CN109837350B - 黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用，分子生物学DNA标记技术领域。该微卫星位点的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，微卫星引物的序列为SEQ ID NO：9‑10。本发明从黄尾鲴基因组DNA中筛选出8个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，所获得引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，可用于黄尾鲴的遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种等领域，使一种可靠有效的分子标记。

Description

黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记技术领域，特别涉及黄尾鲴微卫星位点及引物。

背景技术

黄尾鲴（Xenocypris davidi Bleeker）俗称黄尾、黄片、黄姑子、黄瓜鱼等，隶属于鲤科（Cyprinidae）、鲴亚科（Xenocyprininae）、鲴属（Xenocypris），属底层鱼类，通常生活在江河、湖泊的中下层，尤其喜栖息于多水草、软泥底质的水域底层，是一种中小型淡水鱼类。适应性强，分布广，在我国的长江、珠江、闽江及闽东南各溪流均有分布。由于其具有肉厚、质实，味道鲜美，营养价值高，调控水质等特点，已成为当前水产养殖品种结构调整中首选的优良品种之一，也是水库、湖泊等天然水域增殖放流的理想鱼类。

近些年，由于养殖驯化过程中的近亲繁殖、野生资源的过度捕捞以及生存环境的破坏等诸多人为因素的影响，黄尾鲴的野生群体种质资源已经受到了严重的威胁，并逐渐出现了黄尾鲴的养殖群体生长缓慢、规格小，抗逆性能差、性成熟个体变小等问题，制约着我国黄尾鲴养殖业的持续健康发展。

国内外在水产养殖物种遗传育种过程中，多采用分子标记辅助育种与常规选择育种相互配合的综合育种技术，分子标记辅助选择使育种技术不断升级、育种效率不断提高。目前，黄尾鲴良种选育技术研究尚处于起步阶段，其分子遗传基础薄弱、基因序列和分子标记资源匮乏，缺乏可用于 QTL 定位和分子标记辅助育种方面的高质量遗传连锁图谱，严重影响我国黄尾鲴遗传育种计划的开展。因此，迫切需要开展黄尾鲴高效、可靠、多态性高的分子标记开发，对黄尾鲴进行种质资源评价、鉴定及群体遗传学研究，为保障我国黄尾鲴养殖业的健康可持续发展提供理论指导和科学依据。

微卫星（Microsatellite）又称为简单序列重复（Simple Sequence Repeat,SSR），短串联重复（Short Tandem Repeat, STR）或简单序列长度多态性（Simple SequenceLength Polymorphism，SSSLP），是近些年迅速发展起来的一种分子标记，是1-6个碱基串联重复序列，在至今研究的所有生物基因组中均有分布。其原理是利用 SSR为引物进行PCR扩增，扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离 然后进行多态性分析。在众多分子遗传标记中，微卫星标记具有多态性好、稳定性高、特异性高、共显性遗传、操作简便等特点，成为物种的基因型鉴定与品种保护 、种质纯度评价和种质保存、多样性研究、基因和QTL分析、谱系分析和分子标记辅助选择育种、资源鉴定、连续图谱绘制和克隆并筛选大片段文库等领域的有用工具，是应用较为广泛的遗传标记。

发明内容

本发明的目的就是提供一种黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用，本发明提供了8个黄尾鲴微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为黄尾鲴6种群遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、亲权鉴定、QTL定位等方面提供分子标记。

黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用，所述黄尾鲴微卫星核苷酸是在高通量测序黄尾鲴转录组获得大量EST(expressed sequence tags) 序列的基础上，从EST序列中筛选出了8个微卫星核苷酸序列, 8个微卫星核苷酸序列分别是SEQ ID NO：1-8。

