CN115125306A - 一种猪抗病力分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家畜分子标记技术领域，具体涉及一种猪抗病力分子标记及其应用。本发明的DNA分子标记由PCR扩增并经测序得到，其分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，是在SEQ ID NO：1的第143bp位置的一个突变，可以应用于安庆六白猪抗病力筛选。本发明为安庆六白猪抗病力的提高提供了新的分子遗传标记。
Description
技术领域：
本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种猪抗病力分子标记及其应用。
背景技术：
安庆六白猪，俗名“六花猪”，属肉脂兼用性地方品种。该品种全身被毛黑色，额部﹑尾端和四肢均白色为其毛色特征，故得六百之称。安庆六白猪具有抗病性强，耐青粗饲料的特性。2006年，安庆六白猪被农业部列为重点保护名录。目前以订单方式建立了“公司+基地+农户”和“养殖生产计划+保底价回收承诺”的生产经营开发体系，以纯种六白猪和含六白猪血缘的内二元﹑内三元杂种猪为猪源，开发生产腊肉﹑腌肉﹑肉丸﹑扣肉等适销产品。
杀菌通透性蛋白基因(Bactericidal/permeability-increasing protein gene，BPI)最早在人的多形核中性粒细胞(poly-morphonuclear neutrophils)的嗜天青颗粒中被发现,属于脂多糖结合蛋白，是中性粒细胞中发现的多种具有抗微生物活性的蛋白分子之一。BPI基因在机体免疫应答调节和抵抗病毒感染方面有重要的作用，其多态性与动物相关病原的免疫力明显相关。BPI蛋白是一种能够抗感染的蛋白质，储存于中性粒细胞，有“超级抗生素”的称号。
本发明对安庆六白猪进行全基因组重测序，并与其它猪的全基因组序列进行比较，鉴定安庆六白猪基因组中的SNP序列，揭示安庆六白猪的序列差异。本发明旨在挖掘安庆六白猪的优异基因资源和筛选一般抗病力的标记，为安庆六白猪的品牌开发提供可靠的理论依据。
发明内容：
本发明的目的在于为安庆六白猪品种抗病力提供一种有用的分子遗传标记及其具体的应用。
一种猪抗病力分子标记，为SEQ ID NO：1所示序列(该序列属于杀菌通透性蛋白基因(Bactericidal/permeability-increasing protein gene，BPI)第10外显子)的一个SNP突变。
扩增长度为445碱基的序列，第143bp的位置发生G/T突变，导致限制性内切酶HpaⅡ位点的改变，并产生GG、GT和TT基因型。
GG基因型扩增后对应电泳时只有一个片段；
GT基因型扩增后对应电泳时有三个片段；
TT基因型扩增后对应电泳时有两个片段。
根据所述的分子标记，SNP位点进行基因分型的引物对，如下所示，
正向引物为5′-CCA AAC ATG GAG ATG CAG TTC-3′，SEQ ID NO：2；
反向引物为5′-CAA TGA ATC AAT GAG CAC ACC-3′；SEQ ID NO：3。
所述的分子标记的应用方法，用于抗病能力强的选种。
具体包括以下步骤：
(1)获得待检测猪的基因组DNA；
(2)以上述猪基因组DNA为模板，采用如下引物对进行扩增，获得含有突变位点的片段；
正向引物为5′-CCA AAC ATG GAG ATG CAG TTC-3′，反向引物为5′-CAA TGA ATCAAT GAG CAC ACC-3′；
(3)通过琼脂糖凝胶电泳对上述扩增产物进行检测；
(4)对PCR产物进行测序分析，检测上述扩增片段内突变位点多态性。
所述的应用方法，选种对象包括：安庆六白猪。
本发明还提供了用于将所述的SNP位点进行基因分型的引物对，所述的引物序列如下所示：
正向引物为5′-CCA AAC ATG GAG ATG CAG TTC-3′，
反向引物为5′-CAA TGA ATC AAT GAG CAC ACC-3′。
本发明分子标记开发过程：
DNA的提取：安庆六白猪样品DNA的提取使用传统的酚氯仿法提取DNA,具体操作步骤如下：(1)将去毛后的新鲜猪耳样取0.5g洗净切碎放入1.5ml的离心管中，加入裂解液0.5ml蛋白酶K(10mg/ml)15μL后震荡混匀，置55℃消化3-4h，每隔30min震荡一次，使样品消化完全。(2)于12000rpm离心5min，取上清液，向上清液中加入等体积Tris饱和酚(550μL)并震荡混合均匀，后12000rpm4℃离心8min，离心后提取上清液。(3)提取上清液置于1.5ml离心管后加入等体积(500mL)的氯仿/异戊醇(氯仿：异戊醇24:1)震荡混匀，12000rpm 4℃离心8min，取上清液。(4)若抽提后的上清液存留少量杂质，可重复进行步骤(2)和步骤(3)，以提高获得的DNA的纯度。(5)取上清液于1.5mL离心管，加入两倍体积(1mL)冰冷的无水乙醇(置于-20℃冰箱)混匀，产生白色絮状沉淀，于8000rpm 4℃离心2min。(6)弃去上清液，向离心管底部白色沉淀(DNA)中加入75％的酒精0.5ml。(7)清洗残留杂质，后12000rmp 4℃离心5min，弃上清静置干燥。(8)加入适量TE缓冲液，一般为200-400μL，-20℃保存。用NanoDrop2000紫外分光光度计对提取的DNA样品进行测定，获得DNA样本的浓度、A260/280、A260/230，后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像系统拍照，通过观察得到的凝胶电泳图谱检测所提取DNA样品的质量。
