CN113774150A - 与草鱼果糖-1,6-二磷酸酶相关的5个SNPs标记及应用 - Google Patents

与草鱼果糖-1,6-二磷酸酶相关的5个SNPs标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与草鱼果糖‑1,6‑二磷酸酶相关的5个SNPs标记及应用。所述SNPs标记分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5至少一种所示。本发明发现SEQ ID NO.1标记为CC基因型和/或SEQ ID NO.3标记为AA基因型和/或SEQ ID NO.5标记为AC基因型和/或SEQ ID NO.1标记为CT基因型、SEQ ID NO.3标记为AA基因型、SEQ ID NO.5标记为AA基因型的个体生长性状具有显著优势，利用该SNPs标记简单快速的鉴定快长且体型修长的草鱼，为草鱼分子标记辅助选择育种提供基础。

Description

与草鱼果糖-1,6-二磷酸酶相关的5个SNPs标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及与草鱼果糖-1,6-二磷酸酶相关的5个SNPs标记及应用。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodonidellus)属鲤科(Leuciscinae)、雅罗鱼亚科(Ctenopharyngodon)，在我国有着多年的养殖历史，其肉质鲜美、刺少且养殖产量高，一直深受消费者和养殖户的喜爱。2018年我国草鱼养殖产量达550万吨，占淡水养殖鱼类产量的21％，在我国，拥有草鱼养殖的地区十分广泛，共有30个省(市、自治区)有养殖，而在2018年广东省的草鱼产量最高。天然水体中草鱼身形细长，脂肪含量低，生长缓慢，人工养殖的草鱼主要投喂配合饲料，虽生长速度快，但多数腹部脂肪堆积，不受消费者喜欢。至今，虽然水产工作者已经付出了很多的努力，但草鱼仍未有通过国家良种审定委员会鉴定的人工选育的良种，实际生产上多为野生种直接驯化而成，缺少定向选育，生产上经常出现因亲本质量差，造成后代生长速度慢、规格不齐、抗病力差等问题，养殖户常常面临重大的经济损失，因此，选育高产优质的草鱼良种一直是草鱼育种工作的中心目标。
碳水化合物在生物体内，在有氧条件下经过糖酵解过程产生能量和一些合成氨基酸、核糖及脂类的中间产物。而与糖酵解相反的过程称为糖异生，在糖异生的反应过程中，果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase)是途径中的限速酶之一，它催化果糖-1,6-二磷酸水解成果糖-6-磷酸和无机磷，而果糖-6-磷酸又是各种生物合成途径中的重要前体。在动物体内，肝脏和肾脏是主要发生这一生理反应的器官，在其他内脏器官中几乎不发生。
选育出生长速度更快的草鱼新品种可以节约饲料成本，缩短养殖周期进而大幅度降低草鱼养殖成本，因此，开发快速可靠的育种技术，进行草鱼快长品种(系)的培育十分必要。在开展常规选育研究的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可加快草鱼良种选育进程。SNP是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸变异而产生的多态性，位于基因编码区的非同义SNP可导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SNP尤其重要，最终引起生物表型的变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与草鱼生长性状相关的SNPs分子标记及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供与草鱼生长性状相关的SNPs标记，所述SNPs标记如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5至少一种所示；其中所述SEQ ID NO.1自5’端起第194位碱基为C或T；所述SEQ ID NO.2自5’端起第172位碱基为C或T；所述SEQ ID NO.3自5’端起第229位碱基为T或A；所述SEQ ID NO.4自5’端起第147位碱基为G或A；所述SEQ ID NO.5自5’端起第10位碱基为C或A。
在本发明的一些实施方式中，所述SNP标记如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一些实施方式中，序列为SEQ ID NO.1的SNP标记的CC基因型个体的生长性状优势显著高于TT基因型个体。
在本发明的一些实施方式中，序列为SEQ ID NO.3的SNP标记的AA基因型个体的生长性状优势显著高于TT基因型个体。
在本发明的一些实施方式中，序列为SEQ ID NO.5的SNP标记的AC基因型个体的生长性状优势显著高于CC基因型个体。
在本发明的一些实施方式中，序列为SEQ ID NO.1的SNP标记的CT基因型、序列为SEQ ID NO.3的SNP标记的AA基因型、序列为SEQ ID NO.5的SNP标记的AA基因型的个体的生长性状优势显著高于其余基因型个体。
在本发明的一些实施方式中，所述生长性状为体重、体长、提高、体宽或肥满度。
本发明的第二方面，提供一种引物，所述引物用于扩增本发明第一方面所述的SNPs标记。
在本发明的一些实施方式中，用于扩增SEQ ID NO.1所示SNP标记的引物如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示；用于扩增SEQ ID NO.2所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示；用于扩增SEQ ID NO.3所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；用于扩增SEQ ID NO.4所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；用于扩增SEQ ID NO.5所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