所述微卫星核苷酸序列还包括在严格条件下与上述的核苷酸序列杂交的，包含相同微卫星重复单位的核苷酸序列分子。

所述黄尾鲴微卫星引物是从序列SEQ ID NO：1-8的微卫星重复的侧翼序列上设计的正向、反向引物。

所述微卫星引物序列分别为SEQ ID NO：9-24。

所述微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表1：

表1：8个微卫星位点及对应引物信息

位点	微卫星序列	正向引物名称/序列	反向引物名称/序列
				HWG1	SEQ ID NO：1	SEQ ID NO：9	SEQ ID NO：10
HWG 2	SEQ ID NO：2	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：12
				HWG 3	SEQ ID NO：3	SEQ ID NO：13	SEQ ID NO：14
HWG 4	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：15	SEQ ID NO：16
				HWG 5	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：17	SEQ ID NO：18
HWG 6	SEQ ID NO：6	SEQ ID NO：19	SEQ ID NO：20
				HWG7	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：21	SEQ ID NO：22
HWG8	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：23	SEQ ID NO：24

所述的黄尾鲴微卫星引物在黄尾鲴种群遗传多样性检测中的应用，其检测方法包括如下步骤：

步骤（1）：基因组DNA的提取：采用酚抽提法提取黄尾鲴基因组DNA；

步骤（2）：微卫星PCR扩增：用微卫星引物扩增基因组DNA，获得黄尾鲴个体微卫星扩增产物；

步骤（3）：扩增产物电泳：采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Goldview染色分型；

步骤（4）：遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENPOP Version 3.4 计算遗传多样性参数；

上述的微卫星引物选自序列分别为SEQ ID NO：9-24的微卫星引物。

有益效果

本发明从黄尾鲴基因组DNA中筛选出8个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获引物的扩增结果具有高的多态性和稳定性，可用于黄尾鲴的种群遗传多样性检测，亲权鉴定、遗传图谱构建以及分子辅助育种等领域。

具体实施方式

一、基因组DNA提取：

1、用酚抽提法提取黄尾鲴基因组DNA：

1)每个个体称取100mg尾鳍于1.5 mL Eppendorf管中，加入450 µLSTE抽提缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1 mmol/L EDTA，pH8.0）、35µL SDS（10%）、15µL蛋白酶K（0.2%）。

2)颠倒混匀后，将Eppendorf管放入55 ℃水浴锅中消化3 h左右至溶液澄清透明。

3)加入RNaseA至终浓度20 μg/ml，37 ℃温浴1 h。

4)加入700µL Tris饱和酚，在DNA混合仪上振荡混匀30 min，4 ℃下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中（注意用尖端剪平的1 mL管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀）。

5)在上清液中加入等体积酚仿醇混合物（苯酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1），振荡混匀15min后，4 ℃下12000转/min离心10 min，吸上清液于另一新Eppendorf管中。

6)上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15 min后，4 ℃下12000转/min离心10min，吸取上清液。

7)往步骤6）得到的上清液中加入-20 ℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，收集沉淀。

8)用70%乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0;0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0），室温充分溶解。

二、微卫星引物

根据黄尾鲴转录组EST-SSR序列，选择了单至三核苷酸不同重复基序的EST-SSR设计、利用软件Primer premier 5设计50对微卫星引物，引物设计主要参数为：引物长度20±2bp，产物的长度为100-500 bp；单个引物少于3个核苷酸的互补；保证两个引物的Tm值相差不超过4 ℃；两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对，(G+C)%含量近似(45%-55%)。以6个黄尾鲴种质（鄱阳湖、军山湖、太泊湖、萍乡、湖南以及养殖）的基因组DNA为模板，对这50对引物进行PCR扩增检测，最终有31对引物能稳定扩增出目的条带。