安庆六白猪重测序文库的构建：将质检后的安庆六白猪基因组DNA样品全序列进行打断构建相应的文库并测序。对于单分子实时(SMRT)测序，使用测序标准方案制备插入片段大小为20kb的基因组文库。用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)评估最终的DNA文库，并在Genome Center of Nextomics的PacBio Sequel仪器(PacificBiosciences)上测序。由于SMRT读数的存在高错误率的缺点，根据标准制造商的方案(Illumina)使用TruSeq Nano DNA HT样品制备试剂盒构建了具有大约400bp插入物大小的无PCR双末端文库。在质量控制后，所有无PCR文库在Illumina Hiseq×ten平台(Illumina)上用配对末端测序策略测序。
安庆六白猪全基因组测序数据的比对：全基因组重测序序列比对主要由映射(Mapping)、合并(Merge)、建立索引(Index)三部分组成。利用BWA软件、Samblaster软件以及Samtools软件将过滤得到的高质量fastq数据映射(mapping)到参考基因组上，生成能被Samtools软件识别和操作的bam文件，过滤掉比对结果较差的reads，之后通过picard软件对过滤后的sam文件进行排序。然后，利用Samtools软件将映射后得到的各个样本的bam文件进行短序列拼接，生成sorted文件，然后所得样本的数据进行合并,生成merge文件后，使用Samtools软件对merge文件中已经合并好的数据建立索引。
安庆六白猪基因组SNP检测：对测序获得的安庆六白猪全基因组数据进行质量控制及过滤后，使用以下程序进行SNP调用：(1)用BWA将读数映射到参考基因组，并使用picard工具确定读数的顺序。(2)用samtools rmdup除去重叠部分后，GATK用于Indel重排和碱基重新校准。(3)最后，使用GATK检测和过滤SNP，标准如下：--filterExpression“QD<2.0和FS>200.0，ReadPosRankSum<-20.0，InbreedingCoeff<-0.8，DP>728”。
SNP突变位点检测：申请人设计了扩增包含该SNP突变的引物对，该SNP突变可以采用PCR-RFLP检测其长度多态性。在扩增的片段上，存在1个SNP长度多态性，通过琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果证实了存在一个SNP突变。
本发明将为安庆六白猪抗病力的鉴定提供新的分子遗传标记，为其品种的保护和开发奠定坚实的基础，提高养安庆六白猪生产经济效益，并指导安庆六白猪的本品种选育实践。
附图说明：
图1是本发明的提取的DNA PCR扩增产物的电泳结果图。
图中：M：100bp DNA Ladder Marker，1-7表示不同泳道。
图2是本发明的SNP的PCR电泳结果。
图中：7泳道为GG型(445bp)，2、4和8泳道为GT型(445bp/304bp/142bp)和1、3、5和6为TT型(304bp/142bp)。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施并不对本发明做任何限定。
实施例1：
PCR技术检测安庆六白猪特有的基因的片段的多态性。
引物设计：利用安庆六白猪全基因组重测序的结果设计引物，进而筛选出候选SNP突变，设计特异性引物，用这些引物来扩增从安庆六白猪耳组织提取的基因组DNA。
表1鉴定SNP突变的引物及其扩增条件
该实验214头安庆六白猪来自安徽省安庆六白猪保种场，用剪耳钳剪取耳组织约0.5g后及时放入-20℃冰箱冷冻保存备用。
PCR条件：PCR反应体系(20μL)为：2×PCR Master Mix 10μL，dd H2O 8.0μL，引物工作液1.0μL，样品基因组DNA 1.0μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；相应退火温度退火30s；72℃延伸30s，共35个循环；72℃后延伸5min；4℃保存。
取10μL PCR扩增产物，2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀，2％的琼脂糖凝胶(含0.05％EB)电泳，然后点6μL 100bpDNA Markers作为参照。5V/cm电泳0.5～1.0h。凝胶成像系统观察扩增结果并拍照，结果如图1所示。将纯化后的PCR产物后送铂尚生物技术公司测序，序列如SEQ ID NO：1所示。
PCR产物的分型：在10μL PCR产物中加入8μL 10×内切酶缓冲液、0.2μL限制性内切酶HpaⅡ和2μL双蒸水，总体积为20.2μL，37℃消化10h。用1％琼脂糖凝胶电泳分析，5V/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照，酶切结果如图2，图2是本发明中SNP片段长度多态性电泳结果。图中M：DNA分子量标准(DL100bp ladder)。
