KR101639764B1

KR101639764B1 - 변이 폴리뉴클레오타이드 및 이를 이용한 벼 유전자원 판별방법

Info

Publication number: KR101639764B1
Application number: KR1020130096888A
Authority: KR
Inventors: 박용진
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2013-08-14
Publication date: 2016-07-15
Also published as: KR20150020451A

Abstract

본 발명은 벼 유전자원을 판별하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벼 식물의 아밀로스 함량과 관련성이 알려지지 않은 유전자 및 상기 유전자의 변이를 포함하는 단일염기다형을 사용하여 신속하고 정확하며 간단히 판별할 수 있는 벼 유전자원 판별방법에 관한 것이다.

Description

변이 폴리뉴클레오타이드 및 이를 이용한 벼 유전자원 판별방법{Variation polynucleotide and discrimination method for rice genetic resource using the same}

전분(starch)은 쌀, 옥수수 및 감자를 포함하는 많은 식물에서 중요한 저장성 다당류이며, 일반적으로 D-글루코스 동종중합체(D-glucose homopolymers)인 아밀로오스(amylose)와 아밀로펙틴(amylopectin)으로 구성된다. 아밀로오스는 선형 α-1,4 글루칸 쇄로 이루어지며, 아밀로펙틴은 α-1,6 결합에 의해 연결된 선형 α-1,4 글루칸쇄로 이루어진 분지된 분자이다. 아밀로펙틴의 구조는 전분 입자의 결정구성(crystalline organization)에 기여하고 좋은 아밀로펙틴 클러스터들은 종자(seed)의 가장 큰 부분을 이루는 알맞은 배유(endosperm) 전분을 형성하는데 기여한다.

전분합성효소(SS)는 글루칸 사슬의 비환원 말단(non-reducing end)에서 ADP 글루코스(ADPGlc)의 글루코실 유닛(glucosyl unit) 전이를 촉매함으로써 선형 글루칸 사슬을 합성한다. 가지화효소(BE)는 폴리글루칸(polyglucan) 사슬에서 α-1,6 glucosidic 결합의 형성을 촉매하는 유일한 효소이며, 비가지화효소(DBE)는 폴리글루칸의 α-1,6 glucosidic 결합을 가수분해하는 것으로 알려져 있다.

고등식물에서는 5개의 전분합성효소, 1개의 GBSS(granule-bound starch synthase)와 4개의 가용성(soluble) 전분합성효소가 동정되었다. GBSS는 아밀로오스 사슬을 합성하며, GBSSI은 저장 조직에서, GBSSⅡ는 비저장 조직에서의 아밀로오스 합성에 관여한다. 많은 연구에서 고등식물의 가용성 전분합성 효소는 4가지 그룹의 형태(SSI ~ SSIV)를 가지며 각각 여러 동형체(isoforms)를 가진다고 보고되어 있는데, 그 중 벼(Oryza sativa)에서는 OsSSI, SSⅡs(OsSSⅡa, OsSSⅡb, OsSSⅡc), SSⅢs(OsSSⅢa, OsSSⅢb) 및 SSIV(OsSSⅣa, OsSSⅣb)으로 8개의 동형체들이 보고되어 있다. 대부분의 OsSS 동형체들은 배유에서 발견되었으며, 이들은 종자 발달에 있어 유전자 발현 패턴을 바탕으로 초기(early), 후기(late) 및 모든 시기(steady expressers)의 세 그룹으로 나뉜다. 벼 종자 배유에서 발달 진행은 전저장기(pre-storage)와 전분필링기(starch filling phase)로 구성된다.

쌀 (Oryza sativa L.)은 개발도상국에서 가장 중요한 곡물 작물이며, 넓은 지역에서, 특히 전세계의 약 90%를 아시아에서 생산하고 있다.

전분은 식품, 제지 및 화학 산업에서 널리 사용되고 있다. 전분의 물리적 구조는 식료품 및 비식료품 또는 공업 제품에 대한 전분의 영양 및 취급 특성에 대하여 상당한 영향을 미칠 수 있다. 특정의 성질은 아밀로펙틴 쇄 길이 분포, 결정화도 및 결정화 유형, 물성, 예컨대 젤라틴화 온도, 점도 및 팽윤 부피를 비롯한 전분 구조의 표시로서 취급될 수 있다. 아밀로펙틴 쇄 길이에서의 변화는 아밀로펙틴의 변경된 결정화도, 젤라틴화 또는 노화의 지수가 될 수 있다.

