KR20220150634A - 벼의 아밀로스 함량을 조절하는 esp2 유전자의 유전형 판별용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별용 프라이머 세트 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

벼의 아밀로스 함량을 조절하는 ESP2 유전자의 유전형 판별용 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating genotype of ESP2 gene regulating amylose content in rice and uses thereof}
본 발명은 벼의 아밀로스 함량을 조절하는 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
아밀로스 함량 및 저항녹말(resistant starch) 함량과 같은 전분 관련 형질에 대한 연구는 잠재적인 곡류의 건강상의 이익 때문에 큰 관심을 받고 있다. 벼에서 아밀로스 함량은 유전적 요인 및 재배적·환경적 요인에 의해 조절된다. 아밀로스 함량을 조절하는 주요 유전자는 벼 6번 염색체의 단완에 위치하는 Wx (waxy) 유전자로 Wxa, Wxb, wx 등 5개의 복대립유전자가 보고되었으며, 이들 변이들은 인트론과 엑손의 염기서열변이로 인해 GBSS1 (Granule-bound starch synthase 1) 단백질의 변형을 유도하는 것으로 보고되었다(Zhou et al., J. Integr. Agric. 2015;14(6):1153-62).
한편, 한국공개특허 제2015-0020451호에는 벼 식물의 아밀로스 함량과 관련성이 알려지지 않은 유전자 및 상기 유전자의 변이를 포함하는 단일염기다형을 사용하여 신속하고 정확하며 간단히 판별할 수 있는 방법에 관한 '변이 폴리뉴클레오타이드 및 이를 이용한 벼 유전자원 판별방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0005831호에는 변이 OsBEⅡb 유전자를 이용한 '벼 유전자원 판별방법 및 아밀로스 함유 벼 판별용 프라이머'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '벼의 아밀로스 함량을 조절하는 ESP2 유전자의 유전형 판별용 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 아밀로스 함량 및 저항녹말 함량에 큰 차이가 있는 non-waxy 자포니카 품종인 도담쌀과 화영벼 교배집단을 이용한 유전분석을 통해 염색체 11번에서 아밀로스 함량을 조절하는 QTL (quantitative trait loci)을 탐지하였고, 이를 qAC11로 명명하였다. 또한, 도담쌀과 화영벼의 전염기서열 분석 결과, 염색체 11번 지역에 아밀로스 함량 조절에 관여하는 후보 유전자로 ESP2를 지정하였고, ESP2 유전자 염기서열을 분석한 결과 화영벼와 도담쌀 간에 아미노산 변화를 유도하는 다수의 염기 돌연변이가 관찰되었다. 상기 변이를 확인하기 위해 2개의 프라이머 세트를 제작하고 이를 검증한 결과 상기 2개의 마커가 화영벼와 도담쌀의 ESP2 유전형을 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼의 ESP2 유전자의 유전형 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 자원의 시료에서 총 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼의 ESP2 유전자의 유전형 판별 방법을 제공한다.
현재까지 자포니카 벼에서 아밀로스 함량을 조절하는 유전자는 Wx 유전자 외에는 연구 보고가 없었다. 따라서, 본 발명에서 확인된 ESP2 유전자는 자포니카 벼의 아밀로스 함량을 조절하는데 효과적으로 활용될 수 있고, ESP2 유전자의 유전형을 판별할 수 있는 분자표지는 육종연구에 이용되어 정확하게 원하는 유전자형을 가진 유망 계통을 선발하는데 도움이 될 수 있을 것이다. 또한, 분자표지를 이용하면 벼 유묘를 이용하여 아밀로스 함량을 예측할 수 있기 때문에 종자를 이용하는 것보다 노력과 시간을 절감할 수 있다.
도 1은 도담쌀/화영벼의 교배조합 후대 계통에서 아밀로스 함량(amylose content, AC)을 조사한 결과이다.
도 2는 도담쌀/화영벼 교배조합 후대 91계통을 이용하여 작성한 유전자 지도 중 아밀로스 함량 조절에 관여하는 3개의 QTLs가 위치하는 염색체를 나타낸다.
도 3은 ESP2 유전자의 구조 및 일품, 화성, 화영 및 도담쌀 간의 염기 변이를 보여주는 그림이다.
