CN110317887B - 大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点、引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点、引物及其应用，大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点包括20个多态性微卫星位点，位点编号为pd‑01～pd‑20；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20所示。本发明的大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点是从转录组序列中筛选出的微卫星标记位点，出现无效等位基因的概率小。本发明的多态微卫星标记位点均为高度多态性标记，可为大鳞副泥鳅群体遗传学分析，遗传多样性检测，构建遗传连锁图谱，亲缘关系鉴定，分子辅助育种提供强有力的工具。
Description
技术领域
本发明属于动物微卫星标记技术领域，具体涉及大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点、引物及其遗传多样性检测。
背景技术
大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)是一种小型淡水经济鱼类，隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、副泥鳅属(Paramisgurnus)。分布于我国的黑龙江、辽河中下游、海河水系、长江、钱塘江和台湾等水系。因其具有较高的食用价值和药用价值，在国内外市场广受欢迎，是我国出口韩国和日本的重要水产品之一。目前，我国大鳞副泥鳅养殖的苗种多为野生捕捞或者野生亲本繁殖而来，由于栖息环境的不断恶化和捕捞强度的增大，大鳞副泥鳅的野生资源量在不断减少，亟待开展大鳞副泥鳅种质资源状况评估及良种选育工作。
微卫星DNA又称简单重复序列，由2-6bp短核苷酸串联重复组成，均匀分布于真核生物基因组中。微卫星标记由于重复单元的重复次数不同，在不同的个体间呈现高度变异而表现出多态性。微卫星标记为共显性标记，可稳定遗传，遵循孟德尔遗传规律，结果重复性高，在群体遗传多样性和遗传结构分析、遗传连锁图谱的构建，QTL定位、不同种、品种鉴定以及亲子鉴定等领域应用广泛。目前，大鳞副泥鳅微卫星标记在Genebank数据库中只有124个，多数为跨种扩增得到的，其有效性和应用性比较局限。
发明内容
本发明的目的在于克服现有大鳞副泥鳅微卫星标记的不足，提供大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点。
本发明的第二个目的是提供大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点的引物。
本发明的第三个目的是提供大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点的引物在大鳞副泥鳅遗传多样性检测中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点，包括第1微卫星位点pd-01～第20微卫星位点pd-20，所述第1微卫星位点pd-01～第20微卫星位点pd-20的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.20所示。
大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点的引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.21～SEQID NO.60所示。
上述大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点的引物在大鳞副泥鳅遗传多样性检测中的应用。
所述的应用，包括如下步骤：
(1)大鳞副泥鳅基因组DNA的提取；
(2)微卫星位点PCR扩增：在权利要求2各个大鳞副泥鳅微卫星标记位点的正向引物5’端连接荧光基团进行修饰，以大鳞副泥鳅基因组为模板，用对应的修饰的正向引物，和反向引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)扩增产物在ABI 3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500 LIZ作为内参，用peak Scanner Software(v1.0)软件读取个体的基因型；
(4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星位点的基因型，利用PopGene 32计算遗传多样性参数。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明的大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点是从转录组序列中筛选出的微卫星标记位点，出现无效等位基因的概率小。
2、本发明的多态微卫星标记位点均为高度多态性标记，可为大鳞副泥鳅群体遗传学分析，遗传多样性检测，构建遗传连锁图谱，亲缘关系鉴定，分子辅助育种提供强有力的工具。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，有必要在此指出的是本实施例是本发明的一部分实施例，但不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.大鳞副泥鳅微卫星标记位点的获得
本发明采用转录组测序技术获得大鳞副泥鳅的大量微卫星标记位点。
2.大鳞副泥鳅基因组DNA的提取
采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA提取试剂盒提取大鳞副泥鳅基因组DNA。
3.微卫星标记的筛选
从获得的大鳞副泥鳅微卫星标记中挑选了重复单元为3-5碱基，且3碱基重复7次以上，4碱基和5碱基重复5次以上，产物长度在200bp以内的40个微卫星位点，作为候选微卫星位点，用Primer5.0软件设计引物。将5-6尾大鳞副泥鳅基因组DNA混合作为模板(本实施例用了6尾)，用40对引物进行温度梯度PCR扩增，以筛选出每对引物的最佳退火温度。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，选择扩增条带单一且明亮的20对引物(表1)重新合成荧光引物用于遗传多样性检测，所有引物均在上海生工生物工程股份有限公司进行合成。
本发明中大鳞副泥鳅微卫星标记位点，大鳞副泥鳅微卫星标记位点的引物和对应的引物信息如表1：
表1微卫星引物序列信息
4.微卫星微点扩增和遗传多样性检测
选择60尾大鳞副泥鳅基因组DNA进行遗传多样性检测，PCR扩增体系为15μL，包括2×PCR Mix 7.5μL，正向和反向引物各0.2μL，超纯水5.6μL，DNA模板1.5μL。PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，反应进行33个循环；最后72℃再延伸10min。扩增产物在ABI 3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500 LIZ作为内参，用peak Scanner Software(v1.0)软件读取个体的基因型。利用PopGene 32软件进行等位基因(Ao)、有效等位基因(Ae)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)遗传多样性指标计算；采用软件GENEPOP 4.0进行Hardy-Weinberg平衡检验。
5.结果
60尾大鳞副泥鳅遗传多样性检测结果见表2。20个位点平均等位基因数为5.55，有效等位基因数为3.15，平均观测杂合度为0.55；平均期望杂合度为0.66；平均多态信息含量为0.61。
表2微卫星引物在60尾大鳞副泥鳅个体中的分型结果
注：Ao为等位基因数目，Ae为有效等位基因数目，Ho为观察杂合度，He为期望杂合度，PIC为多态含量，HWE为哈迪温伯格平衡检验p值，p值小于0.05表示偏离哈迪温伯格平衡位点。
本发明获得的微卫星位点编号为pd-01～pd-20的核苷酸序列见序列表。
本发明提供的20对微卫星标记均为高度多态性标记，可为大鳞副泥鳅群体遗传学分析，遗传多样性检测，构建遗传连锁图谱，亲缘关系鉴定，分子辅助育种提供强有力的工具。
序列表
<110> 天津市水产研究所
<120> 大鳞副泥鳅多态微卫星标记位点、引物及其应用
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 1
tgagccggtt tggactcttg acactgtttt ggactttcat cagtgcttta agttcccagt 60
attgaatgta acttttgttt gtttgtttgt ttgttaagat aagaagtttc actgttgcac 120
agatcttgc 129
<210> 2
<211> 145
<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 2
tctggaggat tggctgggat atttatcagg tcacactgaa tgaatgaatg aatgaatatc 60
acacagttgt tttaaatctg ccgatattga tatgaatgta aaatgatttt taatagcttt 120
attctccgtg cttcatgtaa gatgt 145
<210> 3
<211> 157