전분 조성, 특히 높은 아밀로스 함량과 관련될 수 있는 난소화성 전분으로 지칭되는 형태는 장 건강, 특히 대장 건강에 대하여 매우 중요한 의미가 있다. 따라서, 아밀로스 전분은 장 건강을 촉진하는 수단으로서 식료품에 사용하기 위한 옥수수 및 보리와 같은 특정의 곡류에서 개발되어 왔다. 난소화성 전분의 이로운 효과는 장 미생물총이 발효되어 특히 단쇄 지방산을 형성하는 에너지원을 제공하는 대장에 영양분을 제공하는 것에서 유래한다. 이러한 단쇄 지방산은 결장세포에 대한 영양분을 제공하며, 대장을 통하여 특정의 영양분의 섭취를 증가시키고, 결장의 생리적 활성을 촉진한다. 일반적으로 난소화성 전분 또는 기타의 식이 섬유가 제공되지 않을 경우, 결장은 대사가 상대적으로 불활성이 된다.

하지만, 전분 합성과 관련된 벼 유전자원을 신속하고 정확하며 간단히 판별할 수 있는 방법은 알려져 있지 않아 판별방법의 개발이 요구되는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 벼 유전자원 판별에 이용될 수 있는 변이된 벼 식물 유래 유전자를 제공하고, 이를 이용한 벼 유전자원 판별방법을 제공하려는 목적이 있다.

상술한 바와 같이, 아밀로스 함량에 따라 벼에 대한 선호도가 달라질 수 있다. 따라서, 아밀로스를 다량 함유하는 쌀을 수확할 수 있는 벼를 판별하는 방법은 매우 중요하다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 뉴클레오타이드에 12bp의 뉴클레오타이드가 삽입된 것을 포함하는 결실다형; 및 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형; 를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 벼 식물에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 벼 시료에서 핵산분자를 분리하는 1 단계; 및 상기 1단계에서 분리한 핵산분자에서 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 2 단계; 를 포함하고,

상기 뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 내지 117번째 뉴클레오타이드가 결실된 유전자형 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형을 포함하는 벼 유전자원 판별방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 2단계는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산분자를 증폭하여 실시하는 것이고,

상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 내지 117번째 뉴클레오타이드가 결실된 유전자형; 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형;을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 2단계에서 뉴클레오타이드의 염기타입 확인이 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 118 번째 뉴클레오타이드인 G/T인 이형유전자형; 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드에 해당하는 뉴클레오타이드가 A/G인 이형유전자형;을 확인하여 수행하는 것일 수 있다.

나아가, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 뉴클레오타이드에 12bp의 뉴클레오타이드가 삽입된 것을 포함하는 결실다형; 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형; 를 포함하는 아밀로스 함유 벼 판별용 프로브를 제공한다.

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.

본 발명의 "표지 또는 분자표지"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미한다. 이 용어는 또한 표지 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 사용되는 핵산과 같은 표지 서열에 상보적인 핵산 서열에도 포함하는 의미이다. 또한, 분자표지의 유전지도상의 위치는 유전자좌로 일컬어진다.

또한, 본 발명의 "단일염기다형(SNP; single nucleotide polymorphism)"은 대립 유전자좌로부터 얻은 염기서열의 배열에서 관찰되는 아데노신(A), 구아노신(G), 티미딘(T), 시토신(C) 염기의 상호 치환에 의해 나타나는 다형성을 의미한다. 나아가, SNP을 이용하여 개발한 분자표지는 SNP 표지로 통상적으로 일컬어진다.

더불어, 본 발명의 "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함함을 의미한다.

또한, 본 발명의 "핵산분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.

나아가, 본 발명의 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 500 내지 1,200bp의 길이로서 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적일 수 있다.

더불어, 본 발명의 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는 단일가닥의 프로브가 혼성화에서의 최대 효율을 보일 수 있다.

또한, 본 발명의 "동형 유전자형 (homozygotic genotype)"은 뉴클레오타이드 변이 위치에 해당하는 상동 염색체(homologous chromosome)상의 대립형 염기(allelic base)가 서로 동일한 염기인 경우를 의미한다.