三、黄尾鲴多态性微卫星位点引物的筛选及种群多样性检测

（1）筛选有多态性的引物：

采用酚抽提法提取32个个体的黄尾鲴基因组DNA。用上述获得的31对引物扩增基因组。反应体系为25µL ，包括10 mmol/LdNTP 1µL，10×buffer 2.5 µL，25mmol/L MgC12 2µL，8pmol/µL两侧引物各0.75µL，5 U TaqDNA聚合酶0.2µL，50ng/µL的DNA模板2µL，用超纯水补足25 µL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94℃变性30s，复性30s，72 ℃延伸45s，35个循环；最后72 ℃延伸7min。4℃保存。PCR扩增产物采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Goldview染色分型。用PBR322/BsuR I Marker 作为分子量内标，个体微卫星扩增产物用软件BIO-PROFIL来判断等位基因片段的具体数值。共得到8个具有多态性的微卫星标记（见表1）：

（2）遗传多样性分析

使用Popgen32软件计算黄尾鲴群体的观测杂合度（Ho）和期望杂合度值（He）并进行Hardy-Weinberg平衡（Hardy–Weinberg equilibrium，HWE）检验。其参数信如表2。

表2：6个微卫星位点的重复单位、引物的相关信息

其中没TM代表微卫星引物的退火温度，n代表等位基因数目，Ho代表观察杂合度，He代表期望杂合度。

用本发明的引物对30个黄尾鲴基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从8到11个不等，平均等位基因数目为9.0个。观察杂合度（Ho)的范围从0.738到0.873，期望杂合度（He）的范围从0.762到0.904。

