CN107418957A - 控制水稻耐冷基因cold2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种控制水稻耐冷基因COLD2的分离克隆、功能验证，及其在水稻耐冷性育种中的应用。具体而言，本发明公开了一种控制水稻耐冷基因COLD2(即，调控粳稻品种日本晴耐冷基因COLD2)，该基因编码区的不同突变导致水稻耐冷能力降低。本发明还提供了上述水稻耐冷基因在水稻耐冷育种中的应用。

Description

控制水稻耐冷基因COLD2及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制水稻耐冷基因COLD2的分离克隆、功能验证，及其在水稻耐冷性育种中的应用。
背景技术
水稻作为常见的一种粮食作物，含有除赖氨酸之外的人类所需的所有氨基酸，哺育着全球近半数的人口，其中很大一部分是在亚洲、非洲和南美。低温会影响细胞膜的稳定、影响植物体内激素的平衡、使植物体内碳水化合物发生变化以及影响植物体内的信号转导等，低温也会影响叶绿素含量和荧光信号，因此会干扰植物的光合作用。此外，低温会使植物体内超氧化物歧化酶(ROS)和丙二醛(MDA)的积累而导致细胞氧化损害代谢机制受损。水稻从种子发芽到成熟的各个阶段都有可能发生不同程度的低温冷害。根据水稻生长阶段可把水稻冷害阶段主要分为芽期冷害、苗期冷害以及生殖生长期冷害三个方面。在芽期发生冷害会导致种子出芽时间延长或烂秧，在苗期发生冷害会造成秧苗失绿、发僵、分蘖减少、枯萎等现象发生，严重时会发生死苗，对这一时期水稻的耐冷性评价标准主要是苗期耐冷处理的存活率[1]。水稻生殖生长期包括了育穗期、抽穗扬花期、灌浆期和成熟期。在孕穗期和抽穗扬花期发生冷害易发生花药发育不完全，造成水稻减产，常以结实率和空壳率为评价指标。在灌浆期和成熟期发生冷害会影响叶片的正常的光合作用以及光合产物的正常运输，甚至对籽粒的充实度和品质都有影响，可能会使籽粒糙米率、粒宽等指标减低，最终千粒重也会随之下降[2]。因此，水稻生长后期的冷害直接影响到水稻的产量，育种学家迫切需要运用分子育种方法培育出增强耐冷性的品种。挖掘耐冷关键基因，通过分子育种技术改良水稻耐冷性是科学家近年来研究的热点[3]。水稻的耐冷性是由许多数量性状位点(QTLs)控制的，在水稻的12条染色体中，有250多个QTLs被研究者们发现对于耐冷具有重要作用，然而只有少数QTLs被克隆到[4]。已克隆到在芽期耐冷性发挥功能的QTLs只有qLTG3-1，在苗期耐冷的有qCTS12、qCTS4、qCtss11、qRC10-2、qSCT1和qSCT11、qLOP2和qPSR2-1，与生殖生长期耐冷相关的有Ctb1、qCT8、qCTB7、qLTB3、qCT-3-2和CTB4a。除了相关的QTLs之外，近年来与耐冷相关的其他基因也被相继克隆，转录因子是植物调控耐冷的关键因子，与耐冷相关的转录因子基因家族有AP2/ERF(APE-TALA2/ethylene-responsivefactor)家族、CBF(Calmodulin-binding transcription activator)家族、MYB(v-mybavian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族、bZIP(basic region/leucinezipper)家族和NAC(NAM，ATAF1,ATAF2，CUC2)家族。近期发现水稻低温感受器COLD1，COLD1不仅在水稻苗期耐寒性起着重要的作用，特别重要的是COLD1在成熟期耐寒性也有着必不可少的作用[5]。
冷害对植物生长发育的主要影响之一就是植物叶绿体出现了发育功能受损，导致植物中叶绿素含量发生改变。因此，叶绿素含量可用来评估植物耐冷性程度，同时可以用来比较植物冷胁迫后的恢复率。最新研究报道通过筛选拟南芥突变体冷敏感突变体发现有49个基因涉及到冷胁迫响应，有意思的是在这些基因中有16个基因定位于叶绿体中，这也进一步说明叶绿体的功能在冷害中发挥着重要的作用[6]。植物叶绿体的形成是一个复杂的过程，先前的研究报道了叶绿体的形成与核基因紧密相关。这些基因参与的过程有：RNA加工和编辑、蛋白质的翻译和折叠和质体类异戊二烯的生物合成[7]。其中有部分基因属于PPR蛋白家族，PPR(pentatricopeptide repeat)是一种三角状五肽重复结构域，典型的PPR蛋白包含2～27个串联重复的含有35个氨基酸残基的PPR结构域，具有该结构域的蛋白质家族是植物最大的蛋白家族之一[8]。PPR蛋白在植物细胞器的基因表达的各个阶段中具有重要的生理功能，其中一点便是RNA的编辑[9]。RNA编辑是发生在转录后水平上的一种基因表达调控现象，mRNA上发生核苷酸的插入、缺失和替换，从而使遗传信息发生改变。在植物中，RNA编辑的类型主要是核苷酸的替换。大部分是胞嘧啶(Cytosine，C)被尿嘧啶(Uracil，U)替换，常见于高等植物叶绿体和线粒体。少见有尿嘧啶被胞嘧啶替换，后者在金鱼藻质体中有发现。RNA编辑需要特定的顺式作用元件，这一点在线粒体和叶绿体中是通用的。顺式作用元件的位置通常在编辑位点上游的20个核苷酸和下游的10个核苷酸这个范围内。这些顺式作用元件可能是相应的反式作用因子的结合位点，从而促进最终参与RNA编辑的酶结合上去[10]。因此，编辑的不足或者缺陷可能会导致编码的蛋白质部分或者全部失去功能，从而导致植物的生长发育出现严峻的后果。参与叶绿体RNA编辑的大量蛋白质属于核基因编码的PPR蛋白家族[11]。CRR4是第一个被证实参与RNA编辑的PPR蛋白，该蛋白属于E+亚群，研究发现该蛋白参与拟南芥叶绿体ndhD起始密码子的编辑，将转录本中的ACG转变为起始密码子AUG，并能与ndhD转录本结合从而发生编辑[12]。Okuda等[13]发现DYW亚群的PPR蛋白CRR22和CRR28能同时对ndhB和ndhD进行编辑。此外，Gong等[14]发现一个新颖的叶绿体定向PPR蛋白OsV4，OsV4在冷胁迫下对水稻的叶绿体发育有着重要的作用，但该基因是如何控制叶绿体发育的机制还需进一步的研究。纵观RNA的编辑能控制叶绿体的发育，但对RNA编辑是如何控制叶绿体的发育以及是否控制耐冷性作用机制还需进一步的深入探讨。
水稻(Oryza sativa)是最重要的粮食作物之一，是全球近一半人口赖以生存的基本食粮，在我国有很大的种植面积，本发明克隆的粳稻日本晴中的COLD2基因及其编码的蛋白在培育耐低温水稻品种具有重要的生产应用价值。
所涉及的参考文献如下：
1.Lou Q,Chen L,Sun Z,et al.A major QTL associated with cold toleranceat seedling stage in rice(Oryza sativa L.).Euphytica,2007,158(1-2):87-94(LouQ,Chen L,Sun Z,等.一个在水稻苗期与耐冷性相关的主要QTL.荷兰植物育种杂志.2007,158(1-2):87-94)；