나아가, 본 발명의 SNP 변이 위치에서의 "이형 유전자형 (heterozygotic genotype)" 란 뉴클레오타이드 변이 위치에 해당하는 상동 염색체상의 대립형 염기가 서로 다른 염기인 경우를 의미한다.

더불어, 본 발명의 "유전자원"은 유전형질과 변이의 자원을 의미하는 것으로, 식물의 육종에 필요한 소재로 사용할 수 있는 유전자를 가지는 자원을 의미한다.

본 발명은 종래에 벼 식물의 아밀로스 함량과의 연관성이 밝혀지지 않았던 벼 유래 유전자 및 상기 유전자에 아밀로스 함량과 연관성이 있는 부위를 밝혀내었다. 또한, 상기 유전자를 변형시킨 분자마커를 개발하여 다양한 벼 유전자원에서 아밀로스 함량과 관련된 유전자를 신속하고 정확하게 선발하는데 활용될 수 있다.

도 1은 준비예에서 사용한 식물 시료 정보이다.
도 2는 실시예 1에서 제작한 86개의 서열 변이 유전자에 관한 정보이다.
도 3은 실시예 2에서 측정한 AC, SB, TV, PV, BDC 및 FV 값이다.
도 4는 실시예 3에서 계산한 염기 서열 변이의 빈도값이다.
도 5는 실시예 3에서 계산한 유전적 분석값의 결과이다.
도 6은 실시예 5에서 측정한 대립유전자 영향 결과 그래프이다.
도 7은 실시예 5에서 측정한 대립유전자 영향 결과 그래프이다.
도 8은 실시예 5에서 측정한 대립유전자 영향 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 벼 유전자원 판별에 이용될 수 있는 변이된 유전자 및 이를 이용한 아밀로스 함량과 관련성이 있는 벼 유전자원 판별방법이 요구되는 실정이다.

이에 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 뉴클레오타이드에 12bp의 뉴클레오타이드가 삽입된 것을 포함하는 결실다형; 및 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형; 를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하여 아밀로스 함량과 관련성이 있는 폴리뉴클레오타아드를 이용하여 벼 유전자원 판별방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 변이된 유전자는 벼 식물에서 유래된 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 일부 부위의 변이를 일으킨 것을 포함할 수 있다. 상기 일부 부위의 변이는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 뉴클레오타이드에 12bp의 뉴클레오타이드가 삽입된 것을 포함하는 결실다형; 및 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드가 치환된 단일염기다형;를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 하기 표 1 같이 약어로 기재하였다.

IUPAC-IUB 명명	약어	IUPAC-IUB 명명	약어	IUPAC-IUB 명명	약어
알라닌	A	글라이신	G	프롤린	P
아르기닌	R	히스티딘	H	세린	S
아스파라긴	N	이소루신	I	트레오닌	T
아스파르트산	D	루신	L	트립토판	Q
시스테인	C	리신	K	티로신	Y
글루탐산	E	메티오닌	M	발린	V
글루타민	Q	페닐알라닌	F

또한, 상기 유전자는 식물에서 유래된 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 벼 식물에서 유래된 것일 수 있다.

나아가, 본 발명은 벼 시료에서 핵산분자를 분리하는 1 단계; 및

상기 1단계에서 분리한 핵산분자에서 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 2 단계; 를 포함하는 벼 유전자원 판별방법을 제공한다.

상기 뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 내지 117번째 뉴클레오타이드가 결실된 유전자형 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형을 포함하는 것일 수 있다.

상기 1단계의 벼 시료에서 핵산분자는 통상적으로 식물체에서 핵산분자를 분리하는 부위, 예를 들면 벼의 잎, 벼의 줄기, 벼의 뿌리, 벼의 종자 또는 벼의 겨에서 분리할 수 있으며, 바람직하게는 벼의 잎에서 분리할 수 있다.

또한, 상기 1단계의 벼 시료에서 핵산분자를 분리하는 방법은 통상적으로 식물체에서 핵산분자를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, CTAB 반응(cetyltrimethyl ammonium bromide reaction)을 이용할 수도 있고, 식물 전용 DNA 추출 키트(예를 들면, 독일 소재 Macherey-Nagel사 NucleoSpin DNA extract kit 제품)를 이용할 수도 있다.

나아가, 상기 2 단계는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)) 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA)는 서열변화가 단일-가닥 분자 내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는데, SSCA는 이 밴드를 검출하는 방법이다. 또한, 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출하는 방법이다. 나아가, 이 외의 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용될 수 있다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰될 수 있다.