本发明的第三方面，提供一种试剂盒，包括本发明第二方面所述的引物。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的分子标记或本发明第二方面所述的引物或本发明第三方面所述试剂盒在检测草鱼样本生长性状中的应用。
本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述的分子标记或本发明第二方面所述的引物或本发明第三方面所述试剂盒在筛选快长和/或体型修长的草鱼样本中的应用。
本发明的第六方面，提供本发明第一方面所述的分子标记或本发明第二方面所述的引物或本发明第三方面所述试剂盒在草鱼种质资源改进中的应用。
本发明的第七方面，提供一种用于筛选快长和/或体型修长草鱼样本的方法，通过对草鱼样本进行SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5至少一种SNPs标记的检测，选择如下(I)～(IV)任意一种个体：
(I)SEQ ID NO.1标记为CC基因型；
(II)SEQ ID NO.3标记为AA基因型；
(III)SEQ ID NO.5标记为AC基因型；
(IV)SEQ ID NO.1标记为CT基因型、SEQ ID NO.3标记为AA基因型、SEQ ID NO.5标记为AA基因型。
在本发明的一些实施方式，所述筛选方法具体包括以下步骤：
S1：提取待检测样品DNA；
S2：以DNA为模板，利用本发明第二方面所述引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
S3：对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果确定样品的SNPs标记的基因型来筛选生长性状优势的个体。
本发明的有益效果是：
本发明提供了5个与草鱼生长性状相关的SNPs标记，证实了不同的基因型与草鱼生长性状的相关性。在此基础上，利用该SNPs标记，可以简单快速的鉴定快长且体型修长的草鱼，指导选育快长且体型修长草鱼新品系。在草鱼的养殖或选育领域，都具有积极的效果，为草鱼分子标记辅助选择育种提供基础。并且在此基础上，开发了相应的引物对、方法，可以快速检测，而且本发明所获得的基因型是依据基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证，简单快捷，运用范围广。
附图说明
图1为SNP1延伸反应后检测峰图。
图2为SNP2延伸反应后检测峰图。
图3为SNP3延伸反应后检测峰图。
图4为SNP4延伸反应后检测峰图。
图5为SNP5延伸反应后检测峰图。
图6为连锁不平衡分析结果。
注：各个SNPs位点的基因突变点用阴影标注出。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
1 材料与方法
1.1 实验鱼
SNPs筛选样本：用于筛选草鱼果糖-1，6-二磷酸酶基因SNPs位点的草鱼样品分别取自湖南省宁乡、湖南省沅江、湖北省监利、湖北省石首、湖北省洪湖和广东省南庄草鱼养殖群体各4尾，共24尾样本，剪取尾鳍用于基因组DNA提取。
生长性状关联分析样本：用于生长性状关联分析的草鱼样本取自广东省佛山市白金种苗有限公司。在同批繁殖，同塘饲养的17月龄草鱼群体中随机选择296尾草鱼样本用于性状关联分析。样本均测量体重、体长、体高、体宽生长数据，并剪取尾鳍保存于无水乙醇中备用。
1.2样品DNA的提取
(1)取待检测鱼的血液100μL或剪碎后鳍条组织3mg，加入0.5mL的裂解液(10mmol/LTris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。
(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。
(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。
(4)用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μL TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。
1.3数据统计分析
对筛选获得的SNPs位点进行SNaPshot分型进行验证，得到这5个位点的存在，具体信息见表1。
表1 SNPs位点信息
Figure BDA0003290895380000041
Figure BDA0003290895380000051
设计分型引物对296尾草鱼样本进行多重PCR扩增。所述引物对的核苷酸序列表2所示。
表2 SNPs的引物信息
Figure BDA0003290895380000052
Figure BDA0003290895380000061
利用表2的引物对待测草鱼DNA进行PCR扩增(扩增的反应体系和反应条件如下所示)，扩增的目的片段用1％的琼脂糖凝胶检测质量，120V，30min。琼脂糖凝胶在紫外灯下显色，如果引物1检测到432bp单条谱带，即可对PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物再进行延伸反应。其中PCR反应体系如表3所示。
表3 PCR反应体系
DNA 1μL
10×buffer 1.5μL
MgCl<sub>2</sub>(25mM) 1.5μL
dNTP(10mM) 0.3μL
引物混合(10P) 0.15μL
Taq(5U/μL) 0.3μL
H<sub>2</sub>O 补至15μL
扩增条件为：95℃3min；94℃15s；60℃15s，-0.5℃/循环，11个循环；72℃30s；94℃15s；54℃15s，24个循环；72℃30s；72℃3min。
扩增后取3μL PCR产物用ExoI和Sap纯化，主要是去除反应产物中的引物及dNTP，纯化体系见表4。
表4纯化体系
PCR产物 3μL
ExoI 0.2μL
Sap 0.2μL
ExoI buffer 0.7μL
H<sub>2</sub>O 补至7μL
纯化条件为：37℃45min，80℃15min。纯化好后进行延伸反应，预先混好延伸引物。延伸反应的体系见表5。
表5延伸反应体系
PCR产物 2μL
SNaPshot Mix试剂 1μL
延伸引物混合 2μL
水补至 6μL
反应条件为：96℃1min；96℃10s；52℃5s，30个循环；60℃30s。