도 4는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 도담쌀/화영벼 교배 후대 F2 세대의 ESP2 유전자 유전형을 판별한 결과이다.
도 5는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 16개 벼 품종의 ESP2 유전자 유전형을 판별한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 벼 ESP2 유전자의 5번째 엑손에 위치하는 SNP (single nucleotide polymorphism)에 기반한 CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) 마커로, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 산물이 제한효소 PvuⅡ 처리에 따라 절단되어 108 bp 및 46 bp 크기의 밴드를 생성할 경우 해당 시료는 화영벼 ESP2 유전형을 가진 것으로, 제한효소 처리에 절단되지 않고 154 bp 크기의 단일 밴드가 확인될 경우 해당 시료는 도담쌀(아밀로스 함량이 42.8%인 고아밀로스 가공용 품종) ESP2 유전형을 가진 것으로 판별될 수 있다.
본 발명에서 용어 "CAPS"는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 다형성 PCR (polymerase chain reaction) 산물에 대한 제한효소 처리로 생성된 다형성 단편을 의미한다. 사전에 개체 간에서 염기 서열의 차가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 개체와 절단되지 않는 DNA를 가지는 개체와의 차이를 구별할 수 있으며 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 ESP2 유전자의 첫 번째 인트론에 위치하는 InDel (Insertion/Deletion) 다형성에 기반한 분자마커로, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 산물이 429 bp 크기로 확인되면 해당 시료는 화영벼 ESP2 유전형을 가진 것으로 판별될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(22개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 프라이머 세트가 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 경우, 제한효소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제한효소는 바람직하게는 PvuⅡ일 수 있다.
본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기서열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, 벼 자원의 시료에서 총 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 증폭 산물의 확인 즉, 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머 또는 프로브의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 판별 방법에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계는 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단한 후 절단 산물을 확인하는 단계일 수 있다. PCR에 사용된 프라이머 세트가 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 경우, 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하여 증폭 단계의 산물을 검출할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 PvuⅡ 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
도담쌀과 화영벼의 교배조합으로부터 유래한 92계통의 RIL (recombinant inbred line) 집단은 2017년 및 2018년 충남대학교 실험농장에서 재배하였다. 총 게노믹 DNA는 신선한 잎을 사용하여 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 통해 추출하였다. 구체적으로, 계통 당 10개의 식물체를 사용하여 무작위로 잎을 채취한 뒤 모아서 해당 계통에 대한 하나의 시료로 간주하였다. 계통 당 50 ng/㎕의 DNA 시료를 GBS (genotyping-by-sequencing) 분석에 사용하였다. 서열 비교분석은 부모 계통과 Nipponbare 참조 서열을 사용하여 수행하였다.
2. QTL 검색
QTL IciMapping version 4.1 (Meng et al. 2015, Crop J. 3(3) 269-83)의 ICIM (inclusive composite interval mapping) 방법의 사용과 SMA (single marker analysis)를 조합하여 QTL을 검출 및 확인하였다. 20 cM의 윈도 사이즈로 전후 단계적 회귀 분석(forward-backward stepwise regression) 모델 6을 사용하여 ICIM 분석을 수행하였다. 1,000개의 순열을 계산하여 LOD 임계값 유의 수준(P<0.05)을 측정하였다. QTL 위치는 대상 지역의 최대 LOD 점수(LOD = 2.8)에 배정되었다. QTL 맵핑을 위해서 다양한 분자마커가 사용되었다.