또한, 혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석을 활용할 경우, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 이러한 기술에서 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정할 수 있다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 완전히 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 105 및 118번째 뉴클레오타이드 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 134번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 뉴클레오타이드에 상보적인 염기를 가질 수 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 뉴클레오타이드에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 2단계는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 105번째 및 118번째 뉴클레오타이드; 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드;를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산분자를 증폭하여 실시할 수 있다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법 중 PCR이란, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 2단계에서 뉴클레오타이드의 염기타입 확인이 1단계에서 분리한 핵산분자와 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 118 번째 뉴클레오타이드인 G/T인 이형유전자형; 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 A/G인 이형유전자형;을 확인하는 것일 수 있다.

만약, 상기 뉴클레오타이드 염기타입 확인이 상기 조건(이형유전자형 또는 동형유전자형)에 부합할 경우, 아밀로스를 함유하는 벼 유전자원일 확률이 높다고 판단할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 뉴클레오타이드에 12bp의 뉴클레오타이드가 삽입된 것을 포함하는 결실다형; 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형; 를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 아밀로스 함유 벼 판별용 프라이머를 제공한다.

상기 프라이머는 통상적으로 아밀로스를 다량 포함하는 벼를 판별하는 용도라면 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머를 이용하여 벼 시료 DNA의 증폭반응을 수행하여 벼 시료의 아밀로스 함유 여부를 판별할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실시예 ]

준비예 . 식물시료 준비 및 DNA 추출

본 발명에서 사용한 식물 시료는 도면 1에 나타낸 것과 같이 104점의 수집자원을 사용하였다. 상기 수집자원은 한국 농촌진흥청의 유전자 은행으로부터 제공받았고, 상기 식물 시료는 공주대 농장에서 재배하였다. 이후 재배한 식물 시료의 종자를 수획하여 -80℃에서 저장하여 숙성하였다.

상기 숙성된 식물종자의 게놈 DNA는 세틸트리메틸암모니윰 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide; CTAB) 방법을 사용하여 추출하였다.

실시예 1. 변이 서열 제조

본 실시예에서는 벼 종자에서 전분 합성에 중요한 10개의 유전자(AGPase 6ro, GBSSI, SSSⅡa 및 SSSⅡa-like gene)를 선발하여 하기 표 2에 나타냈다. 상기 10개의 유전자에 대한 앰블리콘(amplicon)은 블라이스엔(blastn)을 이용하여 NCBI 데이터베이스 탐색을 통해 선택했었다. 또한, 상기 10개의 유전자에 대한 프라이머는 연관 게놈 서열 분석을 이용하여 NCBI 데이터베이스로부터 디지인하였고, 디자인된 프라이머는 하기 표 2에 나타냈다.

상기 표 2의 Tm은 녹는점이고, Gene locus는 쌀 게놈 어노테이션 프로젝트(rice genome annotation project)로부터 부여된 것(Pseudomolecules version 6.1, http://rice.plantbiology.msu.edu/)이다.

H-타큐 DNA 중합효소(H-Taq DNA polymerase, 한국 대전 소재 Solgent사 제품)를 사용하여 진프로 서말 사이클러(GenePro Thermal Cycler; 중국 광저우 소재 Bioler사 제품)에서 PCR을 수행하였다.

상기 PCR은 2.5 ㎕의 H-Taq 버퍼(10×), 0.5 ㎕의 dNTP(10mM; 한국 대전 소재 Solgent사 제품; dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 포함), 상기 표 2의 후방 프라이머(10pmol) 1.0 ㎕, 상기 표 2의 전방 프라이머(10pmol) 1.0 ㎕, 0.25 ㎕의 H-Taq DNA polymerase, 준비예에서 수득한 게놈 DNA(50ng/㎕) 1.0 ㎕ 및 18.75 ㎕의 초순수 물(deionized distilled water)을 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 95 ℃에서 15분 동안 초기변성(pre-denaturation) 과정을 수행한 후, 95 ℃에서 20초 변성(denaturation), 40초 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 증폭(extension), 이때 변성에서 증폭 과정은 40회 반복 수행하였으며, 72℃에서 3분 최종 증폭(final extension) 과정을 수행하여 증폭된 DNA를 제조하였다. 증폭된 DNA는 PCR 정제 키트(한국 대전 소재 Solgent사 제품)을 사용하여 정제한 후 한국 대전 소재 솔젠트사(Solgent Co. Ltd)에 보내서 분석하였다. ABI 3730 sequencing platform(미국 소재 applied biosystem사 제품)을 이용하여 서열분석하였다. 레어 대립유전자(rare allele)는 정제된 증폭 산물을 첨가하여 다시 서열분석을 진행하였다.

