CN114836450B

CN114836450B - 有色大麦籽粒花青素转运相关基因HvGST及其应用

Info

Publication number: CN114836450B
Application number: CN202210765293.7A
Authority: CN
Inventors: 王春超; 郭刚刚; 徐东东; 达瓦顿珠; 张京
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2042-06-30
Also published as: CN114836450A

Abstract

本发明公开了有色大麦籽粒花青素转运相关基因，为如下（a）、（b）或（c）的基因：（a）其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，（b）其碱基序列如SEQ ID NO:2所示，（c）其碱基序列如SEQ ID NO:3所示；在大麦植株中提供花青素由细胞质到液泡的转移的功能。本发明还公开了有色大麦籽粒花青素转运相关基因在针对候选基因关键变异开发籽粒颜色相关诊断标记、大麦辅助选择育种或制备大麦辅助选择育种试剂盒中的应用。本发明可实现对有色大麦、白大麦材料快速高效准确的鉴定，对有色大麦新品种选育和分子育种具有促进作用。

Description

有色大麦籽粒花青素转运相关基因HvGST及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及有色大麦籽粒花青素转运相关基因HvGST及其应用。

背景技术

花青素是广泛存在于植物中的天然水溶性色素，属于黄酮类化合物，也是植物的一种主要呈色物质。花青素具有多种生物学功能，具有清除自由基、抗氧化的功效，可以阻止由活性氧造成蛋白质、核酸等生物大分子物质的氧化损伤，具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、预防心脑血管疾病、抗菌等作用。

西藏裸大麦，俗称青稞，广泛种植于我国青藏高原地区，是我国藏族同胞的主要粮食作物，也是藏族人民制作“糌粑”和酿造“青稞酒”的主要原料。青稞含多种花青素，不同花青素在青稞籽粒中积累会呈现不同的颜色，主要为三种颜色：白粒、蓝粒和紫粒。其中蓝青稞籽粒中花色素苷主要色素为飞燕草素的衍生物如飞燕草-3-丙二酰葡萄糖苷、矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷等；而紫青稞主要色素为矢车菊素衍生物，如矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷等。

目前，花青素的生物合成途径是由一系列结构基因和调节基因共同参与合成的，而结构基因通常受MYB、bHLH和WD40蛋白复合体基因控制，三类转录因子通过互作形成复合体与结构基因启动子中相应的顺式作用原件结合从而调控花青素的合成。控制大麦紫粒花青素合成的基因均已被克隆，主要是由Ant1和Ant2两个转录因子所调控，分别为R2R3-MYB和bHLH转录因子，两个基因同时为显性时籽粒才表现为紫色表型。研究表明至少存在5个控制大麦蓝粒花青素合成的基因位点。目前，大麦蓝粒糊粉层的花青素合成相关基因的报道仅限于4H染色体的Blx1位点，该位点鉴定到包含三个基因HvMYC4H、HvMYB4H、HvF35H基因簇MbHF35。而对于蓝粒大麦花青素的生物合成途径及其它位点的基因研究仍较少。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供有色大麦籽粒花青素转运相关基因。

本发明另有一个目的是提供大麦籽粒花青素转运相关基因突变体。

本发明另有一个目的是提供与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记。

本发明另有一个目的是提供鉴定大麦籽粒颜色的方法。

本发明另有一个目的是提供试剂盒。

本发明再有一个目的是提供所述的有色大麦籽粒花青素转运相关基因和/或所述的有色大麦籽粒花青素转运相关基因自然变异突变体在针对候选基因关键变异开发籽粒颜色相关诊断标记、大麦辅助选择育种或制备大麦辅助选择育种试剂盒中的应用。

本发明再有一个目的是提供所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记的引物在大麦辅助选择育种或试剂盒制备中的应用。

本发明另有一个目的是提供所述的有色大麦籽粒花青素转运相关基因和/或所述的有色大麦籽粒花青素转运相关基因突变体在针对候选基因关键变异开发籽粒颜色相关诊断标记、大麦辅助选择育种或制备大麦辅助选择育种试剂盒中的应用。

本发明另有一个目的是提供所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记的引物在大麦辅助选择育种或试剂盒制备中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种有色大麦籽粒花青素转运相关基因，所述有色大麦籽粒花青素转运相关基因为如下（a）、（b）、（c）或（d）的基因：

（a）其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，即HvGST基因H1单倍型和H2单倍型的CDS序列。

（b）其碱基序列如SEQ ID NO:2所示，HvGST基因H1单倍型全基因组序列。

（c）其碱基序列如SEQ ID NO:3所示，HvGST基因H2单倍型全基因组序列。

（d）其编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述有色大麦籽粒花青素转运相关基因在大麦植株中提供花青素由细胞质到液泡的转移的功能，使大麦籽粒表现为有色表型，所述有色表型包括蓝色和紫色表型。

有色大麦籽粒花青素转运相关基因自然变异突变体，所述自然变异突变体（白大麦）为如下（e）、（f）或（g）的基因：

（e）其碱基序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列末端203 bp碱基缺少导致移码突变的碱基序列，如SEQ ID NO:5所示，即HvGST 基因H3单倍型CDS序列。

（f）其碱基序列如SEQ ID NO:6所示，HvGST基因H3单倍型全基因组序列。

（g）其编码如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述自然变异突变体在大麦植株中不提供花青素由细胞质到液泡的转移的功能，使大麦籽粒表现为白色表型。

与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记，所述InDel分子标记的扩增引物包含：碱基序列分别如SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列。

优选的是，所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的InDel分子标记中，所述InDel分子标记的扩增引物包含两对引物对，分别为：

如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的一对引物对，和，

如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26所示的一对引物对。

鉴定大麦籽粒颜色的方法，包括如下步骤：

1）提取待鉴定大麦植株的基因组DNA；

2）以步骤1）中的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26所示的引物序列进行PCR扩增；

3）将步骤2）中得到的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行条带检测，若仅能检测到PCR扩增产物中有且仅有符合第一预期大小的片段存在，则认为其模板基因组DNA的来源植株的籽粒颜色表现为白色表型，若能检测到PCR扩增产物中有符合第二预期大小的片段存在，在其它花青素相关基因为有功能的前提下，则认为其模板基因组DNA的来源植株的籽粒颜色表现为蓝色或紫色表型。作为优选，第一预期大小为228 bp，第二预期大小为606bp和/或431 bp。