2.Suh J,Jeung J,Lee J,et al.Identification and analysis of QTLscontrolling cold tolerance at the reproductive stage and validation ofeffective QTLs in cold-tolerant genotypes of rice(Oryza sativa L.).Theor ApplGenet,2010,120(5):985-995(Suh J,Jeung J,Lee J,等.水稻生殖期控制耐冷性QTL的鉴定及分析和验证在耐冷性的基因型的有效QTLs.理论和应用遗传学杂志.2010,120(5):985-995)；
3.Mizoi J,Yamaguchi-Shinozaki K.Molecular approaches to improve riceabiotic stress tolerance,Methods Mol Biol,2013,956:269-283(Mizoi J和Yamaguchi-Shinozaki K.提高水稻非生物胁迫耐受性的分子方法.分子生物学方法.2013,956:269-283)；
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13.Okuda K,Chateigner-Boutin AL,Nakamura T,et al.Pentatricopeptiderepeat proteinswith the DYW motif have distinct molecular functions in RNAediting and RNA cleavage inarabidopsis chloroplasts.Plant Cell,2009,21:146-156(Okuda K,Chateigner-Boutin AL,Nakamura T,等.具有DYW基序的三角状五肽重复蛋白在拟南芥叶绿体中的RNA编辑和RNA切割中具有不同的分子功能.植物细胞.2009,21:146-156)；
14.Gong X,Su Q,Lin D,et al.The rice OsV4encoding a novelpentatricopeptide repeatprotein is required for chloroplast developmentduring the early leaf stage under cold stress.J IntegrPlant Biol,2014,56(4):400-410(Gong X,Su Q,Lin D,等.水稻OsV4基因编辑了一个新颖的三角状五肽重复蛋白，是在冷胁迫下的早期叶绿体发育所必需的.植物生物学综合杂志.2014,56(4):400-410)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种控制水稻耐冷基因COLD2(即，调控粳稻品种日本晴耐冷基因COLD2)，该基因编码区的不同突变导致水稻耐冷能力降低。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种控制水稻耐冷基因COLD2(即，调控粳稻品种日本晴耐冷基因COLD2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1末尾的3个序列代表终止子。
本发明还提供了上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了含有上述基因的重组载体、含有上述基因的质粒，以及含有所述基因或所述载体的工程菌或宿主细胞。
所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的工程菌或宿主细胞。但随着科技发展，所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化，或在非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和工程菌的利用，但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围之内。
进一步地，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有基因序列，该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明还提供了常规籼稻品种9311、dular对应的COLD2基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述常规籼稻品种9311、dular对应的COLD2基因编码的蛋白质，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
本发明还同时提供了上述基因、重组载体、转化体的用途：用于水稻耐冷育种。即，用于构建转基因水稻，所述转基因水稻耐冷性得以增强。
本发明的另一个目的在于提供一种水稻耐冷基因在水稻耐冷育种中的应用。通过SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。转化可采用农杆菌介导法或基因枪法。
转基因水稻的制备为本领域常规技术手段，本发明不另作限定，利用本发明所述基因进行水稻转基因的技术方案均在本发明的保护范围之内。
实现本发明的具体技术步骤如下：
一、水稻耐冷基因COLD2的鉴定和定位
本发明是通过19℃低温处理粳稻品种日本晴NIP和籼稻品种9311、dular幼苗后，发现日本晴NIP相对于籼稻品种9311、dular表现更耐冷。
为了分离COLD2基因，本发明首先构建了一个定位群体，由NIP与籼稻品种dular杂交组配成F2定位群体，再通过图位克隆的方法，利用SSR分子标记对COLD2位点进行初步定位，将其初步定位在第9染色体上，并介于M1与M8标记之间。通过对这两个标记之间的序列进行分析，发展新的多态性标记将COLD2基因精确定位到ID标记ID1与ID2之间约56kb的区域内，通过测序比对分析发现与NIP相比，9311的LOC_Os09g29825基因的编码区发生了三个不同位置的单碱基替换，导致编码的氨基酸发生了改变，dular在该基因的CDS序列的60-67bp位置发生8bp的碱基缺失而导致移码突变。预示该基因为COLD2的候选基因。
二、COLD2基因的鉴定与功能分析