一般抗病力表型确定：记录214头安庆六白猪的一般抗病力表型，非洲猪瘟感染后又恢复健康的判定为一般抗病力(GT或者TT)，非洲猪瘟感染后死亡的鉴定为不具有一般抗病力(GG)。
基因型与一般抗病力间关联分析：利用SAS软件中的一般线性模型(GeneralLinear Model,GLM)程序对基因型与性状进行关联分析，模型如下：Yi＝μ+gi+ε，Yi为性状表型值，μ为总体均数，gi为BPI基因位点(G/T)不同基因型的效应，ε为随机误差效应，服从正态分布(0,σ2)。分析表明BPI基因SNP位点对一般抗病力有显著影响(P<0.05)。
安庆六白猪BPI基因的基因型及等位基因频率
利用PCR-RFLP法检测安庆六白猪的个体，计算出猪的基因型和基因频率。统计结果表示，安庆六白猪中GT基因型为优势基因型，T等位基因是优势等位基因，结果如表2。
表2安庆六白猪BPI基因基因型频率及等位基因频率
本发明通过PCR-RFLP方法检测214头安庆六白猪BPI基因第10外显子多态性，T是优势等位基因，存在GG、TT、和GT三种基因型，安庆六白猪GT基因型最多，安庆六白猪BPI基因的GT基因型具有较高的免疫应答能力。经统计每个个体的抗病力表型和基因型的关联分析，确定T等位基因是具有一般抗病力的等位基因(p<0.05)。GG型一般抗病力显著性低于GT型和TT型(P<0.05)，而TT型和GT型之间不存在显著性差异(P>0.05)。
序列表
<110> 湖南华豚种猪股份有限公司
湖南农业大学
<120> 一种猪抗病力分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 445
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 1
acgcggggga cttatgtttc cccagctgcc tcctctacag gtccctggtt cccctccaag 60
gcctcaaggc tttggcagct ctgcaacgcg aagacatggc caggggcgct gacaacacac 120
tcaggtgggc gactctggtg gcgctggctg ccctgggcac agctgtgaca gcggctgcca 180
accccggcat tgtggccagg atcacacaga agggcctgga ctacgcctgc cagcagggag 240
tggctactct gcggaaggag ctggagaaga tcacgattcc cactttctcc ggaagcttta 300
agatcaagta ctttgggaaa ggacgttata acttctacag catggttgtt cgtgaattca 360
agcttcccac ttcccagata agactgtcac ctgaccaggg ccttgatctc tccatcaaag 420
atgccagtgt caagatcagt ggaaa 445
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaaacatgg agatgcagtt c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caatgaatca atgagcacac c 21
Claims (6)
1.一种猪抗病力分子标记，其特征在于，为SEQ ID NO：1所示序列的一个SNP突变；第143bp的位置发生G/T突变，并产生GG、GT和TT基因型。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，SNP位点进行基因分型的引物对，如下所示，
正向引物为5′-CCA AAC ATG GAG ATG CAG TTC-3′，
反向引物为5′-CAA TGA ATC AAT GAG CAC ACC-3′。
3.权利要求1或2所述的分子标记的应用方法，其特征在于，用于抗病能力强的选种。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，
(1)获得待检测猪的基因组DNA；
(2)以上述猪基因组DNA为模板，采用如下引物对进行扩增，获得含有突变位点的片段；
正向引物为5′-CCA AAC ATG GAG ATG CAG TTC-3′，
反向引物为5′-CAATGAATC AAT GAG CAC ACC-3′；
(3)通过琼脂糖凝胶电泳对上述扩增产物进行检测；
(4)对PCR产物进行测序分析，检测上述扩增片段内突变位点多态性。
5.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，选种对象包括：安庆六白猪。
6.用于将权利要求1所述的SNP位点进行基因分型的引物对，其特征在于所述的引物序列如下所示：
正向引物为5′-CCA AAC ATG GAG ATG CAG TTC-3′，
反向引物为5′-CAA TGA ATC AAT GAG CAC ACC-3′。
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2022
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