优选的是，所述的鉴定大麦籽粒颜色的方法，步骤2）中，利用如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的一对引物对和如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26所示的一对引物对分别或同时以步骤1）中的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

试剂盒，所述试剂盒含有能够检测所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记的扩增引物。

所述的有色大麦籽粒花青素转运相关基因和/或所述的蓝大麦籽粒花青素转运相关基因自然变异突变体在针对候选基因关键变异开发籽粒颜色相关诊断标记、大麦辅助选择育种或制备大麦辅助选择育种试剂盒中的应用。

所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记的引物在大麦辅助选择育种或试剂盒制备中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明公开了一个与有色大麦籽粒花青素转运相关基因谷胱甘肽转移酶GST基因，命名为HvGST；主要是通过全基因组关联分析方法分别在4HL和7HL鉴定到两个显著关联的QTL位点，其中7HL染色体上的HvGST基因是小麦族中首次报道的与籽粒花青素转运相关基因，HvGST编码区的末端的203 bp的碱基缺失导致移码突变，进而阻断花青素的转移，产生白色的大麦籽粒。本发明基于候选基因关键变异位点开发的InDel标记，可实现对有色大麦/白粒大麦材料快速高效准确的鉴定，对蓝粒大麦新品种选育和分子育种具有促进作用。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例中蓝粒大麦糊粉层颜色全基因组关联分析图，A：蓝大麦和白大麦全基因组关联分析分析曼哈顿图,实线和虚线分别代表建议阈值（(p <1.99×-4)）和显著性阈值(p < 9.95×-6)；B：4H和7H关联区间SNPs位点间连锁不平衡的水平；C：7H染色体上2.80 Mb基因组区间内正常表达基因及其变异信息；D：HvGST基因的单倍型分析。

图2为本发明实施例中GST基化树分析图，其中，A：H1/H2和H3单倍型的开发阅读框序列分析，B：GST（HvGST）蛋白在禾本科中同源蛋白家族的进化树。

图3为本发明实施例中7H染色体关联区间在籽粒中表达的基因列表。

图4为本发明实施例中HvGST基因在蓝粒大麦和白粒大麦在不同发育时期籽粒中表达图。

图5为本发明实施例中大麦HvGST 等位基因检测图HvGST开发相关图，其中，A HvGST 诊断标记-功能性InDel分子标记的引物设计示意图，B琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明公开了一个与有色大麦籽粒花青素转运相关基因谷胱甘肽转移酶GST基因，命名为HvGST；主要是通过全基因组关联分析方法分别在4HL和7HL鉴定到两个显著关联的QTL位点，其中7HL染色体上的HvGST基因是小麦族中首次报道的与籽粒花青素转运相关基因，HvGST编码区的末端的203 bp的碱基缺失导致移码突变，进而阻断花青素的转移，产生白色的大麦籽粒。并且，进一步地研究表明，HvGST基因对紫大麦花青素的转移也是必需的。本发明基于候选基因关键变异位点开发InDel标记，可实现对有色大麦/白粒大麦材料快速高效准确的鉴定，对有色大麦新品种选育和分子育种具有促进作用。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

本发明通过对来源于青藏高原不同地区的150份蓝青稞和246白青稞开展全基因组关联分析，以期发掘新的控制蓝色糊粉层花青素生物合成相关基因，以解析西藏青稞适应西藏独特生态环境的遗传机制及其驯化规律，并为有色大麦新品种选育提供理论基础和分子标记。

1.材料和方法

1.1植物材料

本发明收集来源于中国农业科学院国家作物种质库中保存的396份裸大麦种质资源，均为青藏高原的地方品种，其中蓝粒大麦（青稞）150份，白粒大麦（青稞）246份。所有材料均于2018年西藏拉萨种植并鉴定籽粒颜色。

1.2基因组DNA提取

采用改良的CTAB法提取大麦叶片基因组DNA，其主要方法如下：取新鲜幼嫩叶片样品置于8联排平底试管（T101-3，Simport，Canada），置于96孔板，每孔放入一粒4 mm清洗干净的钢球，经液氮快速冷冻后，使用组织研磨仪（DHSTL2010）磨样，1200 r/min，2分钟。加入600 μL 65℃预热的CTAB提取液，上下颠倒将样品悬起。60℃水浴0.5-1小时，中间颠倒混匀2-3次。2500 rpm离心1分钟（5810R 高速冷冻离心机，Eppendorf）。加入300 μL氯仿于8连管中，摇床上室温摇动10分钟。随后3000 rpm离心30分钟。吸取上清300 μL于新的八连管中，加入0.7倍体积预冷的异丙醇，室温静置5分钟，沉淀DNA，也可置于4℃冰箱沉淀数分钟以获取更多DNA。3000 rpm离心20分钟，沉降DNA，弃掉上清。加入600 μL 70%乙醇洗DNA，颠倒数次，3000 rpm离心10分钟。倒掉上清，晾干。加入200 μL 50 ng/μL RNaseA水，室温溶解30分钟（或4℃过夜溶解），37℃消化0.5小时。震荡混匀，瞬时离心，NanoDrop 2000c（ThermoScientific）测量浓度，稀释成50 ng/μL的工作液，4 ℃临时保存，长期保存置于-20℃。