本发明的微卫星引物可用于黄尾鲴种群遗传多样性检测、数量性状连锁作图（QTL）、遗传连锁作图以及个体的鉴定等。

序列表

<110> 江西省水产科学研究所

<120> 黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用

<130> 1

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 916

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG1

<400> 1

tttttttttt cttttttttt ttttgttaaa cttttctctt tgtcatttgt gtgtgtgatt 60

tttatagtga acaaggcaat tgcagagccg gcagatgtct gagtgtgacc cctctgctgc 120

cctgtagaaa aataaaagcg gcccagccca cgtgtttccc tgctgtaaac tataatcctc 180

tctcttgtgt ctccaactga attcactcga gctcacagac aaagatcgat ccgtctatac 240

atgcaaagca caaatgtttt aggctcaaat ccttgttggt ttccacattt ctgatcgaac 300

tgcatgctaa tcagacacga gataatccac ggtaagacga gatgtggcgc atttctgcat 360

gagtgttttt gcacacatat atgcactaac tatcagatat gatgatagct aaactcaggg 420

cgtatgtgat tatttgtcca gcctccacct tttttgagta agaaacagtc tgagaatgtt 480

cttttgttcc tctccacatg actgaaaaag gcctgagacg ctttttaacg gtcgtttctg 540

ttttttgttg ttgtgttttc cagttctttt ccctggttct gcaagtcctg taaaccaggc 600

ccagcagaaa atgccaccca acagttttgt cttctgcagc ttgtcctgtt tctctctctc 660

tctctctcat attatctctc tctctctctc tctggtgtgt gtgtgtcagt gatgattgtg 720

ttgtttggag tgatatatta atttcagagg cgctcaccca atggactcca tgcactcacc 780

accagacatt catttgtcat ttaattctag ttattttttc cttcagcatt agtctctagt 840

tgagtttaaa ctgggctttt gctggaaggt gtcctttttt tctctctctt tatcaacaca 900

cacacacaca cacaca 916

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG2

<400> 2

acgagatcgt gaacttgaga aggagcgaga agaacagaga gacaaagaca gaagacgaga 60

ggaggagatg aaggaagagg ctttgagaaa agccagagag ggcgacagag aaaaggagag 120

aaaccgtacc agaagccaag aggtgtccct atcagacaga aagtccttta gctgtcagcc 180

agaggacaga cgcggtgcca gaggaagtga gcctgagcaa gaggtgggca agaaagacag 240

gaaagttgaa gaggacaaga ggcaggagaa cagtcctcaa aaccaaaaga aggagaaaca 300

gactcaaaag gaaaagcttg ggaagaaagc caaatctgct agtagtagta gtagcagcag 360

cagcagcagt agtagtagta gtagcggcag cgagagtgat agtgacagct cctcatcgtc 420

atcctcatca tcctcctcct cctcatcatc gtcatcctcg gatgatgaaa aaaagaaaag 480

ttcaaaagac agcagcacag tcagtaagtc ggttcctaat gctgtcatag ctcaggctat 540

tgcacgccga gagaaggaga accgaggaag ggatggagag agtgatgaag gcaagaaagc 600

gtacccttcc acgcaaagac agagctctcc tcctgagccc cagagaagaa gggacagtga 660

tgataagaga caacgagaca tggagagaga ccggagacct ggaaactctt cgcctccttc 720

cacaggaaac aaagaccgtg gaaaagagag gtacactccc accgagagtt ccagcccgcc 780

tccttcgccc cctcagagag gccgggacag gtacacacct tcagaagaaa ccaaatctca 840

gagcagagat cggggaggcg agcgatatac cccgtcagag ctggaacgag aggcgtcgcg 900

gccctcgcct gccagaggaa gagatcgaca gagtgaccga aagaaagaag tgtcacctgt 960

gtctccgaga ggaaaaggaa ggaatgacgt gtcacaggcg aaacagacga cggtatctcg 1020

gccttcaccg aaacgcaccc cgccacgaca gtaccaggac ccacaacgct cacgttcccc 1080

cagtccgaga cgaggagtga gaagacagtc acctccacga aactcatccc ctttccgacg 1140

ggaccgcagc cgagaacgtc tcagagaacg agagagggac cgatttagag caaggccagg 1200

agacagagaa cgagagcgtt ccagggagag gagaatgagg agcagtagat ccaggagtcc 1260

tcgaagacaa agtcctccct acaggtttcg tcgttcaccc tctccagtac gtcgacgcag 1320

aaatagtcgt tcact 1335

<210> 3

<211> 1246

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG3

<400> 3

gagaattaac aatcaggggt ttgaattaaa aatcaacatc tattttttat acatcttagc 60