3. 전장유전체 분석(whole-genome sequencing)
전장유전체 재분석은 (주)마크로젠에 의뢰하여 진행하였다. TruSeq Nano DNA 키트를 이용한 부모 라인의 고분자량 게노믹 DNA로부터 샷건 DNA 라이브러리가 준비되었다. 상기 라이브러리는 클러스터 생성에 사용되었다. 본 발명에서는 FastQC V0.11.8 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)을 사용하여 원시 리드(read)의 품질 검사를 실시하였다. 분석 시 편향을 줄이기 위해 어댑터 서열과 저품질의 리드의 제거에 Trimmomatic v0.38 (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic)이 사용되었다. 모든 paired-end 시료에 대해 분석이 수행되었다. 데이터를 필터링한 후 Burrows-Wheeler Aligner v0.7.17 (http://bio-bwa.sourceforge.net/)을 사용하여 정상 범위의 리드들을 참조 게놈에 매핑하였다. 시퀀싱에서 얻은 리드들을 매핑하기 위해 Nipponbare (Os-Nipponbare-Reference-IRSP-1.0)를 참조 게놈으로 사용하였다. 생성된 대량 시퀀스 데이터는 유전자 변이를 찾는데 사용되었다. 상기 분석에서 참조 게놈은 NCBI 시퀀스(GCA_001433935.1)를 기반으로 하였다. 매핑 후, Picard (v2.17.2, http://broadinstitute.github.io/picard/))로 중복을 제거하고 SAMTools (http://samtools.sourceforge.net/)로 변형을 식별하였다. 각 변이의 정보는 염색체 또는 스캐폴드별로 조립 및 그룹화되었다. 변이에 의한 아미노산 변화와 같은 주석 정보를 결정하기 위해 SnpEff v4.3t (http://snpeff.sourceforge.net/)를 사용하였다.
4. 아밀로스 함량 측정
아밀로스 함량 측정은 계통 당 5개체로부터 30개의 종자를 모아 해당 개체의 단일 시료로 간주하였다. 각각의 종자는 탈부(dehulling) 및 폴리싱을 수행한 후 미세 분말화하였다. Megazyme assay 키트 (Megazyme Ltd., Ireland)를 사용하여 아밀로스 함량을 측정하였다.
5. 통계 분석
MINITAB 16.2.4 소프트웨어를 사용하여 결과는 0.05의 유의성 수준에서 ANOVA (one-way analysis of variance) 및 Tukey's test에 기반하여 분석하였다. 다중 비교를 위해 Tukey's test이 사용된 반면, 특성 간의 상관 분석을 위해 Pearson의 상관 계수가 수행되었다.
실시예 1. 아밀로스 함량 조절과 연관된 QTLs 분석
도담쌀과 화영벼 그리고, 이들의 교배조합 후대 91계통을 이용하여 아밀로스 함량을 2017년 및 2018년에 걸쳐 조사하였다. 그 결과, 도담쌀의 아밀로스 함량이 화영벼에 비해 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었으며(도 1A), 이들의 교배조합 후대 계통들은 평균적으로 화영벼보다는 높은 아밀로스 함량을 나타내고 있음을 알 수 있었다(도 1B).
상기 도담쌀과 화영벼의 교배조합 후대 계통을 이용하여 유전자 지도를 작성하고, 아밀로스 함량 조절과 연관된 QTL 분석을 수행한 결과, 2번, 6번 및 11번 염색체에서 QTL이 탐지되었다(도 2). 이 중, 11번 염색체의 QTL 지역에 ESP2 유전자가 위치하는 것으로 확인되었다.
실시예 2. ESP2 유전자의 염기 변이에 기반한 분자마커 개발
양친인 화영벼와 도담쌀, 그리고 대표적인 자포니카 벼인 일품벼와 화성벼의 ESP2 유전자 염기서열을 비교하였다. 그 결과, 아미노산 변이를 유도하는 다양한 염기 변이가 관찰되었으며(도 3), 염기서열 변이에 근거하여 3개의 그룹으로 분류되었다(표 1). 도담쌀은 일품벼와 같이 HAP3, 화영벼는 HAP1 그리고 화성벼는 HAP2로 분류되었다. 표 1의 물리적 위치(physical position)는 Nipponbare 참조 서열(Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0)에서 11번 염색체에서의 각 염기 위치를 나타낸다.
Figure pat00001
본 발명자는 상기 변이 중, ESP2 유전자의 5번째 엑손에 위치하는 SNP(G/A, 화영벼/도담쌀)와 첫 번째 인트론에 위치하는 InDel(ATTCG/G, 화영벼/도담쌀)에 근거하여 분자마커를 개발하였다. 특히, 상기 SNP에 기반한 분자마커는 제한효소 PvuⅡ의 인식자리 유무에 의해 CAPS 마커로 개발되었다.