1.3基因型检测及数据分析

利用改良的tGBS技术对396份大麦样本进行基因型鉴定，主要改造接头序列以适应双端测序要求，其方法参考Alina Ott et al, 2017，主要流程为，利用NspI和Sau3AI两种限制性内切酶消化约120 ng的基因组DNA，于温度37℃下消化1.5小时；利用T4 DNA连接酶双端添加标签寡核苷酸(ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATG SEQ ID NO:8) 和通用接头序列 (/5phos/GATCAGATCGGAAGAGCGGTT*C SEQ ID NO:9，其中N= G,A,T或C，NNNNNN表示6碱基的barcode序列，在高通量测序中用于区分不同样本，16℃下连接1.5小时。随后将不同样本混合，利用PCR纯化试剂盒进行纯化（QiaQuick PCR purification kit，QIAGEN）；利用高保真酶（Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer），及一个包含2 bp的选择性引物（GAACCGCTCTTCCGATCTGATC*T*G SEQ ID NO:10 ）和通用扩增引物（ACACGACGCTCTTCCGATCT SEQ ID NO:11）对纯化模板进行选择性扩增，PCR程序为95°C预变性3分钟；98°C 变形15秒，65°C退火20秒，72°C延伸20秒；72°C终延伸5分钟。利用磁珠（Agencourt AMPure XP Beads）对扩增产物纯化；第一轮纯化的产物进一步PCR扩增添加测序接头，最后对产物250-500 bp片段割胶回收进行高通量测序。

变异检测：利用Trim Galore去除接头序列和低质量序列；利用BWA-MEM软件将过滤的数据比对到morex参考基因组，利用GATK软件进行变异检测。

1.4关联分析

对29,010个 SNP 标记，首先使用 plink 软件“--geno 0.2 --maf 0.05 --indep-pairwise 50 10 0.5” 参数过滤掉缺失率大于20%的SNP，最小等位基因频率0.05及临近的连锁较强的SNP，选择染色体上均匀分布的12,009个SNP 标记分析群体结构。使用EMMA eXpedited

（EMMAX）高效混合模型(Kang et al, 2010)，通过方差分量方法进行SNP分子标记和表

型性状的全基因组关联分析，所用模型：y= Xb+Ga+e，y为表型值；X为固定效应关联矩

阵，b为固定效应向量，G为通过SNP 标记计算得到的关系矩阵，a为随机加性遗传方差的参数，e为剩余效应的向量。使用R软件包的CMplot绘制曼哈顿图和QQ图，对关联分析进行评价。

1.5转录组测序

对蓝粒大麦甘70-1-42(ZDM08340，甘肃选育)和白粒大麦藏青148（ZDM10089，西藏农牧科学院选育）授粉后籽粒授粉后10天、15天和20天的籽粒提取RNA，每个样品三个重复，RNA提取，建库及上机由北京贝瑞和康生物技术有限公司完成。利用Trim-gloare软件去除接头序列和低质量的数据，然后比对到Morex V3基因组上。利用featureCounts软件统计reads统计。使用FPKM值(每百万个reads中map到外显子的每千个碱基上的reads数)评估基因表达水平。

1.6候选基因PCR扩增及诊断标记开发

1.6.1 候选基因及诊断标记引物设计

根据Morex v3参考基因组（https://galaxy-web.ipk-gatersleben.de/）设计候选基因扩增引物，针对候选基因关键变异开发诊断标记(表1)

表1 基因引物列表

引物名称	上游引物	下游引物	用途
				GST-P1	CGGCAGAAAATTCTTGATAGC	GATGACGGCAGACTCGCAG	启动子区扩增（H1、H2和H3单倍型）
GST-E1	CTGGAGGAGAGTTTCGAGCC	GGATGAGTACCGGTATGAAAGA	编码区扩增(H1单倍型)
				GST-E2	GGATGAGCCCGTTCACAATG	CGAGATGCCTGCGATGATTT	编码区扩增(H2和H3单倍型)
GST-C	ATGGCGGGAGGCGACAAC	TTAATTTGCGCCCACGACG	cDNA扩增
				RT-GST	CTGGGTTGCTTCCTGCCG	CGCCTTGACTGCGTGGAC	实时定量PCR
HvActin	CAGGTATCGCTGACCGTATGAG	TGGAAAGTGCTGAGTGAGGCTA	实时定量PCR的内参基因
				HvGST-M1	CGCCGCTCCTCAAGAAGTG	CGTGTTCATCCCCGACCC	H1诊断标记
HvGST-M2	CGCCGCTCCTCAAGAAGTG	CCGAGATGCCTGCGATGA	H2和H3诊断标记

1.6.2 采用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）聚合酶进行PCR扩增。反应体系及其组成如下：

PCR反应体系为25 μL，各成分如下：

1.6.3实时定量PCR

对两个蓝粒大麦(ZDM07512和ZDM07664)和两个白粒大麦地方品种(ZDM06869、ZDM06630)的授粉后15天、20天和25天的种子分别取样，用植物RNA提取试剂盒(Plant RNAExtraction Kit，GeneBetter，中国）提取RNA。利用反转录试剂盒(PrimeScript™ RTReagent Kit with gDNA Eraser, TaKaRa, Japan)合成第一链 cDNA。随后利用实时定量PCR试剂盒（Powerup SYBR green master mix，Thermo Fisher Scientific, USA）进行qRT-PCR。每个反应包含 5 μL PowerUp SYBR Green、1.0 μL cDNA 模板、0.25 μL 每种正向和反向引物 (10 μM、表1中的RT-GST引物，如SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示)、3.5 μL 无核酸酶水。然后说明使用ABI 7500型实时荧光定量PCR系统（Thermo FisherScientific，USA）进行 qRT-PCR 反应，HvActin基因作为内参基因（表1中的HvActin引物，如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示）。使用

方法计算相对基因表达水平(Livak and Schmittgen 2001)。

2. 实验结果

2.1 基于全基因组关联分析挖掘蓝粒大麦糊粉层花青素合成相关基因位点

本申请利用EMMAX（efficient mixed-model association）方法对紫粒大麦和白粒大麦进行全基因组关联分析，总共鉴定到15个显著关联的SNP位点(P-value <9.95E-6)，分布于4H和7H染色体上(图1中A和B)。通过分析显著区域附近的SNP位点的LD区域，初步确定控制蓝粒大麦籽粒花青素合成的基因区间为4H:505.63-508.06 M和7H:486.18-488.98M (图1中C)。其中，在4H染色体2.43 M的区间内包含前人报道的HvMYC4H、HvMYB4H、HvF35H（507.03-507.36 Mb）的MbHF35基因簇，而7H染色体区段尚未有相关基因的报道，本申请主要关注该位点的基因发掘。