利用pCAMBIA1300质粒构建COLD2互补载体。构建步骤：PCR扩增NIP中COLD2基因的5’-UTR 1880bp至3’-UTR 831bp的共4.4-kb基因组DNA片段，将该片段连接到pCAMBIA1300载体上获得pCAMBIA1300-COLD2互补载体。
通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使dular增强了耐冷性的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了COLD2基因，明确了日本晴中COLD2基因的CDS序列(SEQ ID No：1)，氨基酸序列分析表明COLD2基因编码PPR蛋白(SEQ ID No：4)。
综上所述，本发明分离并克隆鉴定了控制粳稻日本晴的耐冷基因COLD2，并通过互补实验进行基因功能验证。在籼稻中，COLD2在编码区的不同变化会导致耐冷性降低，造成低温敏感性反应。图位克隆的结果表明，该基因编码了一个DYW亚群的PPR蛋白。本发明为改良、增强水稻耐冷性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是NIP、9311、dular分别于28℃、19℃及8℃处理下的耐冷表型。
A：NIP、9311、dular在不同温度处理下的表型，上部为28℃处理后的表型，下部为19℃处理后的表型；
B：NIP、9311、dular在8℃处理7d后在28℃恢复7d的表型，上部为8℃处理后的表型，下部为28℃恢复7d后的表型；
C：NIP、9311、dular分别于28℃、19℃及8℃处理后的叶绿素含量；
D：NIP、9311、dular在8℃处理7d后在28℃恢复7d后的存活率。
图2是COLD2基因的定位。
A：COLD2的精细定位，利用NIP/dular的F2分离群体的845株冷敏感单株，将COLD2定位于ID1和ID2标记之间；
B：COLD2界定在56kb区域；
C：COLD2基因的结构示意图，通过对该区域的NIP和9311亲本基因组DNA序列测序比对分析，结果发现在基因COLD2(LOC_Os09g29825)的外显子上发生了三个不同位置的单碱基替换，导致编码的氨基酸发生了改变。dular在该基因的CDS序列的60-67bp位置发生8bp的碱基缺失而导致移码突变。
图3是dular互补苗分别于28℃、19℃及8℃处理下的耐冷表型。
A：NIP、dular和dular互补苗N60在不同温度处理下的表型，上部为28℃处理后的表型，下部为19℃处理后的表型；
B：NIP、dular、N60在8℃处理7d后在28℃恢复7d的表型，上部为8℃处理后的表型，下部为28℃恢复7d后的表型；
C：NIP、dular、N60分别于28℃、19℃及8℃处理后的叶绿素含量；
D：枯苗率的统计。
图4是COLD2的功能分析。
A：COLD2基因的结构分析；
B：NIP和dular在28℃和19℃的rps8RNA编辑差异碱基；
C：NIP、9311、dular在不同温度处理下rps8RNA的编辑程度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中的若未特别说明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、粳稻日本晴耐冷性的发现：
首先分析了不同水稻品种的耐冷性。其中发现低温处理粳稻品种NIP和籼稻品种9311及dular出现了完全不相同的耐冷性，19℃低温冷处理后发现NIP叶片仍能保持绿色，而9311和dular呈现严重失绿不耐冷表型(图1A)。冷处理前经过差异性统计分析发现叶绿素含量没有显著性差别，在冷处理后9311和dular叶片中的叶绿素含量明显比NIP中的低(图1C)。另外，在更低温度(8℃)处理7d后然后在28℃恢复7d后发现NIP绝大部分仍能存活，9311部分能存活，dular绝大部分死亡(图1B和D)。这些结果表明粳稻品种NIP比籼稻品种9311及dular表现出更耐冷，dular对冷表现出更为敏感。
备注：上述19℃处理时间均为35天。
实施例2、COLD2的精细定位
将粳稻日本晴NIP与籼稻dular进行杂交配组，F1植株均表现耐冷性，说明COLD2基因受隐性核基因控制。将F1自交得F2。统计F2分离群体分离比(表1)，结果表明，耐冷性植株和冷敏感植株的分离比经过卡方检验接近3:1分离，这表明COLD2基因是由一对单隐性核基因控制。
表1、耐冷基因COLD2的遗传分析
利用本实验室保存的均匀分布于水稻12条染色体的262对SSR引物对NIP与dular进行多态性筛选，筛选到180对SSR引物具有多态性。然后挑选21个dular/NIP中F2低温处理后不耐冷表型单株进行连锁分析，初步确认目标基因所在的染色体位置。基因组DNA采用CTAB法提取。具体步骤如下：
①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入600μl的CTAB溶液(2％(m/V)CTAB，100mmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl；pH8.0)配制的DNA提取缓冲液，65℃水浴40分钟。再加600μl的氯仿:异戊醇(24:1的体积比)，并混匀。10,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷(至4℃)的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13,000rpm离心8分钟，倒出上清液。
③、再用70％(体积浓度)的已醇200μl洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。
④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100μl TE缓冲液或纯水中。
⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获得完整的DNA。