延伸反应结束后取1μL延伸产物在测序仪(型号为：ABI 3730XL)进行SNaPshot分型，根据测序结果峰图的颜色可判断所测个体的基因型，峰图的每个吸收峰对应核苷酸在峰图上方有所对应标识，图上方核苷酸标识有阴影加深的分别为突变位点突变前后的核苷酸，其中SNP1延伸反应后检测峰图见图1，SNP2延伸反应后检测峰图见图2，SNP3延伸反应后检测峰图见图3，SNP4延伸反应后检测峰图见图4，SNP5延伸反应后检测峰图见图5。
实施例2
Popgene 32(version 3.2)软件计算SNPs位点的有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和等位基因频率等遗传参数。利用SPSS 17.0软件的一般线性模型(general linear model，GLM)计算果糖-1，6-二磷酸酶基因片段的不同的SNPs位点基因型与生长性状(体重、体长、体高、体宽)和肥满度之间的相关性并进行最小二乘分析(least-significant difference，LSD)，肥满度公式为：K＝(W/L3)×100％，其中K为肥满度，W为鱼体重(g)，L为鱼体长(cm)。结果见表6。
表6 5个SNPs不同基因型与生长性状关联分析
Figure BDA0003290895380000071
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示极差异显著(P<0.01)。
根据spss结果显示SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5的基因型与5种生长性状差异均不显著(P>0.05)。经过多个位点基因型与生长性状的差异性分析，在SNP1及SNP3两个位点上发现纯合子在生长性状上优势比杂合子高，只在SNP5上发现有杂合子优势。后续基因筛选及选育，可用SNP1位点CC基因型、SNP3位点AA基因型及SNP5位点AC基因型作为标记位点，且这三个基因型在种群中基因型频率中等，选育成活率相对较高。
实施例3
本实施例研究草鱼果糖-1，6-二磷酸酶基因SNPs双倍型与生长性状关联分析。
利用群体遗传学研究方法(连锁不平衡(LD)分析)对草鱼果糖-1，6-二磷酸酶基因SNPs双倍型与生长性状关联分析进行探究。
使用SHEsis进行LD分析，其中，以r2为度量指标。
r2值越大，LD程度越大。当r2>0.33，提示存在强LD。
结果如图6(图6左是D′值，图6右是r2值)。
利用SHEsis在线软件对草鱼果糖-1，6-二磷酸酶基因5个SNPs进行连锁不平衡分析(图6，图6左是D′值，图6右是r2值)，发现SNP1与SNP2、SNP4间不连锁(r2<0.33)，SNP3与SNP2、SNP4间不连锁(r2<0.33)，SNP5与其它4个SNPs间连锁平衡(r2≈0)，SNP2与SNP4间存在连锁不平衡(r2>0.33)。用SNP1、SNP3、SNP5这3个SNPs的联合分析双倍型与生长性状之间的关联。
SNP1(s1)、SNP3(s3)与SNP5(s5)这3个SNPs位点有三个优势基因型，所以三个位点共组成10种双倍型，其中有效双倍型为H1-H10共10个(其余双倍型频率低，不参与统计分析和多重比较)。不同双倍型与生长关联分析结果见表7。
表7 SNP1、SNP3和SNP5组成的不同双倍型与生长的关联分析
Figure BDA0003290895380000081
Figure BDA0003290895380000091
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示极差异显著(P<0.01)。
显示双倍型H6在体重、体长、体宽及各性状的数据上最大，肥满度为最小，为生长优势基因型。H7、H0型基因为生长劣势基因，个体体型偏轻、短小(肥满度显著低于H3、H4双倍型基因(P<0.05))，推测实际养殖效益较低。而H6基因在体重、体长、体宽、肥满度上有一定的优势，为生长优势基因型，个体体型修长不会偏肥，且分量重，推测实际养殖效益较高，符合前期筛选预想，可作为标记基因型。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 与草鱼果糖-1,6-二磷酸酶相关的5个SNPs标记及应用
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 337
<212> DNA
<213> 草鱼
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ctttcttttt ttaaatcagc aagaagatct ttaaatctgc agtcatgtca gaccggggat 180
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
actgtatgtt tagaagtacc tttc 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cctttaccct gcaaatgtga agag 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acaactctga ataataaaga gga 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acattacaga ggtattttga aag 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tatataatac ttgacactcc agaa 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aacagtgtta tctgcactag acaa 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aggcacaagt gattatttga tctg 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aataatttca gctgccaata acac 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gatgatttga atttaaattg atca 24