2.2蓝粒大麦糊粉层花青素合成候选基因鉴定

为避免4号位点MbHF35基因簇带来的影响，挑选MbHF35基因型一致的、但是颜色不同的两个大麦品种蓝粒大麦（甘70-1-42）和白粒大麦（藏青148）的授粉后10天、15天、20天的种子进行转录组测序继续在7H染色体区段发掘候选基因。在大麦7H:486.18 M-488.98 M范围2.8 Mb的区间内共包含21个高可信度和30个低可信度的基因。在这51个基因中，有3个细胞色素P450基因注释为非编码基因，36个基因在三个发育时期几乎没有表达。其余的12个基因，有4个基因在编码区存在错义突变（图1，图3）。同时，在这12基因中有两个基因为差异表达基因(HORVU.MOREX.r3.7HG0713570.1)和(HORVU.MOREX.r3.7HG0713360.1)，分别编码谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase, GST）和谷氨酸脱羧酶（glutamatedecarboxylase）(图3)。相对于白粒大麦(藏青148)，谷胱甘肽S转移酶基因在蓝粒大麦（甘70-1-42）为上调基因，而谷氨酸脱羧酶为下调基因。尤其是谷胱甘肽S转移酶基因随着蓝色籽粒的发育（10天、15天和20天）表达量显著增加，特别是20天其表达量（FPKM=34.0）显著增加，表明其基因表达与花青素的积累呈显著正相关。进一步序列分析发现白粒大麦（藏青148）在启动子下游+ 676 bp，覆盖部分外显子和3’UTR区域存在一个203 bp的缺失，产生一个截断的蛋白序列(图1中的D）。通过检索分析，发明人发现大麦谷胱甘肽转移酶基因是玉米BZ2（ZmBz2）基因和水稻GSTU34（OsGSTU34）基因的同源基因，参与花青素由细胞质到液泡的转移。因此将该谷胱甘肽转移酶基因初步确定为蓝粒大麦花青素合成的候选基因，将其命名为HvGST。

为进一步验证该变异位点，随机挑选30份蓝粒大麦和108份白粒大麦利用三对引物（表1中GST-P1、GST-E1和GST-E2引物，如SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示）对HvGST基因全长测序。序列分析发现HvGST基因较为保守，含有20个多态性位点，组成3种单倍型（图1中D）。蓝粒大麦含有两种单倍型H1和H2；白粒大麦含有H2和H3单倍型。由于蓝色糊粉层相对白粒大麦为显性性状，因此H1和H2为功能型单倍型，而H3单倍型含有上述的203 bp的缺失，因此H3为功能缺失型单倍型，203 bp缺失为导致植株表现为白粒表型的关键变异。另外，存在一些白粒大麦如ZDM04222、ZDM04235等的HvBlx基因虽然携带H2单倍型，但是4H的MbHF35基因位点突变导致白粒表型。

进一步地，鉴于紫粒大麦和蓝粒大麦的花青素色苷在化学结构上较为相似，只是花色基元的羟基数目不同，因此推测紫粒大麦同样携带显性的HvBlx基因。随后同样对30份紫粒大麦进行PCR扩增和Sanger测序，结果发现紫粒大麦同样含有两种单倍型H1和H2，其中紫粒大麦中有7份样品含有HvGST基因H1单倍型，有23份样品含有H2单倍型。表明HvGST同样参与紫粒大麦的花青素转移。

2.3 HvGST序列特征分析及进化树分析

对HvGST基因不同单倍型的cDNA全长分离（引物GST-C）和克隆进一步验证该关键变异位点。序列分析发现H1/H2和H3的开发阅读框分别包含729 bp和711 bp，编码243和237个氨基酸残基(图2中A)。正常的HvGST蛋白还有两个保守的结构域GST_N_Tau (NCBI:cd03058)和GST_C_Tau (NCBI:cd03185)结构域。GST_N_Tau结构域具有谷胱甘肽(GSH)结合位点，GST_C_Tau具有α螺旋域结构域，疏水底物占据 C 端结构域中的一个口袋，而功能缺失型单倍型在GST_C_Tau结构域的末端存在明显的差异(图2中A)。

HvGST在禾本科中同源蛋白家族的进化树分析发现，HvGST与小麦族其它成员及水稻(XP_015612997，OsGSTU34)聚成一簇，因此推断HvGST和ZmBZ2具有相同的生物学功能(图2中B)。

HvGST基因表达谱分析表达

为进一步验证候选基因HvGST基因在蓝粒大麦、紫粒大麦和白粒大麦中籽粒中授粉后的表达谱信息，随机挑选蓝粒大麦（ZDM04231）、紫粒大麦（ZDM04231）和白粒大麦（ZDM04812）三个地方品种，对授粉后15天、20天、25天和30天的种子的HvGST基因进行实时定量PCR（依照1.64中的方法）。如图4所示，研究结果发现蓝粒大麦（ZDM04231）和紫粒大麦（ZDM04231），与白粒大麦（ZDM04812）相比。在授粉后15天、20天、25天和30天，HvGST基因的表达量呈现出逐渐上升，然后下降的趋势，在授粉后20天，表达量最高。而且HvGST基因的表达水平与花青素积累呈正相关，紫粒大麦和蓝粒大麦的HvGST基因表达量在授粉后20天显著高于白粒大麦，表明HvGST基因对花青素的转运发挥重要的作用。

2.5 功能性InDel诊断标记的开发

1. 引物设计针对HvGST的三种单倍型(H1、H2和H3)，设计三条引物对三种类型进行有效区分。引物序列分别为：

2. 采用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）聚合酶进行PCR扩增。反应体系及其组成如下：

PCR反应体系为25 μL，各成分如下：

PCR反应程序为94℃预变性5分钟；94℃变性25秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒(根据扩增产物大小调整)，35个循环；72℃最终延伸5分钟。随后利用2%的琼脂糖凝胶电泳进行条带检测。