PCR反应体系采用10μL体系：DNA模板1μL，10×PCR缓冲液1μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，dNTPs 1μL，rTaq酶0.2μL，加ddH2O补足10μL。PCR扩增程序如下：94℃下预变性4min；94℃下变性30s，55℃～60℃下退火30s(温度因引物不同而异)，72℃下延伸30s，40个循环；最后72℃下延伸10min。PCR产物用4％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪拍照并读胶。利用上述筛选的180对SSR引物进行COLD2基因连锁分析发现在第9号染色体的SSR标记RM334处表现出连锁现象。在连锁标记上下游设计新的Indel标记，用这21个单株将目的基因区间锁定在分子标记M1与M8之间。在此区间再次设计新的分子标记，扩大群体，用845个F2冷敏感单株最终将该基因定位在ID1和ID2之间大约56kb的区间内。根据水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据信息，这个区间包含了10个预测基因或者开放阅读框(图2)。通过对该区域的NIP和9311亲本基因组DNA序列测序比对分析，结果发现在基因LOC_Os09g29825的外显子上发生了三个不同位置的单碱基替换，导致编码的氨基酸发生了改变(图2C)。同时，我们对dular进行COLD2基因测序，结果发现dular在该基因的CDS序列的60-67bp位置发生8bp的碱基缺失而导致移码突变(图2C)。另外，我们通过对耐冷单株进行耐冷性QTL分析结果同样检测到COLD2位点。引物序列见表2。
表2、精细定位所用分子标记
最终获得：调控粳稻品种日本晴耐冷基因COLD2(控制日本晴耐冷性基因COLD2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例3、植物转化
扩增日本晴中COLD2基因的5’-UTR 1880bp至3’-UTR 831bp的共4.4-kb基因组DNA片段。引物序列为：
F：GAATTCTGACATGTGGATCATGAACGTCACGAATCC
R：GGATCCCTTCATGTCTCATTCAACATCAACAACAGG
PCR反应体系采用50μL体系，按照高保真聚合酶KOD FX(Toyobo公司)的说明书配置PCR反应体系，具体体系为：DNA模板1μL，2×PCR buffer 25μL，正反向引物(10μmol/L)各1.5μL，2mM dNTPs 10μL，KOD FX酶1μL，加ddH2O补足50μL；
PCR扩增程序如下：94℃下预变性2min；98℃下变性10s，58℃下退火10s，68℃下延伸4min，35个循环；最后68℃下延伸10min；
所得的4.4-kb基因组DNA片段中含有SEQ ID NO：1所示序列。
然后连入pEASY-Blunt Cloning Vector(TransGen Biotech公司)中，之后再连入到pCAMBIA1300载体中。
这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用dular成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体(pCAMBIA1300-COLD2)的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右(光照强度为13200LX，温度为32℃)。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下(光照强度为13200LX，温度为32℃)培养一个月左右得到抗性转基因植株。对所得的互补苗N60进行冷鉴定，19℃冷处理后发现N60的叶绿素含量明显高于转基因受体亲本dular；8℃冷处理后互补苗N60的存活率显著提高(图3)。
备注说明：上文中提及的各项培养基(诱导培养基、筛选培养基、分化培养基)均为常规培养基。
上述叶绿素含量测定的步骤如下：剪取幼苗叶片0.04g，剪成均匀大小的碎片，天平称重之后放入10ml离心管中，迅速加入乙醇丙酮混合液(丙酮：无水乙醇：ddH20(v/v)＝19:10:1)4ml。每个样三次重复，然后放置于26℃的黑暗条件下浸泡24h。DU640分光光度计分别测量663nm(叶绿素a的最大吸收峰)、645nm(叶绿素b的最大吸收)和470nm(类胡萝卜素的最大吸收峰)三个波长下样品的光密度值(Optical Density value，OD)，叶绿素a和叶绿素b的计算方法具体如下：
Chl a＝(12.7×OD663-2.69×OD645)×0.004L/0.04g，
Chl b＝(22.9×OD645-4.68×OD663)×0.004L/0.04g，
Chl(a+b)＝Chl a+Chl b，
单位：mg/g。
实施例4、COLD2基因的分析和功能分析
COLD2在公开的数据库中(如NCBI)被注释为PPR蛋白。序列分析发现COLD2仅仅只有一个外显子，根据NCBI对该蛋白保守结构域的分析结果(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，该基因的蛋白序列中有3个PPR重复基序，C端序列预测有DYW亚群的类似脱氨酶功能的结构域，可知COLD2蛋白属于PPR家族中的DYW亚群(图4A)。根据在不同植物中和早期的苔藓植物中的DYW序列的分析表明这些结构域与RNA的编辑高度相关，进一步的遗传学证据表明了DYW亚群与RNA编辑事件是同时发生的。直到现在，植物RNA编辑的反式作用因子仅仅只发现了DYW1，MORF，和PPR蛋白，并且大多数的PPR蛋白是属于DYW亚群。因此，我们猜测COLD2蛋白的作用极有可能是参与水稻叶绿体RNA的编辑过程。接着我们利用14对水稻叶绿体RNA编辑检测引物对NIP和dular在28℃和19℃两种不同的温度处理的情况下的叶绿体中23个RNA编辑位点的编辑情况进行检测，若植株叶绿体中的RNA编辑位点得到了正常编辑，则mRNA在编辑位点的核苷酸序列应该由胞嘧啶核糖核苷酸“C”转变为尿嘧啶核糖核苷酸“U”，经过反转录并扩增测序之后，该位点的测序结果应该为胸腺嘧啶“T”。同样的，若该编辑位点的编辑状态为部分编辑，测序的结果应同时有“T”和“C”的峰，若该编辑位点未发生编辑，则测序结果应为“C”峰。在本试验中，不同的温度处理之下，NIP和dular在大部分的RNA编辑位点的编辑情况为编辑或部分编辑的状态(图4B)，但在rps8这个编辑位点上，NIP在28℃处理下呈现部分编辑的状态(同时存在“T”和“C”峰)，在19℃时甚至呈现出编辑程度上升的趋势(“C”峰消失)，但在dular中，28℃对照和19℃冷处理的情况下，测序结果均为未编辑转态，既只呈现“C”峰。表明，dular无法对rps8的RNA编辑位点进行编辑，dular和NIP在rps8的编辑上存在差异。同时对编辑程度进行统计，结果显示(图4C)，NIP在28℃时的编辑状态为部分编辑，编辑程度为58.3％，在8℃冷处理时，编辑程度明显上升，达到95.3％；9311的编辑程度在28℃与NIP相比没有明显的差异，然而在8℃冷处理后其编辑程度只有31.4％，显著低于NIP。而对dular的编辑程度量化结果显示，无论在28℃还是8℃，dular的编辑程度都为0％，这说明，dular品种确实缺乏对rps8的编辑。这些结果表明COLD2能调控冷胁迫下的叶绿体编辑位点rps8的编辑程度。
实施例5、耐冷基因COLD2在水稻耐冷育种中的应用