Claims (10)

1.与草鱼生长性状相关的SNPs标记，所述SNPs标记如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5至少一种所示；其中所述SEQ ID NO.1自5’端起第194位碱基为C或T；所述SEQ ID NO.2自5’端起第172位碱基为C或T；所述SEQ ID NO.3自5’端起第229位碱基为T或A；所述SEQ ID NO.4自5’端起第147位碱基为G或A；所述SEQ ID NO.5自5’端起第10位碱基为C或A。
2.根据权利要求1所述的SNPs标记，其特征在于，序列为SEQ ID NO.1的SNP标记的CC基因型个体的生长性状优势显著高于TT基因型个体；
优选的，序列为SEQ ID NO.3的SNP标记的AA基因型个体的生长性状优势显著高于TT基因型个体；
优选的，序列为SEQ ID NO.5的SNP标记的AC基因型个体的生长性状优势显著高于CC基因型个体；
优选的，序列为SEQ ID NO.1的SNP标记的CT基因型、序列为SEQ ID NO.3的SNP标记的AA基因型、序列为SEQ ID NO.5的SNP标记的AA基因型的个体的生长性状优势显著高于其余基因型个体。
3.根据权利要求1或2所述的SNPs标记，其特征在于，所述生长性状为体重、体长、提高、体宽或肥满度。
4.一种引物，其特征在于，所述引物用于扩增权利要求1～3任一项所述的SNPs标记；优选地，用于扩增SEQ ID NO.1所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；用于扩增SEQ ID NO.2所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；用于扩增SEQID NO.3所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；用于扩增SEQ ID NO.4所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；用于扩增SEQ ID NO.5所示SNP标记的引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
5.一种试剂盒，包括权利要求4所述的引物。
6.权利要求1～3任一项所述的分子标记或权利要求4所述的引物或权利要求5所述的试剂盒在检测草鱼样本生长性状中的应用。
7.权利要求1～3任一项所述的分子标记或权利要求4所述的引物或权利要求5所述的试剂盒在筛选快长和/或体型修长的草鱼样本中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述的分子标记或权利要求4所述的引物或权利要求5所述的试剂盒在草鱼种质资源改进中的应用。
9.一种用于筛选快长和/或体型修长草鱼样本的方法，通过对草鱼样本进行SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5至少一种SNPs标记的检测，选择如下(I)～(IV)任意一种个体：
(I)SEQ ID NO.1标记为CC基因型；
(II)SEQ ID NO.3标记为AA基因型；
(III)SEQ ID NO.5标记为AC基因型；
(IV)SEQ ID NO.1标记为CT基因型、SEQ ID NO.3标记为AA基因型、SEQ ID NO.5标记为AA基因型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1：提取待检测样品DNA；
S2：以DNA为模板，利用权利要求4所述引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
S3：对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果确定样品的SNPs标记的基因型来筛选生长性状优势的个体。
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Citations (2)

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CN105505927A (zh) * 2016-01-29 2016-04-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 草鱼耐糖性能相关的snp标记及其应用
CN111040959A (zh) * 2019-10-15 2020-04-21 中国水产科学研究院珠江水产研究所 具有特定病原微生物拮抗能力的草鱼源乳酸菌及其应用

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