如图5结果，利用开发的功能性InDel标记（表1中的SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示引物）能够有效区分HvGST的三种单倍型，其中单倍型H3含有203 bp的缺失，当植株仅含有该缺失位点时，粒色表现为白色表型。即若仅能检测到PCR扩增产物中有且仅有第一预期大小228 bp的片段存在，则认为其模板基因组DNA的来源植株的籽粒颜色表现为白色表型，若能检测到PCR扩增产物中有第二预期大小606 bp（H1单倍型）和/或431 bp（H2单倍型）大小的片段存在，则认为其模板基因组DNA的来源植株的籽粒颜色表现为蓝色/紫色表型。图5中检测样品依次为：ZDM05722，ZDM06630，ZDM01467，ZDM06739，ZDM06815，ZDM06656，ZDM06054，ZDM06942和ZDM06964结果显示各大麦品种籽粒颜色表型依次为蓝色、白色、蓝色、蓝色、蓝色、白色、紫色、紫色和紫色，与实际一致。

试剂盒，试剂盒含有能够检测所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记的引物，即SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的引物序列。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 有色大麦籽粒花青素转运相关基因HvGST及其应用

<130> 2021

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）

<400> 1

atggcgggag gcgacaacaa ggcggaggcg ggggtgcgcg tgctgggcgg gaggatgagc 60

ccgttcacaa tgcgggcgcg catggcgctg gagctgcgcg gggtcgcgta cgagctcctg 120

gaggagagtt tcgagccccg caagagcgac cgcctcctcg ccgccaaccc cgtctacaag 180

aagatccccg tcctgctcct ccccgacggc cgcgcggtct gcgagtctgc cgtcatcgcg 240

caatacgtcg acgaggcctg gcctgcggcc gctggagccg gcggcgcgcc cttgctgccc 300

gaggacccct accagcgcgc gatgcaccgc ttctggaccg cgttcgtcga cgacaagttc 360

tggccggcgc tcgacggcgc ctccctggcg cccaccccgg aggcacgcgc cgaggccggc 420

accgaggccc gtgcggcgct gcggcacctc gaggaggcct tcgccgcgct cagcaacggt 480

gggaccttct tctccggcgc ggcgccgggg ctcctggata tcgcgctggg ttgcttcctg 540

ccggcgctca gggcctggga gcgcctcagc ggcgccgtcc tgctggacga ggctgccacg 600

ccgctcctca agaagtggag caacaggttc gcggacgtcc acgcagtcaa ggcgctccta 660

ccggagacgg acgaggttgt tggcttcaca aaattcctgc aggccaagtt cggcgtcgtg 720

ggcgcaaatt aa 732

<210> 2

<211> 2284

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）

<400> 2

aaatagcacc tggtagctct ttgggtagat ataacaactg aagatgacaa agtcaaacta 60

gtaaccagcc ttggcctttg gccttcacgt gagagagaga ttagatctcg attcctgtca 120

cctggtagct ctcgggcaca agtaccacta gcttcacgtg aacgacagca gtagcacctc 180

ctgtcgtggg gttctacagc ggcagcagca gcaaagctcc tgcggtggtg gtttgattgc 240

tctatattga tccggtcttc acgtctcgat cggaaacagc ggcagaactc ggcggatcgg 300

acgacgcggc gtacggcagc tgcagcgacg caacgtacaa cggcggaact cggcggattt 360

atacacctgg tgtactgcgg ctcggcggaa aacctgtcga actcggctcc gtaatcgatc 420

tggcttcgga tcgccagatc gcgtcggcgg cggctcacac gacgccgaac cctagctctc 480

gtctcaaatc tcgtatgggt agaacctcgg ttctgatacc acttgttaga taaaacaaga 540

tcaacgagac ataagagaca cggattttta cgtggaaacc cttgcgggag aaaaccacgg 600

acgcactaag gcgcaatcac tatgaggagg agtattacaa gcacgagacg acgggccgtc 660

tttaggtgcg actacatgga gtatatatga ggggcaatac ataagagtcc ttggaggaca 720

agtaaacgag ttgtactcgt acgcgtcggt accaacacaa aggcccacac cgtttgtact 780

acgtctagtc caatacgata gaatttgaat cacaatttaa taggagggtt ggaaaaaaat 840

ctgtgggaga aaaaaactta tgggggaagg acgtgggcgg aagggcttcc agcgatagaa 900

ggggatcgct gcaggtcgaa gcattacgac ggcatatccc ttttaatagt acagaaatat 960

aaaaatccat aaatatcaat agcgcagaag cacgtccatt ccttctagtt tcagtttcta 1020

gatgatggac caacaaaaat cctctcgtcg ccgtcatcca agcccgcatg tagacggtgg 1080

aggtagcaca agtggaagag agagggggca caaaccacca acccacgcgc gcgtactcca 1140

attagctcgc acctaactcc aattagctcg caccaacgcg cggcctggcc aagcacgtcc 1200

gtgacacacc caacagtcaa cgaatcactg accctcatgc cttggtcacc ttatataagg 1260

agtagctacc agccggctcc agagaccacc attaatcgac catggcggga ggcgacaaca 1320

aggcggaggc gggggtgcgc gtgctgggcg ggaggatgag cccgttcaca atgcgggcgc 1380

gcatggcgct ggagctgcgc ggggtcgcgt acgagctcct ggaggagagt ttcgagcccc 1440

gcaagagcga ccgcctcctc gccgccaacc ccgtctacaa gaagatcccc gtcctgctcc 1500

tccccgacgg ccgcgcggtc tgcgagtctg ccgtcatcgc gcaatacgtc gacgaggcct 1560

ggcctgcggc cgctggagcc ggcggcgcgc ccttgctgcc cgaggacccc taccagcgcg 1620

cgatgcaccg cttctggacc gcgttcgtcg acgacaagtt ctggccggcg ctcgacggcg 1680

cctccctggc gcccaccccg gaggcacgcg ccgaggccgg caccgaggcc cgtgcggcgc 1740

tgcggcacct cgaggaggcc ttcgccgcgc tcagcaacgg tgggaccttc ttctccggcg 1800

cggcgccggg gctcctggat atcgcgctgg gttgcttcct gccggcgctc agggcctggg 1860