상기 10개의 유전자에 대한 PCR 반응을 통해, 증폭 산물의 길이는 377bp(OsAGPS2)에서 834bp(OsPUL3) 범위를 가지는 것을 알 수 있었다.

또한, 86개의 서열 변이(sequence variation)를 갖는 10개 유전자 서열 중 9개의 증폭 DNA로부터 발견하였고, 79개의 단일염기다형(SNP), 6개의 삽입결실다형(InDel) 및 SSR(simple sequence repeat)을 제작하였다. 제작한 86개의 서열 변이는 도면 2 및 하기 표 3에 나타냈다.

표 3에서 확인되는 바와 같이, 대부분의 SNP는 A/G(39.53%) 또는 C/T(34.88%)의 염기 전이 치환(transition substitution)을 포함하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 표현형 조사

아밀로스 함량(Amylose content; AC)은 Cho et al.(2008)가 제안한 비색정량분석(colourimetric)에 바탕을 둔 방법을 사용하여 수행하였다. 또한, RVA(rapid viscosity analysis)은 Rapid ViscoAnalyser 기계(serial-3; 오스트레일리아 소재 Newport Scientific사 제품)를 이용하여 측정하였다.

RVA 분석을 위해, 전분은 준비예에서 수득한 숙성된 식물종자에서 Rapid ViscoAnalyser 기계를 사용하여 분리하였다. 분리한 전분 3g은 점도계 테스트 통(viscometer test canister)에서 25 ㎖ 증류수에 녹여 사용하였다. 시간-온도 레지먼(regimen)은 50 ℃에서 1분, 이후 50 ℃에서 95 ℃까지 4.7 분 동안 가열하고, 95 ℃에서 2.5 분 동안 유지하였다. 이후 3.7 분 동안 50 ℃까지 냉각하고, 50 ℃에서 2 분 동안 유지하여 수행하였다.

또한, RVA 파라메터 측정은 상기 준비예의 104개 식물 시료의 벼의 최고 점도(peak viscosity; PV), 최저 점도(trough viscosity; TV), 강하 점도(breakdown viscosity; BDV = PV-TV), 최종 점도(final viscosity; FV), 치반 점도(setback viscosity; (SBV = FV-PV) 및 호화개시 온도(pasting temperature; PT)를 계산하여 수행하였다.

측정한 AC 및 RVA는 표 4 및 도 3에 나타냈다.

표 4에서 확인되는 바와 같이, 서로 간의 상관관계 중, 이들 중의 절반 이상은 P < 0.01이다. 또한, PV는 TV(0.879) 및 FV(0.759)와 중요한 정적 상관(positive correlation)을 보였다. 나아가, FV와 TV 사이의 연관성(0.911)은 가장 중요한 정적(positive)으로 정의되고, SBV와 BDV 사이의 연관성(-0.715)은 가장 중요한 음의 상관관계(negative correlation)을 보였다.

실시예 3. 염기 서열 변이의 유전적 분석

염기 서열 변이의 발견을 위해, 시퀀스 분석 소프트웨어(Sequence Analysis software v. 5.4 ; Applied Biosystems사 제품)을 베이스 콜링(base calling) 및 시퀀스 마스킹(sequence masking)으로 사용하였고, Variant Reporter(v. 1.1 ; Applied Biosystems사 제품)는 시퀀스를 정리하고(aline) 변이를 찾기 위해 사용했다.

기본 통계는 각 유전자 자리에서 다양성을 측정하기 위해, Power-Marker genetic analysis package(v. 3.25; Liu & Muse, 2005)을 사용하여 계산하였고, 상기 기본 통계에서는 변이 빈도(variation frequency), 유전자 다양성(gene diversity) 및 동질 이성체 정보 내용(polymorphism information content; PIC)을 계산하였다.

관찰된 이형접합성(observed heterozygosity; Obs_Het), 예상 이형접합성(expected heterozygosity; Exp_Het) 및 섀넌의 정보 인덱스(Shannon? information index; I)는 POPGENE 소프트웨어(v1.32; Yeh and Boyle, 1997)를 사용하여 계산했다.