tttcctttcg gaaaaagggg atttagatgc tgacaattat cagaaaaatc ttattcagga 120

ataaaacacc atctaataac ccaattaatt cacaatcaca gattgtttcc atctcattca 180

tattctctca gatacattca caaaccagat acatacaaaa caataaatca gccattctat 240

agggtgggtg gtgttctggt cacctgactt aaaagtctct gattggttga ggagggaaag 300

ggactcattt caaaggctgg gatagtgtgt gtgtgtgtgt gcgtatgtgt gtgtgtgtgt 360

gtgaacgcac acgctgaaag aagcaactgg atcgtttcag acactctgaa cagggccgta 420

gtgaacatgt ggaaataatc gtgctgtgtg gagtttaccg gattgaggaa gtgtggcttc 480

tggtagtgaa aaaggacaaa gaggacctgt aaatattttt aaagctggtg tgaagatgaa 540

ggatggattt ttctgttcag tgtgaggaag caatgacagg agaaacggac aagtacctgg 600

gaccgcaaga cctgcgcgag ctcggagacg actctctccc gcaagaggga tacgtgggat 660

tcagtgttgg agcccgcacg gccagcctgc gctccttcag ttcggatagg tccaacacac 720

tgaaccggag ctccttcgcc cgtgacagca tgatgatcga agagatcctg gcgccaaaca 780

aggacacgca cctggcttta gcaaaagatt acaacgcaga gtcaatgaga cgctatagct 840

ggacaccgga cactctggac aacgtgaacc tggtctccag ccccgtccat tcagggtttt 900

tggtgagctt catggtggac gcccgcggcg gttccatgcg aggaagtcgc cacaatggca 960

tgcgcatcat catcccgccc cgcaagtgca ccgcgccaac acgtatcaca tgccgtcttg 1020

tcaaaagaca caagctggca tccctgccac caatggtgga gggagaaggg ctggcgagca 1080

ggctggtgga ggtgggccca gcgggggctc agtttctggg ccctgtgatt gtggagattc 1140

ctcattttgg gtccatgaac tgcataactc acaggagggg gaaatgatgt tctgtatgcg 1200

tgcactcaca gccttgataa tgctcacttt ttttcttttt ttttta 1246

<210> 4

<211> 1388

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG4

<400> 4

gtttttacta tcaaatgtgt ctgccgctga cctgcctgca ctgttgcgcc gcgctggtat 60

ttacgacatc tgcgttcgga agacgtcagt atgcgggcac acatgtggag tgcggcgtgt 120

gtttctgcat tcagagtcct gactcgagtc tgtgtgtcat ctcagcgggt cagaacattt 180

ccaccggtgt ttacagccca cagtctctca ctctacagtc catgtgcctc tgtgctcgtc 240

aaaggtttga tgtcaagaag acgacctcac agtaggaaga tgtcacagtc cttggcgcag 300

cggatggtct gggtggatct ggagatgaca gggctggata tcgaaaagga caagattatt 360

gagatggctt gcatagttac agactctgac ctgaacgtca ttgcagaggg gccaaatctg 420

atcatcaacc aaccagatga tctgcttgac ggcatgtcag actggtgcaa agagcatcat 480

gggaagtcag ggttgacgca ggctgtcagg gacagtcaca tctctctcca gcaggccgag 540

tacgaattcc tgtctttcgt ccgacagcac acgccacccg gacagtgtcc tctcgcaggg 600

aactccgttc acgccgataa gaagtttctg gataagtaca tgccgcagtt catgcgacat 660

ctgcactatc gcattattga cgtgagcacc attaaagagc tgtccagacg atggtatcca 720

gaggagtatg gtctcgcacc gcagaaaaaa gcatcgcaca gagcattgga agacatccag 780

gagagcataa aagaactgaa gttttacaga gcgaatgttt tcaaagtgaa ggagaagaga 840

aaagtagtgg aaaacggtga taagacatct gtgagctaat ctccaaatcg atctggagtg 900

gttttaggat cttcctcaca tttgaatgaa agcttgtgtg aatacttgag agagagagag 960

agagagagag agagacatgt tgacgttccc actgtttgtt tcctgtttta tttgttatca 1020

ctgcaaatat cttagtttaa aaagagagag aatccaaaaa gttcaaaatg atggaaatga 1080

ctcattgttt tgaacaagtt cctttttatc cttcgtgttc cattggggaa tctgatttgt 1140

tgcttgttta ctggattgtg tttgtgtgca gtaatgaaac aaaagtatgt ttgaaaaggt 1200

tattctgtct gagagtgttt tcattgcact ccttttttga aataaaaatc atttgttgcg 1260

gttttttgag aatgtttaat gagactgctg aaattttgtt gctgacctgt acgtgcagta 1320

acctgaacta gacggcagat ggcagtatac agtcaggtaa tatctggagc tcattgcact 1380

ggtgatta 1388