agcgcctcag cggcgccgtc ctgctggacg aggctgccac gccgctcctc aagaagtgga 1920

gcaacaggtt cgcggacgtc cacgcagtca aggcgctcct accggagacg gacgaggttg 1980

ttggcttcac aaaattcctg caggccaagt tcggcgtcgt gggcgcaaat taatagtcag 2040

cgccgccaag tatcttactg cttatgtatg tttttttcct taaaagcata gtacaaacgc 2100

acgcgctgca ttagaggtgt gtgcatatgt atgttggtca tgtaccagta ttttcttttg 2160

attaagattt atgtggctcg ttcttttttt attctatcaa tatatatttt taacttagta 2220

cagacacact tatattaacg cacatacgca cattatattc ctatgagtac ctttaaaaga 2280

ccga 2284

<210> 3

<211> 2285

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）

<400> 3

aaatagcacc tggtagctct ttgggtagat ataacaactg aagatgacaa agtcaaacta 60

gtaaccagcc ttggcctttg gccttcacgt gagagagaga ttagatctcg attcctgtca 120

cctggtagct ctcgggcaca agtaccacta gcttcacgtg aacgacaaca gtagcacctc 180

ctgtcgtggg gttctacagc ggcagcaaca gcaaagctcc tgcggtggtg gtttgattgc 240

tctatattga tccggtcttc acgtctcgat cggaaacagt ggcagaactc ggcggatcgg 300

acgacgcggc gtacggcagc tgcagcgacg caacgtacaa cggcggaact cggcggattt 360

atacacctgg tgtactgcgg ctcggcggaa aacctgtcga actcggctcc gtaatcgatc 420

tggcttcgga tcgccagatc gcgtcggcgg cggctcacac gacgccgaac cctagctctc 480

gtctcaaatc tcgtatgggt agaacctcgg ttctgatacc acttgttaga taaaacaaga 540

tcaacgagac ataagagaca cggattttta cgtggaaacc cttgcgggag aaaaccacgg 600

acgcactaag gcacaatcac tatgaggagg agtattacaa gcacgagacg acaggtcgtc 660

tttaggtgcg actacatgga gtatatatga ggggcaatac ataagagtcc ttggaggaca 720

agtaaacgag ttgtactcgt acgcgtcggt accaacacaa aggcccacac cgtttgtact 780

acgtctagtc caatacggta gaatttggat cacaatttaa taggagggtt ggaaaaaaaa 840

tctgtggaag aaaaaaattt atgggcgaag gacgtgggcg gaagggcttc cagcgataga 900

aggggatcgc tgcaggtcga agcattacga cggcatatcc cttttaatag tatagaaata 960

taaaaatcca taaatatcaa tagcgcagaa gcacgtccat tccttctatt ttcagtttct 1020

agatgatgga ccaacaaaaa tcctctcgtc gccgtcgtcc aagccgcatg tagacggtgg 1080

aggtagcaca agtggaagag agagggggca caaaccacca acccacgcgc gcgtactcca 1140

attagctcgc acctaactcc aattagctcg caccaacgcg cggcctggcc aagcacgtcc 1200

gtgacacacc caacagtcaa cgaatcactg accctcatgc cttggtcacc ttatataagg 1260

agtagctacc agccggctcc agagaccacc attaatcgac catggcggga ggcgacaaca 1320

aggcggaggc gggggtgcgc gtgctgggcg ggaggatgag cccgttcaca atgcgggcgc 1380

gcatggcgct ggagctgcgc ggggtcgcgt acgagctcct ggaggagagt ttcgagcccc 1440

gcaagagcga ccgcctcctc gccgccaacc ccgtctacaa gaagatcccc gtcctgctcc 1500

tccccgacgg ccgcgcggtc tgcgagtctg ccgtcatcgc gcaatacgtc gacgaggcct 1560

ggcctgcggc cgctggagcc ggcggcgcgc ccttgctgcc cgaggacccc taccagcgcg 1620

cgatgcaccg cttctggacc gcgttcgtcg acgacaagtt ctggccggcg ctcgacggcg 1680

cctccctggc gcccaccccg gaggcacgcg ccgaggccgg caccgaggcc cgtgcggcgc 1740

tgcggcacct cgaggaggcc ttcgccgcgc tcagcaacgg tgggaccttc ttctccggcg 1800

cggcgccggg gctcctggat atcgcgctgg gttgcttcct gccggcgctc agggcctggg 1860

agcgcctcag cggcgccgtc ctgctggacg aggctgccac gccgctcctc aagaagtgga 1920

gcaacaggtt cgcggacgtc cacgcagtca aggcgctcct accggagacg gacgaggttg 1980

ttggcttcac aaaattcctg caggccaagt tcggcgtcgt gggcgcaaat taagagtcag 2040

cgccgccaag tatcttagtg cttatgtact ccctccgttc ctaaatataa atataagacc 2100

ttttagatat tacactatag actacatacg aagtaaaacg agtgaatcta tactttaaaa 2160

tatgtctata tacatccgta tatctttacc taataataaa gaggctatcg tttccgtcaa 2220

aaaacccacc gaggtgattt tacaaaaaaa cccttactgt ttatgacatt aaattcgtag 2280

tatat 2285

<210> 4

<211> 243

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）

<400> 4

Met Ala Gly Gly Asp Asn Lys Ala Glu Ala Gly Val Arg Val Leu Gly

1 5 10 15

Gly Arg Met Ser Pro Phe Thr Met Arg Ala Arg Met Ala Leu Glu Leu

20 25 30

Arg Gly Val Ala Tyr Glu Leu Leu Glu Glu Ser Phe Glu Pro Arg Lys

35 40 45

Ser Asp Arg Leu Leu Ala Ala Asn Pro Val Tyr Lys Lys Ile Pro Val

50 55 60

Leu Leu Leu Pro Asp Gly Arg Ala Val Cys Glu Ser Ala Val Ile Ala

65 70 75 80

Gln Tyr Val Asp Glu Ala Trp Pro Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala

85 90 95

Pro Leu Leu Pro Glu Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Met His Arg Phe Trp

100 105 110

Thr Ala Phe Val Asp Asp Lys Phe Trp Pro Ala Leu Asp Gly Ala Ser

115 120 125

Leu Ala Pro Thr Pro Glu Ala Arg Ala Glu Ala Gly Thr Glu Ala Arg

130 135 140

Ala Ala Leu Arg His Leu Glu Glu Ala Phe Ala Ala Leu Ser Asn Gly

145 150 155 160

Gly Thr Phe Phe Ser Gly Ala Ala Pro Gly Leu Leu Asp Ile Ala Leu

165 170 175

Gly Cys Phe Leu Pro Ala Leu Arg Ala Trp Glu Arg Leu Ser Gly Ala

180 185 190

Val Leu Leu Asp Glu Ala Ala Thr Pro Leu Leu Lys Lys Trp Ser Asn

195 200 205

Arg Phe Ala Asp Val His Ala Val Lys Ala Leu Leu Pro Glu Thr Asp

210 215 220

Glu Val Val Gly Phe Thr Lys Phe Leu Gln Ala Lys Phe Gly Val Val

225 230 235 240

Gly Ala Asn

<210> 5

<211> 714

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）

<400> 5

atggcgggag gcgacaacaa ggcggaggcg ggggtgcgcg tgctgggcgg gaggatgagc 60

ccgttcacaa tgcgggcgcg catggcgctg gagctgcgcg gggtcgcgta cgagctcctg 120

gaggagagtt tcgagccccg caagagcgac cgcctcctcg ccgccaaccc cgtctacaag 180

aagatccccg tcctgctcct ccccgacggc cgcgcggtct gcgagtctgc cgtcatcgcg 240

caatacgtcg acgaggcctg gcctgcggcc gctggagccg gcggcgcgcc cttgctgccc 300

gaggacccct accagcgcgc gatgcaccgc ttctggaccg cgttcgtcga cgacaagttc 360

tggccggcgc tcgacggcgc ctccctggcg cccaccccgg aggcacgcgc cgaggccggc 420

accgaggccc gtgcggcgct gcggcacctc gaggaggcct tcgccgcgct cagcaacggt 480

gggaccttct tctccggcgc ggcgccgggg ctcctggata tcgcgctggg ttgcttcctg 540

ccggcgctca gggcctggga gcgcctcagc ggcgccgtcc tgctggacga ggctgccacg 600

ccgctcctca agaagtggag caacaggttc gcggacgtcc acgcagtcaa ggcgctccta 660

ccggagacgg acgaggttct ttttttattc tatcaatata tatttttaac ttag 714

<210> 6

<211> 2081

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）

<400> 6

aaatagcacc tggtagctct ttgggtagat ataacaactg aagatgacaa agtcaaacta 60

gtaaccagcc ttggcctttg gccttcacgt gagagagaga ttagatctcg attcctgtca 120

cctggtagct ctcgggcaca agtaccacta gcttcacgtg aacgacagca gtagcacctc 180

ctgtcgtggg gttctacagc ggcagcagca gcaaaactcc tgcggtggtg gtttgattgc 240

tctatattga tccggtcttc acgtctcgat cggaaacagc ggcagaactc ggcggatcgg 300

acgacgcggc gtacggcagc tgcagcgacg caacgtacaa cggcggaact cggcggattt 360

atacacctgg tgtactgcgg ctcggtggaa aacctgtcga actcggctcc gtaatcgatc 420

tggcttcgga tcgccagatc gcgtcggcgg cggctcacac gacgccgaac cctagctctc 480

gtctcaaatc tcgtatgggt agaacctcgg ttctgatacc acttgttaga taaaacaaga 540

tcaacgagac ataagagaca cggattttta cgtggaaacc cttgcgggag aaaaccacgg 600

acgcactaag gcgcaatcac tatgaggagg agtattacaa gcacgagacg acggaccgtc 660

tttaggtgcg actacatgga gtatatatga ggggcaatac ataagagtcc ttggaggaca 720

agtaaacgag ttgtactcgt acgcgtcggt accaacacaa aggcccacac cgtttgtact 780

acgtctagtc caatacggta gaatttggat cacaatttaa taggagggtt ggaaaaaaat 840

ctgtgggaga aaaaaaatta tgagggaagg acgtgggcgg aagggcttcc agcgatagaa 900

ggggatcgct gcaggtcgaa gcattacgac ggcatatccc ttttaatagt acagaaatat 960

aaaaatccat aaatatcaat agcgcagaag cacgtccatt ccttctagtt tcagtttcta 1020

gatgatggac caacaaaaat cctctcgtcg ccgtcatcca agcccgcatg tagacggtgg 1080

aggtagcaca agtggaagag agagggggca caaaccacca acccacgcgc gcgtactcca 1140

attagctcgc acctaactcc aattagctcg caccaacgcg cggcctggcc aagcacgtcc 1200

gtgacacacc caacagtcaa cgaatcactg accctcatgc cttggtcacc ttatataagg 1260

agtagctacc agccggctcc agagaccacc attaatcgac catggcggga ggcgacaaca 1320

aggcggaggc gggggtgcgc gtgctgggcg ggaggatgag cccgttcaca atgcgggcgc 1380

gcatggcgct ggagctgcgc ggggtcgcgt acgagctcct ggaggagagt ttcgagcccc 1440

gcaagagcga ccgcctcctc gccgccaacc ccgtctacaa gaagatcccc gtcctgctcc 1500

tccccgacgg ccgcgcggtc tgcgagtctg ccgtcatcgc gcaatacgtc gacgaggcct 1560

ggcctgcggc cgctggagcc ggcggcgcgc ccttgctgcc cgaggacccc taccagcgcg 1620

cgatgcaccg cttctggacc gcgttcgtcg acgacaagtt ctggccggcg ctcgacggcg 1680

cctccctggc gcccaccccg gaggcacgcg ccgaggccgg caccgaggcc cgtgcggcgc 1740

tgcggcacct cgaggaggcc ttcgccgcgc tcagcaacgg tgggaccttc ttctccggcg 1800

cggcgccggg gctcctggat atcgcgctgg gttgcttcct gccggcgctc agggcctggg 1860

agcgcctcag cggcgccgtc ctgctggacg aggctgccac gccgctcctc aagaagtgga 1920

gcaacaggtt cgcggacgtc cacgcagtca aggcgctcct accggagacg gacgaggttc 1980

tttttttatt ctatcaatat atatttttaa cttagtacgg acacacttat attaacgcac 2040

atacgcacat tatattccta tgagtacctt taaaagaccg a 2081

<210> 7

<211> 237

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）