在生产实践中，可将上述基因转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。通过该转基因方法，利用植物表达载体转化植物细胞以培育耐冷性水稻，进而可以改善水稻的耐冷性。
在生产实践中，还可将上述基因通过分子标记辅助选择育种方法来增强水稻的耐冷性。如以冷敏感性籼稻品种作为轮回亲本，耐冷性强的粳稻品种日本晴作为耐冷基因COLD2的供体，构建以籼稻品种为遗传背景的单染色体片段代换系。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 控制水稻耐冷基因COLD2及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1758
<212> DNA
<213> 日本晴NIP (Oryza sativa)
<400> 1
atgcctcctc ccaccgtccc cttcttcctc acctccacca cgctcgccgc tgcggccgcg 60
aagccgcagc ggcccgggcc gccctcgcca ccggcgcaga agcagcagcc gcgcgaggcg 120
cgggatggtt ctcgggacgc gtgcgcgtcg tacaccgcgc gcatgcggct caacccgcag 180
ctcgcgctcc gcctgttcga ccacctgctc cgctcgggcg ccgacccgga ccacgtggcg 240
tacgccctcg cgctgggccg ctgcgcgcgc gggcgggacc gccgcgccgc cgcgcagctc 300
cacgcgcacg ccgctaagcg aggggccgcg tcccaccgtc gcgtctgcaa cgggctcatc 360
cacgcgtacg ccgtctgcgg gtcgctgctc gacgcgcgca aggtgttcga ccgcgggcac 420
gagggtgacg cggtggcatg gaactccctg ctgcgcgggt acgcggctgc tggggacgtg 480
aacgcgctcc gggagttctt cgtggggatg caagcccggg acacggtttc gtggaacacg 540
atcatcgcgt ggtgtgttga gaatggggaa tatgaggagg caattgcggt gttccgtgag 600
atgctggcaa gcatggagtg tcttcctgat agagtcacac tggtgagcgt catctcagcg 660
attacatatt tgggtgcact agcccagggg ctgtgggcgc atgcatatgt ttgcaggaaa 720
ggtatcgaag tcgaggagag gctgagctca gctctcataa acatgtattc aaagtgcggt 780
tgcattgaag gtgcagttca tgtgtttgaa aatctgggtg cacagatgaa tgtggacaca 840
tggaacgcta tgttagctgg cttcacagca aatggatgca gtgagaaagc tctggagctt 900
ttcgctagga tggagataac aggtttggtg cctaacaaga ttactttcaa cactgtgctg 960
aatgcttgta gtcatggtgg ttttgttgag gaaggtatgg ggtgtttcga gagaatgacc 1020
aaggtttatg gtattgagcc tgacattgcc cactatggtt gcatggtgga tctgttctgt 1080
cgtgcagggc tttttgacaa ggctgaaaag atgatccaaa tgatgcctat gaaaccagat 1140
gctgctgtgt ggaaggccct agtgggtgct tgtaaaactc acaggaactt tgaactggga 1200
aggaaagcag gccatatgct tattgaggct gcaccaaatg atcacgcagg gtatgtgctg 1260
ctatccaaca tatatgcact agatggaaac tggacaggag tgcataaggt gaggaagctg 1320
atgcttgatc gtggtgtgca gaaggtacct ggaagcagct caatagaaat tgatggtgta 1380
attcatgagt tcatatctgg ggataaaagc cattcaagca aggaggacat atacgagatg 1440
ctaagtgaaa tgtgtcagca attgaaagtt gcaggatatg ttccagatac ttcacatgtg 1500
ctactagata ttgatgatga ggatgtgaag gagagctcac tagctcttca cagcgagaag 1560
cttgcaattg cctttggatt gataagcact gcaccaggca cgcctattag gatagcaaag 1620
aacctccggg tttgtggaga ttgtcataat gccgttaaac ttctaagcaa gatttatggg 1680
aggtgcataa ttgttaggga tgcaaatcga tttcatcatt tcagagaagg atcatgctct 1740
tgcggggatt tctggtaa 1758
<210> 2
<211> 1758
<212> DNA
<213> 9311 (Oryza sativa)
<400> 2
atgcctcctc ccaccgtccc cttcttcctc acctccacca cgctcgccgc tgcggccgcg 60
aagccgcagc ggcccgggcc gccctcgcca ccggcgcagc agcagcagcc gcgcgaggcg 120
cgggatggtt ctcgggacgc gtgcgcgtcg tacaccgcgc gcatgcggct caacccgcag 180
ctcgcgctcc gcctgttcga ccacctgctc cgctcgggcg ccgacccgga ccacgtggcg 240
tacgccctcg cgctgggccg ctgcgcgcgc gggcgggacc accgcgccgc cgcgcagctc 300
cactcgcacg ccgctaagcg aggggccgcg tcccaccgtc gcgtctgcaa cgggctcatc 360