<210> 5

<211> 479

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG5

<400> 5

tttttcccga aaacaagaaa acaacttcca cctgtcaaga aaatgcctct tgatccaaga 60

accccaagac attttgacta gaaacaagtc aaaaactcca agcaagaaca gcactccccg 120

cagcgtatct gctctgcatt aatgaactct caccgacaga atgaatcacg tcgagtcgcc 180

tttattttta agagtaaaaa agtgacagat gggaaacaaa aagataaatc atgacatcat 240

tagtacaatt tacacaaatc aagccgtctt cagcaattca tcgacacggg caacgaggac 300

gaggagcata aaaagacaca ttttaaggtt ctggtgaaaa aaaaaaatga actaaacaaa 360

atgtcttcag cagaagaaga agaagaagaa gaaggacaga gagagtgata gaaatggcgc 420

agaggaagat gaactgacct cagtaacagg agagagtgtt gaagagccta cctcacaga 479

<210> 6

<211> 1211

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG6

<400> 6

agtctgatag cggaagttcg tgcctctggt agctgcagtt caggcggatc ccgtcagtgt 60

ctgatcacaa actttctgtc aaagccgaaa aacacacgca gtccggtgaa atgggggata 120

aggagttgat gtgggccctg aaaaacggag atctggatga ggtgaagact ctcctggtta 180

aggcggagga tgtgaaccgg actctggagg gaggcaggaa gccgcttcac tacgctgcag 240

actgcggtca cgccgacatg ctggagtttc tgctgtctaa aggagccgat gtgaacgctc 300

cagataaaca cggcatcacc ccgctgctgt ccgccactta tgagggtcac atgagctgcg 360

tcaagattct tctagaaaag ggtgctgata aggaacgaaa gggtccagat ggtctcagtg 420

cgttcgaggc ggccgagagc gaggccatca aagctctact gaagggaggt gcctgatttt 480

cccctttagt ttatcagcat cagccattgg ctgatggacc tgtcactcat gcctacggac 540

caatgggaac gcctgtctaa caccactaaa cacggacttt agagttcaga ctacagcgcg 600

cagactctgc gagcgagtgt atgatgatga tgatgatgat gtgtacatta atttttcaga 660

ctgttgcgat tttgcaatta gaaacaaatg gtttgtatag ttaatagggc tctgaaaaat 720

actagctgat gaattgacct gcactccagc cccacgtttg ccctccttca gctcaaccac 780

attcccgcgg ctgtcgcatt agctgtttaa agaacaaata ttacacttca gatgcttgag 840

tcgttctgct gacgcgcaca ttttgctttt gtgccccttt gaatttgtgt tgttgtggca 900

aaaataaatg aattctcagc tgctgtgtgc ttgtagtgtt aaacaggatt gttcagatga 960

gggacgcctg tctctctctc tctctatcgc tccagcagga cgtgtctcac tccgctctct 1020

tgccgagatg tcgccctctc cagattatct cactctttta ggccgtctct ctctctctct 1080

ctctctgcat gatggtgttt tagcttttga agacagtctt aaacaaaaat gcacattgat 1140

aagcaaatga acacttcaaa gatccatatc tggcattgtt gtgataaagt ccgtttgaaa 1200

acaaaaaaac a 1211

<210> 7

<211> 765

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG8

<400> 7

agtctctata aacggccttg gagtcccgag gaaccaaaaa gtgagaacca cgtaattcgc 60

agtccatctc aggagatctc tcgtgagcag caggccacat cgagtctaga ccctgctggt 120

gcgggagtgg tgcgggccga gctggtcgtg gtccagaacg agtcttcgga aagcgaggag 180

aacgacgaag agtttttgga ggatgttatg tcagaggtga agctgcaaag ggaacttaaa 240

tccgagtcac caaaagaaga tctgaaccct ctgaaggtgt cgtcacctca aaaccataca 300

gaggacgaac agctgaagaa ggttgtgtgt ttatcattgg agctgaagaa agaggaagca 360

aatcaagaag aagaagacga ggaggaggag gaggaggaga gcataaagag gagtaactgt 420

catgaagatg aggagagcga gcaggaagat acagatgaat gtgggaaaac ttctccagtg 480

ttttatagtt ttgagaatgc tgcgtttgtg gatgataagg aagcgtttct ggaccatcag 540

gatgaggagg acgaggatga agatgaggtc tatgaggagt atgatgaagc tcctggcttg 600

tcagaggatg aggaacgctc tccaagacgg aaaatcagat tctctaccga gccgatacgg 660

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ggaaaataaa tgctttcacc tctcataaaa aaaaaaaaaa aaaaa 765