<400> 7

Met Ala Gly Gly Asp Asn Lys Ala Glu Ala Gly Val Arg Val Leu Gly

1 5 10 15

Gly Arg Met Ser Pro Phe Thr Met Arg Ala Arg Met Ala Leu Glu Leu

20 25 30

Arg Gly Val Ala Tyr Glu Leu Leu Glu Glu Ser Phe Glu Pro Arg Lys

35 40 45

Ser Asp Arg Leu Leu Ala Ala Asn Pro Val Tyr Lys Lys Ile Pro Val

50 55 60

Leu Leu Leu Pro Asp Gly Arg Ala Val Cys Glu Ser Ala Val Ile Ala

65 70 75 80

Gln Tyr Val Asp Glu Ala Trp Pro Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala

85 90 95

Pro Leu Leu Pro Glu Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Met His Arg Phe Trp

100 105 110

Thr Ala Phe Val Asp Asp Lys Phe Trp Pro Ala Leu Asp Gly Ala Ser

115 120 125

Leu Ala Pro Thr Pro Glu Ala Arg Ala Glu Ala Gly Thr Glu Ala Arg

130 135 140

Ala Ala Leu Arg His Leu Glu Glu Ala Phe Ala Ala Leu Ser Asn Gly

145 150 155 160

Gly Thr Phe Phe Ser Gly Ala Ala Pro Gly Leu Leu Asp Ile Ala Leu

165 170 175

Gly Cys Phe Leu Pro Ala Leu Arg Ala Trp Glu Arg Leu Ser Gly Ala

180 185 190

Val Leu Leu Asp Glu Ala Ala Thr Pro Leu Leu Lys Lys Trp Ser Asn

195 200 205

Arg Phe Ala Asp Val His Ala Val Lys Ala Leu Leu Pro Glu Thr Asp

210 215 220

Glu Val Leu Phe Leu Phe Tyr Gln Tyr Ile Phe Leu Thr

225 230 235

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T4 DNA连接酶双端添加标签寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

acacgacgct cttccgatct nnnnnncatg 30

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 通用接头序列

<400> 9

gatcagatcg gaagagcggt t*c 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 包含2 bp的选择性引物

<400> 10

gaaccgctct tccgatctga tc*t*g 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 通用扩增引物

<400> 11

acacgacgct cttccgatct 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子区扩增（H1、H2和H3单倍型）上游引物

<400> 12

cggcagaaaa ttcttgatag c 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子区扩增（H1、H2和H3单倍型）下游引物

<400> 13

gatgacggca gactcgcag 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码区扩增(H1单倍型)上游引物

<400> 14

ctggaggaga gtttcgagcc 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码区扩增(H1单倍型)下游引物

<400> 15

ggatgagtac cggtatgaaa ga 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码区扩增(H2和H3单倍型)上游引物

<400> 16

ggatgagccc gttcacaatg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码区扩增(H2和H3单倍型)下游引物

<400> 17

cgagatgcct gcgatgattt 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDS 扩增上游引物

<400> 18

atggcgggag gcgacaac 18

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDS 扩增上游引物

<400> 19

ttaatttgcg cccacgacg 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实时定量PCR检测上游引物

<400> 20

ctgggttgct tcctgccg 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 实时定量PCR检测下游引物

<400> 21

cgccttgact gcgtggac 18

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实时定量PCR的内参基因上游引物

<400> 22

caggtatcgc tgaccgtatg ag 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实时定量PCR的内参基因下游引物

<400> 23

tggaaagtgc tgagtgaggc ta 22

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 功能性InDel标记的上游引物

<400> 24

cgccgctcct caagaagtg 19

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 功能性InDel标记中H1诊断的下游引物

<400> 25

cgtgttcatc cccgaccc 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 功能性InDel标记中H2和H3诊断的下游引物

<400> 26

ccgagatgcc tgcgatga 18

Claims

1.大麦籽粒花青素转运相关基因自然变异突变体，其特征在于，所述自然变异突变体为如下（e）、（f）或（g）的基因：

（e）其碱基序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列末端203 bp碱基缺少导致移码突变的碱基序列，如SEQ ID NO:5所示，

（f）其碱基序列如SEQ ID NO:6所示，

（g）其编码如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记的扩增引物包含两对引物对，分别为：

如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的一对引物对，和，

如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26所示的一对引物对。

3.鉴定大麦籽粒颜色的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取待鉴定大麦植株的基因组DNA；

2）以步骤1）中的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的一对引物对和如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26所示的一对引物对分别或同时进行PCR扩增；

3）将步骤2）中得到的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行条带检测，若仅能检测到PCR扩增产物中有且仅有符合第一预期大小的片段存在，则认为其模板基因组DNA的来源植株的籽粒颜色表现为白色表型，若能检测到PCR扩增产物中有符合第二预期大小的片段存在，则认为其模板基因组DNA的来源植株的籽粒颜色表现为蓝色或紫色表型。

4.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求2所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记的扩增引物。

5.如权利要求1所述的有色大麦籽粒花青素转运相关基因自然变异突变体在针对候选基因关键变异开发籽粒颜色相关诊断标记、大麦辅助选择育种或制备大麦辅助选择育种试剂盒中的应用。

6.如权利要求2所述的与大麦籽粒颜色相关基因关联的功能性InDel分子标记的扩增引物在大麦辅助选择育种或试剂盒制备中的应用。