상술한 바와 같이 계산한 유전적 분석값은 도면 4 및 도면 5에 나타냈다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 드문 변이(rare variation; frequency < 0.05)는 21.51 %였고, 보통의 변이(common variation; 0.05 < frequency < 0.2) 및 자주 일어나는 변이(abundant variation; frequency > 0.2)는 각각 6.39 % 또는 72.10%인 것을 확인하였다. 이 결과는 드문 변이 및 자주 일어나는 변이의 비교적 큰 비율의 존재를 확인할 수 있었다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 이형접합성 대립유전자(heterozygosity allele)의 빈도는 드물게 확인되었지만 존재했다. 또한, 관찰된 이형접합성(observed heterozygosity; Obs_Het)의 평균은 이형접합성 손실(heterozygosis deficit)을 포함하는 예상 이형접합성(expected heterozygosity; Exp_Het)의 평균보다 낮은 것을 알 수 있다. 상기 이형접합성 손실은 근친교배(inbreeding) 등을 통해 유발될 수 있다. 나아가, 모든 변이 유전자 자리에 대한 일반적인 다양성(genetic diversity; GD)은 0.019 ~ 0.4936 범위 내에 나타났고, 평균 일반적인 다양성은 0.2256으로 확인되었다. 더불어, PIC 값은 0.0189 ~ 0.3718 범위에서 나타났고, 평균값은 0.1848이었다. 또한, GD 및 I의 넓은 범위는 여러 층의 유전되는 변이를 나타내는 결과였다.

실시예 4. 연관성 분석

AC 및 RVA와 염기 서열 변이의 상관관계는 일반적인 선형 모델(general linear model; GLM) 및 혼합된 선형 모델(mixed linear model; MLM)을 사용하여 계산하고, 상기 계산은 Yu et al.(2006)에서 제안된 TASSEL 프로그램(v2.1; Bradbury et al., 2007)을 사용하였다. 비논리적인 상관관계의 가능성 제거를 위해, 집단 구조 매트릭스(population structure matrix, Q matrix) 및 상대적인 킨쉽 메트릭스(relative kienship matrix; K matrix)를 계산했다. k = 4일 때 스트럭처 프로그램(structure program, v. 2.3.3 ; Hubisz et al., 2009)의 계산을 통해 정의된 Q 매트릭스는 SPAGeDi 1.2g software (Hardy and Vekemans, 2002)에서 최적화하였다.

특성(traits)에 대한 마커-특성 상관관계(P < 0.001)는 36개의 변이 유전자 자리를 제거한 후 드문 빈도(rare frequency)와 함께 50개의 변이 유전자 자리에서 TASSEL 프로그램을 이용하여 계산하였다. 4개의 상관관계는 3개의 유전자 자리 및 3개의 특성 인덱스(trait indices) 사이에서 GLM 및/또는 MLM를 측정하였다. 상기 3개의 유전자 자리 및 4개의 상관관계는 하기 표 4에 나타냈다.

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 유전자 OsAGPL4의 1번째 엑손에서의 12-bp 삽입결실(TCCGCCGCCGCC) 유전자는 BDV와 P < 0.001의 GLM 및 MLM 사이에서 유의적으로 상관관계가 있었다. 또한, OsAGPS1 유전자의 3번째 엑손의 133번째 뉴클레오티아드의 아스파라긴(asparagine)으로부터 아스파르트 산(aspartic acid)으로 아미노산(amino acid)가 인코딩된 결과로 보여지는 A/G 변이를 포함하는 SNP는 AC(P < 0.001, GLM 및 MLM 모델에서) 및 FV(P < 0.001, MLM 모델에서)와 유의적으로 상관관계가 있었다.

실시예 5. 대립 유전자 영향

대립 유전자 영향을 확인하기 위해 집단구조(population structure)분석을 수행하였다. 상기 집단 구조 분석은 하기 방법을 사용하였다.