<210> 8

<211> 1200

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG8

<400> 8

tataatatta catgttatac caaattatat aatattcaac agttttgtgt ttcttgactg 60

ccccctactg gttaagtaca ttttaatcca tcagaacaaa taaatcatac agagaggtgt 120

tcaaaaacat ttaatttttc cttaagagag agatagaatt acagcaaaca ttgattcggt 180

caggttaaag ataaccaata aataactggc catgttaata tccattcaaa atgcagtttt 240

aacagtcata aaacagcgaa tcaagtcact ttttgcggag tgagtgatga caatcttgca 300

catcaatgta catcatttta aaaatgcctc ctggtaaact catagattac aattcagctg 360

agctctggca gtagctttta gccacaggtg ccgttccctt ttcaaagagg gttcattata 420

caaattcact ggtgccacag aaacacagct tgagcgactt tgattactct gtctgtggga 480

agaacattct acattatctt acaaaacggg gcttcttttc ttttttaacc acaaacagac 540

tgagcgaaag tgaaaggaga gtatgtgaag gcaccctgtt attgttccct aaagtggtct 600

cgagtttgtt cagttcattt ggcacgttat caaaaaggac agtgaactct gctgtgcttg 660

ttttgatacc tcaaaacctt acagactctt aatgtttcgt atttgaatat gtagaaaagg 720

aaagtgtaaa aataagcagt tttaaaaata caagtgtcaa tctctctata tatttaatat 780

atatatatat aataataata ataataatat aaactcttct ttaagtgagc cgtttggtcc 840

tcttaagttc caaatgtaca gaacacgtat gtcgatttta cacacagtta tgtggattga 900

ttcttttaac aaggactcat ccttgattag tgtcagagag agaaagcgag cgagagagag 960

agggatgctg ggggaatgtg agttgtcctg tagggggcac tttctgcagt cacatcacct 1020

tttgtggaag actgatgggg gggtcgttgg atctagaagt agggcaccat ggtgagcttg 1080

taccacttga cagtctctct gctcaggtca aagtccttaa ggctgagggt tatgccaccc 1140

aaatagcagt tctctcgcag agactctgca ctgagcacgc tcagttgaag ttccctttgc 1200

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG1p1

<400> 9

tctgcaagtc ctgtaaacca 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG1p2

<400> 10

atgacaaatg aatgtctggt g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG2p1

<400> 11

aaagttgaag aggacaagag g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG2p2

<400> 12

tgcaatagcc tgagctatga 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG3p1

<400> 13

tcagatacat tcacaaacca gat 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG3p2

<400> 14

tgtccttttt cactaccaga a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG4p1

<400> 15

cgatggtatc cagaggagta 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG4p2

<400> 16

gaaacaaaca gtgggaacg 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG5p1

<400> 17

tctcaccgac agaatgaatc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG5p2

<400> 18

ctcttcaaca ctctctcctg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG6p1

<400> 19

ttcagatgct tgagtcgttc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG6p2

<400> 20

acggacttta tcacaacaat g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG7p1

<400> 21

ggatgttatg tcagaggtga a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG7p2

<400> 22

gcttccttat catccacaaa c 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG8p1

<400> 23

gttcatttgg cacgttatca 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Xenocypris davidi Bleeker HWG8p2

<400> 24

aacttaagag gaccaaacgg 20

Claims (2)

1.一种分离的黄尾鲴微卫星核酸片段，其特征在于：所述的黄尾鲴微卫星核酸片段的序列为SEQ ID NO：1。

2.一种利用权利要求1 所述的黄尾鲴微卫星核酸片段检测黄尾鲴种群遗传多样性的方法，其特征在于：包括如下步骤:

步骤（1）：基因组DNA的提取：采用酚抽提法提取黄尾鲴基因组DNA；

步骤（2）：微卫星PCR扩增：在权利要求1所述的黄尾鲴微卫星核酸片段的侧翼序列上设计黄尾鲴微卫星引物对，所述引物对的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO：9-10，使用引物对扩增基因组DNA，获得黄尾鲴个体微卫星扩增产物；

步骤（3）：扩增产物电泳：采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Goldview染色分型；

步骤（4）：遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENPOP Version 3.4 计算遗传多样性参数。