cacgcgtacg ccgtctgcgg gtcgctgctc gacgcgcgca aggtgttcga ccgcgggcac 420
gagggtgacg cggtggcatg gaactccctg ctgcgcgggt acgcggctgc tggggacgtg 480
aacgcgctcc gggagttctt cgtggggatg caagcccggg acacggtttc gtggaacacg 540
atcatcgcgt ggtgtgttga gaatggggaa tatgaggagg caattgcggt gttccgtgag 600
atgctggcaa gcatggagtg tcttcctgat agagtcacac tggtgagcgt catctcagcg 660
attacatatt tgggtgcact agcccagggg ctgtgggcgc atgcatatgt ttgcaggaaa 720
ggtatcgaag tcgaggagag gctgagctca gctctcataa acatgtattc aaagtgcggt 780
tgcattgaag gtgcagttca tgtgtttgaa aatctgggtg cacagatgaa tgtggacaca 840
tggaacgcta tgttagctgg cttcacagca aatggatgca gtgagaaagc tctggagctt 900
ttcgctagga tggagataac aggtttggtg cctaacaaga ttactttcaa cactgtgctg 960
aatgcttgta gtcatggtgg ttttgttgag gaaggtatgg ggtgtttcga gagaatgacc 1020
aaggtttatg gtattgagcc tgacattgcc cactatggtt gcatggtgga tctgttctgt 1080
cgtgcagggc tttttgacaa ggctgaaaag atgatccaaa tgatgcctat gaaaccagat 1140
gctgctgtgt ggaaggccct agtgggtgct tgtaaaactc acaggaactt tgaactggga 1200
aggaaagcag gccatatgct tattgaggct gcaccaaatg atcacgcagg gtatgtgctg 1260
ctatccaaca tatatgcact agatggaaac tggacaggag tgcataaggt gaggaagctg 1320
atgcttgatc gtggtgtgca gaaggtacct ggaagcagct caatagaaat tgatggtgta 1380
attcatgagt tcatatctgg ggataaaagc cattcaagca aggaggacat atacgagatg 1440
ctaagtgaaa tgtgtcagca attgaaagtt gcaggatatg ttccagatac ttcacatgtg 1500
ctactagata ttgatgatga ggatgtgaag gagagctcac tagctcttca cagcgagaag 1560
cttgcaattg cctttggatt gataagcact gcaccaggca cgcctattag gatagcaaag 1620
aacctccggg tttgtggaga ttgtcataat gccgttaaac ttctaagcaa gatttatggg 1680
aggtgcataa ttgttaggga tgcaaatcga tttcatcatt tcagagaagg atcatgctct 1740
tgcggggatt tctggtaa 1758
<210> 3
<211> 309
<212> DNA
<213> dular (Oryza sativa)
<400> 3
atgcctcctc ccaccgtccc cttcttcctc acctccacca cgctcgccgc tgcggccgca 60
gcggcccggg ccgccctcgc caccggcgca gaagcagcag ccgcgcgagg cgcgggatgg 120
ttctcgggac gcgtgcgcgt cgtacaccgc gcgcatgcgg ctcaacccgc agctcgcgct 180
ccgcctgttc gaccacctgc tccgctcggg cgccgacccg gaccacgtgg cgtacgccct 240
cgcgctgggc cgctgcgcgc gcgggcggga ccgccgcgcc gccgcgcagc tccacgcgca 300
cgccgctaa 309
<210> 4
<211> 585
<212> PRT
<213> 日本晴NIP(Oryza sativa)
<400> 4
Met Pro Pro Pro Thr Val Pro Phe Phe Leu Thr Ser Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Lys Pro Gln Arg Pro Gly Pro Pro Ser Pro Pro Ala
20 25 30
Gln Lys Gln Gln Pro Arg Glu Ala Arg Asp Gly Ser Arg Asp Ala Cys
35 40 45
Ala Ser Tyr Thr Ala Arg Met Arg Leu Asn Pro Gln Leu Ala Leu Arg
50 55 60
Leu Phe Asp His Leu Leu Arg Ser Gly Ala Asp Pro Asp His Val Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ala Leu Gly Arg Cys Ala Arg Gly Arg Asp Arg Arg Ala
85 90 95
Ala Ala Gln Leu His Ala His Ala Ala Lys Arg Gly Ala Ala Ser His
100 105 110
Arg Arg Val Cys Asn Gly Leu Ile His Ala Tyr Ala Val Cys Gly Ser
115 120 125
Leu Leu Asp Ala Arg Lys Val Phe Asp Arg Gly His Glu Gly Asp Ala
130 135 140
Val Ala Trp Asn Ser Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Ala Ala Gly Asp Val
145 150 155 160
