG、GT和TT三种基因型。
发明设计了扩增包含该SNPs的引物，经分析G/T位点的突变可以采用BshN1进行酶切检测多态性。在扩增的809bp的片段上，存在1个BshN1的酶切位点，经2%琼脂糖凝胶电泳检测后结果显示，在GPI1基因的G/T位点存在3种基因型，GG型（809bp）、GT型（345bp、464bp、809bp）和TT基因型（345bp、464bp）。
（3）基因型－腹泻抗性关联分析
利用独立性卡方检验对基因型与腹泻性状进行关联分析，分析表明在杜洛克猪、长白猪、大白猪中T基因为优势等位基因，T基因频率分别为1，0.99，0.97，而在宁乡猪中G基因为优势等位基因，基因频率为0.85。GPI1基因的基因型分布在以这四个猪种为代表的中外猪种中差异较大，三个外来品种的仔猪的基因型分布与宁乡猪中的分布差异极显著（p＜0.01），仔猪外显子的两种基因型TT型、GT型间的腹泻抗性差异显著（0.01＜p＜0.05），尤其在大白猪、长白猪外显子的两种基因型TT型、GT型间的腹泻抗性差异极显著（p＜0.01），表明杜洛克、长白猪、大白猪TT基因型的腹泻个体非常集中，在杜洛克、长白猪、大白猪这三个品种猪中TT型将可能是腹泻抗性的参考遗传标记。
利用上述制备的与猪腹泻抗性相关的分子标记对不同猪品种的腹泻情况进行了关联分析的应用，从而完成了本发明。
附图说明
图1GPI1基因SNPs位点的PCR扩增产物
图2GPI1基因SNPs位点的酶切电泳结果
泳道1，5，6，7，9，12：GG基因型；泳道2，3，4，11：GT基因型；泳道8，10：TT基因型；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施方式并不对本发明做任何限定。
实施例1：
1.引物设计
利用比较基因组学方法根据猪的GPI1基因（GenBank收录号为JX125039）的第1外显子，以该基因在GenBank作BLAST，序列比对后筛选出GPI1基因候选SNPs位点，选取GPI1基因的第625bp候选SNPs位点，以JX125039.seq序列为标准，设计引物，运用PCR－RFLP技术验证该位点的存在。
引物序列M-F：5′-CTTGGAGCTAAGCAGTGATGTG-3′，
M-R：5′-CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3′
2.PCR条件的DNA提取
DNA样品来自4个品种共183头，其中新五丰原种猪场杜洛克猪26头、大白猪55头、长白猪34头；地方品种宁乡猪68头。取小块供试猪耳组织提取DNA。
PCR条件：
PCR反应体系（总体积20μL）：10×buffer2μL，2mmol/LdNTPs1.6μL，20mmol/LMgCl21.6μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.4μL，DNA模板（100ng/μL）1μL，上下游引物（10pmol/μL）各0.5μL，ddH2O12.4μL。
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，共33个循环；72℃后延伸5min，最后4℃保存。
取10μLPCR扩增产物，加2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于1%的琼脂糖凝胶（含0.05%EB）上，然后点6μL100bpDNAMarkers作为参照。5V/cm电泳0.5～1.0h。电泳结束后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照，结果如图1所示。将纯化后的PCR产物后送铂尚生物技术公司测序。
3.PCR产物的BshN1酶切
在10ulPCR产物中加入8ul10×内切酶缓冲液、0.2ul限制性内切酶和2ul双蒸水，总体积为20.2ul，37℃消化4-10h。G/T位点用2%琼脂糖凝胶电泳分析，5V/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照，酶切结果如图2，扩增产物进行测序，序列如SEQIDNO：1所示，扩增片断为猪GPI1基因的87bp到895bp之间，为第1外显子的片断，共809bp，为PCR-RFLP-BshN1分子标记，图2是本发明中GPI1基因，PCR-RFLP的三种基因的TT、GT和GG电泳结果。图中M：DNA分子量标准（DL2000ladder）
PCR-RFLP-BshN1多态性在各品种中的分布情况如下表1所示，由表1可以看出，在杜洛克猪、长白猪、大白猪中T基因为优势等位基因，T基因频率分别为1，0.99，0.97，而在宁乡猪中G基因为优势等位基因，基因频率为0.85。从四个品种的基因型频率分布来看，TT基因型在外来品种的杜洛克猪、长白猪、大白猪中的分布占优势，而在宁乡猪中，两个基因型的分布差异较大；卡方检验结果表明，本试验中的三个外来品种杜洛克猪、长白猪和大白猪均处于Hardy-Weinberg平衡状态，属于平衡群体；而本地猪种宁乡猪不处于Hardy-Weinberg平衡状态，不属于平衡群体。
表1不同品种GPI1基因G/T位点的Hardy-Weinberg平衡检验
注：χ2 0.05（1）=3.84，χ2 0.05(2)=5.99，χ2 0.01(1)=6.63，χ2 0.01(2)=9.21下同。
表2外来品种猪和宁乡猪检测样本的GPI1基因型分布情况
本发明的分子标记在猪腹泻抗性标记性状关联分析中的应用
运用独立性卡方检验对GPI1基因型与猪腹泻抗性进行关联分析，见表3。
表3GPI1基因外显子多态位点与仔猪腹泻性状的关联
从表2可以看出，GPI1基因的基因型分布在中外猪种中差异较大，在三个外来品种的仔猪（表中称为仔猪）与宁乡猪中的分布差异极显著（p＜0.01），外来品种中TT基因型为优势基因，而宁乡猪恰好相反，GG基因型分布占优势。表明外来品种和宁乡猪对ETECF4的敏感性存在极显著差异。
经过卡方检验（见表3），新五丰仔猪外显子的两种基因型TT型、GT型间的腹泻抗性差异显著（0.01＜p＜0.05），而在大白猪、长白猪外显子的两种基因型TT型、GT型间的腹泻抗性差异极显著（p＜0.01），表明杜洛克、长白猪、大白猪TT基因型的腹泻个体非常集中，TT型个体数量相对于GT型、GG型而言，数量要大很多，分析出现这一情况可能的原因与品种有关，杜洛克猪、长白猪和大白猪是外来猪种，都是经过高度选育培育而成，在培育过程已经逐步降低敏感基因GG型在群体中的比例，淘汰了腹泻的敏感基因GG型，因而在杜洛克猪、长白猪和大白猪这三个品种猪中TT型将可能是腹泻抗性的参考遗传标记。
Claims (2)
1.一种仔猪腹泻抗性相关的GPI1基因片段，其特征在于：序列表SEQIDNO：1的625bp处的碱基突变为G或T，导致PCR-RFLP-BshN1多态性。
2.如权利要求1所述的仔猪腹泻抗性相关的GPI1基因片段在选育具有抗腹泻性状的猪种中的应用。
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