베이즈 클러스터링 알고리즘(Bayesian clustering algorithm)은 유전적으로 비슷한 각각의 클러스터(cluster) 추론하고, 상기 준비예 1의 104개 샘플에서 STRUCTURE v2.3.3 프로그램(Pritchard et al., 2000)과 클러스터 사이의 유전적 혼합(genetic admixture) 비율 테스트를 수행하였다. 또한, 100,000번 반복의 초기 시험 기간(Burn-In Period)이 적용된 STRUCTURE의 복제 실행하여 추정치를 얻은 후 200,000번 반복을 추가 실행하였다. 상기 STRUCTURE의 결과 그래프는 Graphics Layout Engine 4.2.3b로 작성하였다. 작성된 결과 그래프는 도면 6 내지 8에 나타냈다.

도 6 내지 8을 통해 확인할 수 있듯이, 높은 유의적 상관관계(P < 0.001)와 함께 변이에 관하여, 대립 유전자 영향은 Pop 2 및 Pop 3에서 하위집단 특정 패턴(subpopulation-specific pattern)을 보였다.

도 6을 통해 확인할 수 있는 것과 같이, OsAGPL4에서 1번째 엑손(exon)에서 4개의 아미노산(Ser-Ala-Ala-Ala) 부호화한 106번째 ~ 117번째 뉴클레오타이드(TCCGCCGCCGCC) 사이의 12-bp 삭제(deletion)는 BDV에서 현저한 감소와 상관관계가 있었다. 상기 상관관계와 삭제는 Pop 1에서만 발견되었다.

도 7 및 도 8을 통해 확인할 수 있는 것과 같이, OsAGPS1 3번째 엑손에서 133번째 뉴클레오타이드의 아스파라긴(asparagine)으로부터 아스파르트 산(aspartic acid)으로 아미노산(amino acid)으로의 변화는 약간의 AC 증가에 관련이 있었던 것(도 7)과 약간의 FV 감소에 관련이 있었던 것(도 8)을 알 수 있었다. 또한, AC 및 FV의 차이의 발견을 통해서, A와 G의 상관관계의 존재는 Pop 4보다 Pop 3, Pop 1 및 Pop 2에서 확인할 수 있었다.

준비예 및 실시예를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 유전자 변이 중 OsAGPS1 유전자의 3번째 엑손 중 133번째 뉴클레오타이드의 변이 및 OsAGPL4 유전자 1번째 엑손 중 106번째 뉴클레오타이드에 12bp의 뉴클레오타이드가 삽입된 것을 포함하는 결실 염기 변이가 벼의 아밀로스 함량과 연관성이 깊은 것을 확인하였다. 이로 인해 이 부분을 이용하여 미질과 관련하여 수집된 자원을 평가 및 선발할 수 있는 장점이 있고, 위 변이 부분을 통해 향후 마커 개발을 통하여 보다 쉽게 자원을 평가하고 선발하여 분자육종 기반의 미질특성에 관련된 신품종 개발에 활용할 수 있다.