Asn Ala Leu Arg Glu Phe Phe Val Gly Met Gln Ala Arg Asp Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Thr Ile Ile Ala Trp Cys Val Glu Asn Gly Glu Tyr Glu
180 185 190
Glu Ala Ile Ala Val Phe Arg Glu Met Leu Ala Ser Met Glu Cys Leu
195 200 205
Pro Asp Arg Val Thr Leu Val Ser Val Ile Ser Ala Ile Thr Tyr Leu
210 215 220
Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu Trp Ala His Ala Tyr Val Cys Arg Lys
225 230 235 240
Gly Ile Glu Val Glu Glu Arg Leu Ser Ser Ala Leu Ile Asn Met Tyr
245 250 255
Ser Lys Cys Gly Cys Ile Glu Gly Ala Val His Val Phe Glu Asn Leu
260 265 270
Gly Ala Gln Met Asn Val Asp Thr Trp Asn Ala Met Leu Ala Gly Phe
275 280 285
Thr Ala Asn Gly Cys Ser Glu Lys Ala Leu Glu Leu Phe Ala Arg Met
290 295 300
Glu Ile Thr Gly Leu Val Pro Asn Lys Ile Thr Phe Asn Thr Val Leu
305 310 315 320
Asn Ala Cys Ser His Gly Gly Phe Val Glu Glu Gly Met Gly Cys Phe
325 330 335
Glu Arg Met Thr Lys Val Tyr Gly Ile Glu Pro Asp Ile Ala His Tyr
340 345 350
Gly Cys Met Val Asp Leu Phe Cys Arg Ala Gly Leu Phe Asp Lys Ala
355 360 365
Glu Lys Met Ile Gln Met Met Pro Met Lys Pro Asp Ala Ala Val Trp
370 375 380
Lys Ala Leu Val Gly Ala Cys Lys Thr His Arg Asn Phe Glu Leu Gly
385 390 395 400
Arg Lys Ala Gly His Met Leu Ile Glu Ala Ala Pro Asn Asp His Ala
405 410 415
Gly Tyr Val Leu Leu Ser Asn Ile Tyr Ala Leu Asp Gly Asn Trp Thr
420 425 430
Gly Val His Lys Val Arg Lys Leu Met Leu Asp Arg Gly Val Gln Lys
435 440 445
Val Pro Gly Ser Ser Ser Ile Glu Ile Asp Gly Val Ile His Glu Phe
450 455 460
Ile Ser Gly Asp Lys Ser His Ser Ser Lys Glu Asp Ile Tyr Glu Met
465 470 475 480
Leu Ser Glu Met Cys Gln Gln Leu Lys Val Ala Gly Tyr Val Pro Asp
485 490 495
Thr Ser His Val Leu Leu Asp Ile Asp Asp Glu Asp Val Lys Glu Ser
500 505 510
Ser Leu Ala Leu His Ser Glu Lys Leu Ala Ile Ala Phe Gly Leu Ile
515 520 525
Ser Thr Ala Pro Gly Thr Pro Ile Arg Ile Ala Lys Asn Leu Arg Val
530 535 540
Cys Gly Asp Cys His Asn Ala Val Lys Leu Leu Ser Lys Ile Tyr Gly
545 550 555 560
Arg Cys Ile Ile Val Arg Asp Ala Asn Arg Phe His His Phe Arg Glu
565 570 575
Gly Ser Cys Ser Cys Gly Asp Phe Trp
580 585
<210> 5
<211> 585
<212> PRT
<213> 9311(Oryza sativa)
<400> 5
Met Pro Pro Pro Thr Val Pro Phe Phe Leu Thr Ser Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Lys Pro Gln Arg Pro Gly Pro Pro Ser Pro Pro Ala
20 25 30
Gln Gln Gln Gln Pro Arg Glu Ala Arg Asp Gly Ser Arg Asp Ala Cys
35 40 45
Ala Ser Tyr Thr Ala Arg Met Arg Leu Asn Pro Gln Leu Ala Leu Arg
50 55 60
Leu Phe Asp His Leu Leu Arg Ser Gly Ala Asp Pro Asp His Val Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ala Leu Gly Arg Cys Ala Arg Gly Arg Asp His Arg Ala
85 90 95
Ala Ala Gln Leu His Ser His Ala Ala Lys Arg Gly Ala Ala Ser His
100 105 110
Arg Arg Val Cys Asn Gly Leu Ile His Ala Tyr Ala Val Cys Gly Ser
115 120 125
Leu Leu Asp Ala Arg Lys Val Phe Asp Arg Gly His Glu Gly Asp Ala
130 135 140
Val Ala Trp Asn Ser Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Ala Ala Gly Asp Val
145 150 155 160