ESP2 유전자의 유전형 판별용 분자마커
염기변이 마커명 염기서열(5'→3') 서열
번호		 예상크기 (bp) 제한
효소
Exon 5
4973180		 ESP2_5-F ctgctttggagaagttcattga 1 108, 46 (화영)
/154 (도담)		 PvuⅡ
ESP2_5-R gaatggagcttttcagagagc 2
Intron 1
4974161		 ESP2_1-F gtgtctaattggataaaccctattc 3 429 (화영)
/- (도담)		 -
ESP2_1-R aaggttggttgcgtcttctggt 4
실시예 3. 분자마커의 검증
개발한 분자마커(표 2)를 이용하여 도담쌀과 화영벼의 교배조합으로부터 유래한 자손세대 및 대표적인 벼 품종들의 ESP2 유전자의 유전형을 분석하였다. 간단하게, 각 시료로부터 게노믹 DNA를 추출하고, 하기 표 3의 조성으로 PCR 반응물을 제조하고, 표 4의 조건으로 PCR을 수행하였다. 그 후, ESP2_5-F 및 ESP2_5-R 프라이머 세트로 증폭한 산물은 1% 아가로스 겔에 로딩한 후 Gel extraction kit를 사용하여 정제한 후 표 5의 조건으로 제한효소를 처리하였다.
PCR 반응물 조성
Component Volume (㎕)
10X PCR buffer 3.0
2.5 mM dNTPs 2.4
Forward primer (10 pmole/㎕) 1.0
Reverse primer (10 pmole/㎕) 1.0
genomic DNA (50 ng/㎕) 1.0
Taq polymerase
(SmartGene Taq Polymerase, Korea)		 0.3
D.W. 21.3
Total 30.0
PCR 반응 조건
Reaction Step Temp. (℃) Time Cycle
Pre-denaturation 95 5 min
Reaction denaturation 95 30 sec 35
annealing 58 40 sec
extension 72 1 min
Final-extension 72 10 min
제한효소 처리 조건
Volume (㎕) Digestion condition
PCR product 8.75 3 hrs at 37℃
→ 2% 아가로스 겔 로딩
Restriction buffer 1.00
Restriction enzyme 0.25
Total 10.0
그 결과, 도담쌀/화영벼의 교배조합으로부터 유래한 자손세대는 도담쌀의 유전형과 동형, 화영벼의 유전형과 동형 및 이형접합성의 ESP2 유전형을 보여주었고(도 4), 도담쌀 동형 및 화영벼 동형의 ESP2 유전형을 나타낸 계통의 아밀로스 함량을 분석한 결과, 하기 표 6에서와 같이 도담쌀의 ESP2 유전형을 나타낸 계통에서 보다 높은 아밀로스 함량을 보여주어, 도 1의 결과 경향과 동일함을 알 수 있었다.
Figure pat00002
또한, 대표적인 자포니카 벼 품종들을 대상으로 ESP2 유전자의 첫 번째 인트론에 위치하는 InDel에 근거한 분자마커를 이용하여 유전형을 분석하였다. 그 결과, 도 5에서와 같이 ESP2 유전자의 유전형이 구분되는 것을 알 수 있었다. 이의 결과를 통해, 본 발명의 두 개의 프라이머 세트를 이용하면 ESP2 유전자의 유전형을 판별할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Molecular marker for discriminating genotype of ESP2 gene regulating amylose content in rice and uses thereof <130> PN21094 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctgctttgga gaagttcatt ga 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaatggagct tttcagagag c 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtgtctaatt ggataaaccc tattc 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaggttggtt gcgtcttctg gt 22

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별용 프라이머 세트 조성물.
  2. 제1항에 따른 프라이머 세트 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별용 키트.
  3. 제2항에 있어서, 제한효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 벼 자원의 시료에서 총 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 총 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼의 ESP2 (endosperm storage protein 2) 유전자의 유전형 판별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계는 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단한 후 절단 산물을 확인하는 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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KR101500613B1 (ko) * 2013-07-05 2015-03-12 공주대학교 산학협력단 벼 유전자원 판별방법 및 아밀로스 함유 벼 판별용 프라이머
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