<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Variation polynucleotide and discrimination method for rice genetic resource using the same <130> 1039750 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1501 <212> RNA <213> Oryza sativa <400> 1 caaatgcatg acgaaatgtg cgtgtaaaca ctgtaaagaa aggataatgt gatttgatta 60 ccgcgggctt ggccctggtc cgcgtgagag ggaagaggcg cgtgccggcg ccgccgccga 120 ggatgatgga cgccaccgtg tccggcccca cgtccctccg cgccgccgcc gccgccgctg 180 gctcgaccgc atccgcctgc tccaccttgg cacaccaaaa cacaaaacca aaccaatgaa 240 tccgcaccca acgcacagga gatcagctca cgcaatccca acacgcacgc acgcgcgcac 300 gcgcgaacac ggagctagcc agccacctac cttgagcccc ttgggcgctt cggcgaggac 360 gcagctggcg gcggcggcgg aggcggcggc cgtgcggcgg agcgcggcga cgcgcgagcg 420 gcacctggcg ggcgggcggg ggggcgccgc cgccgccgtg gtggcggccc acgagcaggt 480 cgccattggc ggacgcggga aggttctaga agggcgaagg tggcggagta ggagagggga 540 ggggagagtg gtttgatcga ggaagggggg gttttgcaag gggaagggcg cagatcggga 600 cgatgggccg agaagagtgg ggaggcgcga gttacgaggg cagcggggtg ggcggtgggg 660 aggtgctttg acccggccgc ccctcgcatc caccgtccgt tttgcatcct gacatgcagg 720 ccacatgtcc ccgaactacg aggttcacaa ggttcttgca catacggtac tcgctccatt 780 ccaaatttaa gtatacagga tttgtgtact agatttattt tagaaagaaa agaatatata 840 atttataact tttaatatat tgttaactga tttttttatg tacttcctgt atactccctc 900 cacccaaaaa ctcaatttct aaatttgaat ttcgtcctat aaaaaaatca acttcaatat 960 catatctacc cttaacatat aaaacgataa attttatttc tttaataccc tttgcctacc 1020 tatcaccatt actatttttt ttcatattgt caaacaaaaa atacttatgt gggggaacgg 1080 tagtagaggt ggcgaggatt tggtattttt attataactt gttaaatttg aacttgtata 1140 ttcgtgaagt gatatgtttc atactaattt atcacctcca tcccaaaata agtgcagccg 1200 tgggaatccg tatccaacgt ttgaccgtcc gtcttattta aaaaaattat gaaaaagtta 1260 aaaaaaaagt cacatataaa gtccaattca tgttttatca tctaataaaa aatactaatc 1320 ataaaaaatt ttaaataagg caaatggtca aacgttggac atgaacagtg caaaactaca 1380 tttattttga gacggaggga gtatcgtact aattttataa tttgttaatg attatttatg 1440 tgacatgtaa ggccatggcc aacgctccac actagagcgt ggtctcacca ttcccgacgc 1500 g 1501 <210> 2 <211> 909 <212> RNA <213> Oryza sativa <400> 2 cctacagcat gaactgagag aaggataaaa attccctaca tgctacaagt ttcaagagca 60 tagcgtaccc tcattccaat ttctgttgct ccaggaataa cctcgcttcc aaagtcattt 120 gcagcaggga aattttgacg gagaagctta agcatcacat ctttgctaaa aacatagatt 180 cccatactag caatgtaagg caattccttt gccctctcag tatcaaggcc aagtatggta 240 gtgtcaacct gcaagatcaa aacatgcaga caatcactga aatgtatgct tcaacagatc 300 aggttgcata tggtctcaac ggatgactca tcaattacca tcattgattt caacttctct 360 ccttttggct tttctgcaaa ttcaatgatc ctcccttcat catcaatctt cataaggcca 420 aatgctgtag cacgttcttc atccatgggc agcgcagcaa cggttatatc agcatttgtt 480 tctctgtggg cctgaatgaa cttttggtag tccatacggt acaggtgatc tccagccaaa 540 atgagaaact ccataacatt gtgttcctca aatagccata agtattgtcg cacagcatct 600 gcagtaccct gagacagaaa gaaacaaaat aaattaggca gcgtccttaa ggtattgtca 660 tacagaaacc atataacatg aaagttggta acctaagagc tcatctatca atgttaactc 720 tagtttgcaa ttccaaagaa atcattggaa catctaaact agtgaacagt ttcacttaac 780 tataaatgtg agaaaatatg gaagagtgaa tcaacaggag tacattaacc ctaatatttc 840 ttttgttccg taaaacaggg tgtatgttca tattaattat gtatcccctt cttttctttg 900 taccctata 909

Claims

서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 내지 117번째 뉴클레오타이드가 결실된 유전자형; 및
서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형;
를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 벼 식물에서 유래된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
벼 시료에서 핵산분자를 분리하는 1 단계; 및
상기 1단계에서 분리한 핵산분자에서 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 2 단계; 를 포함하고,
상기 뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 내지 117번째 뉴클레오타이드가 결실된 유전자형 또는
서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형을 포함하는 벼 유전자원 판별방법.
제3항에 있어서, 상기 2단계는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산분자를 증폭하여 실시하는 것이고,
상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 내지 117번째 뉴클레오타이드가 결실된 유전자형; 또는
서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형;을 포함하는 벼 유전자원 판별방법.
제3항에 있어서, 상기 2단계에서 뉴클레오타이드의 염기타입 확인이 1단계에서 분리한 핵산분자와
서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 118 번째 뉴클레오타이드인 G/T인 이형유전자형; 또는
서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드에 해당하는 SNP가 A/G인 이형유전자형;
을 확인하는 것인 벼 유전자원 판별방법.
서열번호 1로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 1의 106 번째 내지 117번째 뉴클레오타이드가 결실된 유전자형; 또는
서열번호 2로 표시되는 유전자의 엑손(exon) 3의 133번째 뉴클레오타이드인 A가 G로 치환된 단일염기다형;
를 포함하는 아밀로스 함유 벼 판별용 프로브.