Asn Ala Leu Arg Glu Phe Phe Val Gly Met Gln Ala Arg Asp Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Thr Ile Ile Ala Trp Cys Val Glu Asn Gly Glu Tyr Glu
180 185 190
Glu Ala Ile Ala Val Phe Arg Glu Met Leu Ala Ser Met Glu Cys Leu
195 200 205
Pro Asp Arg Val Thr Leu Val Ser Val Ile Ser Ala Ile Thr Tyr Leu
210 215 220
Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu Trp Ala His Ala Tyr Val Cys Arg Lys
225 230 235 240
Gly Ile Glu Val Glu Glu Arg Leu Ser Ser Ala Leu Ile Asn Met Tyr
245 250 255
Ser Lys Cys Gly Cys Ile Glu Gly Ala Val His Val Phe Glu Asn Leu
260 265 270
Gly Ala Gln Met Asn Val Asp Thr Trp Asn Ala Met Leu Ala Gly Phe
275 280 285
Thr Ala Asn Gly Cys Ser Glu Lys Ala Leu Glu Leu Phe Ala Arg Met
290 295 300
Glu Ile Thr Gly Leu Val Pro Asn Lys Ile Thr Phe Asn Thr Val Leu
305 310 315 320
Asn Ala Cys Ser His Gly Gly Phe Val Glu Glu Gly Met Gly Cys Phe
325 330 335
Glu Arg Met Thr Lys Val Tyr Gly Ile Glu Pro Asp Ile Ala His Tyr
340 345 350
Gly Cys Met Val Asp Leu Phe Cys Arg Ala Gly Leu Phe Asp Lys Ala
355 360 365
Glu Lys Met Ile Gln Met Met Pro Met Lys Pro Asp Ala Ala Val Trp
370 375 380
Lys Ala Leu Val Gly Ala Cys Lys Thr His Arg Asn Phe Glu Leu Gly
385 390 395 400
Arg Lys Ala Gly His Met Leu Ile Glu Ala Ala Pro Asn Asp His Ala
405 410 415
Gly Tyr Val Leu Leu Ser Asn Ile Tyr Ala Leu Asp Gly Asn Trp Thr
420 425 430
Gly Val His Lys Val Arg Lys Leu Met Leu Asp Arg Gly Val Gln Lys
435 440 445
Val Pro Gly Ser Ser Ser Ile Glu Ile Asp Gly Val Ile His Glu Phe
450 455 460
Ile Ser Gly Asp Lys Ser His Ser Ser Lys Glu Asp Ile Tyr Glu Met
465 470 475 480
Leu Ser Glu Met Cys Gln Gln Leu Lys Val Ala Gly Tyr Val Pro Asp
485 490 495
Thr Ser His Val Leu Leu Asp Ile Asp Asp Glu Asp Val Lys Glu Ser
500 505 510
Ser Leu Ala Leu His Ser Glu Lys Leu Ala Ile Ala Phe Gly Leu Ile
515 520 525
Ser Thr Ala Pro Gly Thr Pro Ile Arg Ile Ala Lys Asn Leu Arg Val
530 535 540
Cys Gly Asp Cys His Asn Ala Val Lys Leu Leu Ser Lys Ile Tyr Gly
545 550 555 560
Arg Cys Ile Ile Val Arg Asp Ala Asn Arg Phe His His Phe Arg Glu
565 570 575
Gly Ser Cys Ser Cys Gly Asp Phe Trp
580 585
<210> 6
<211> 102
<212> PRT
<213> dular(Oryza sativa)
<400> 6
Met Pro Pro Pro Thr Val Pro Phe Phe Leu Thr Ser Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Arg Gly Ala Gly Trp Phe Ser Gly Arg Val Arg Val Val
35 40 45
His Arg Ala His Ala Ala Gln Pro Ala Ala Arg Ala Pro Pro Val Arg
50 55 60
Pro Pro Ala Pro Leu Gly Arg Arg Pro Gly Pro Arg Gly Val Arg Pro
65 70 75 80
Arg Ala Gly Pro Leu Arg Ala Arg Ala Gly Pro Pro Arg Arg Arg Ala
85 90 95
Ala Pro Arg Ala Arg Arg
100

Claims (7)

1.控制水稻耐冷基因COLD2，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.含有权利要求1所述基因的重组载体。
3.含有权利要求1所述基因的工程菌或宿主细胞。
4.如权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.如权利要求1所述基因的用途，其特征是：用于水稻耐冷育种。
6.根据权利要求5所述的基因用途，其特征是：将基因通过转基因或分子标记辅助选择育种方法来提高水稻的耐冷性。
7.一种培育耐冷性水稻的方法，其特征是：将含有权利要求1所述基因导入植物细胞中，从而获得耐冷性增强的转基因水稻。
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