<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 3
gagagagaaa gagagaagcc cattaagcat ttcttttcga tgcatacatt tttcggaaca 60
taaaccaata aataggcaat tcataaacca attgttgtca taaataaata aataaataaa 120
agtttccata aattaattgg caaatcgtaa gctgtgt 157
<210> 4
<211> 167
<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 4
tggtggacag aacaatgacg tttgcatgtc cttagatttg aaggtcttgg atatggattt 60
gttgaaagcc ctaatggtgg tttgaattgg ataggtggga atgaatgaat gaatgaatgg 120
cttgaaatgc tagcaccttg ttttgtgcaa atcacccccg aactcca 167
<210> 5
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 5
agacgggacc taagaccaca gtgtctgtga agtctcttga agatccatac tcacaacagc 60
tccgtcatca gttacaacaa caacaacaac aacagactgg agctcagtca ggacctcaga 120
ggaaccttct cacccgcttc caat 144
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 6
ccagcttctc ctgcacatga agaatgaacc aatgtgacag agaaataatc taaacttgtg 60
ttatctatct atctatctat cttagaggtt taaactgttt ggttgtttta tactttgagt 120
gatgtgtaat gtacctgcat tagcatgtgg tgtgttt 157
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 7
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tcacaatgac agatagcagt tcaactaata ctaaaatgct agttactatc ggcacaaagc 120
acaccacagc ttcatca 137
<210> 8
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
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aaactggtaa attggtctta atgcaattta tctatctatc tatctatccc aacactatga 120
ttaaaccata aacgttttaa aatgccatac gatgcaccag a 161
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<211> 136
<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
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tctctgggct tgttttggct tattggtcgg gcccgacaca cactactact actactacta 60
ctactactac tactactact aaactgcaga cctgcgaggg gtaaacgctc ctcatgtaca 120
agaggccatt cctgcg 136
<210> 10
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
<400> 10
ggatcaacct ggccagaaca ataatttata agttcaggaa tggcttgaca acaacaacaa 60
caacaacaga tgcgtttact acatgatcca acatgaaatc gatcatgaga aaaacacatg 120
gttgacatgg acgaggcgac tggcctttcc atgagtcctc gcacc 165
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<212> DNA
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ggtcagtatc tgacaagcaa tttaacatgc atgttcattg caatagtata aagcggacac 120
tctgtttgct 130
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gccctgtgag atttgtggct gtataaatgg attaggtgta ggttgcttta aataaataaa 60
taaataaaag tgtaacctca ataaaaccct tttgtgcttg tgc 103
<210> 13
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
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acacaagcgg aaagacacct cacaaatgaa agaagcgctt tggtgttgaa ataaaaccac 60
agactttaag cgtttgcagc aaattcactc atacagacag acagacagac agcagttttg 120
caatgtaatg aatcacatat agtagcctac gttaaggtca atggtgcggt acag 174
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<212> DNA
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agtcagccgc tcacacggtg ttatgctaat gcctgacccc agatcagagt tcagctaaca 120
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<210> 15
<211> 141
<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
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tgtaaattat aaaaaacagg gatatttaat tttatttatt tatttattta tttcaatagt 120
ccctgtttaa gtgtgaatgc a 141
<210> 16
<211> 135
<212> DNA
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tcggcagtct aacacacatg tatgtcagga tgaaaggttg ttgttgttgt tgttgtttgt 60
tggtaaagca tgaacataat gttattgcct catattcatc ttatgaatgt cttgactcac 120
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
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ctgaactgaa ctgaactgaa ctgaactgaa ctgaactgaa ctgaactgaa ctgtgctttg 180
atttctctgg agcagagatc tgctcgcaca ca 212
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<212> DNA
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gactattgct acgatgatga tgatgatgat gatcagctgt gatgttactg tagtgctgct 120
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caatcaatca agatagatgg atactggacg tcaatacact actgcaatac ttcaggagat 120
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<212> DNA
<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)
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ctacacccgg cagatacacg agtctttagt aacacaggtt gattccaagg aaacggttta 60
atctacaatc aatcccaacg ctttttgaga agctatataa tttcaccacc accaccacca 120
ccaccaccac cacatcacca tcgttcagtt tgtttgcaca taagaagggt gtacacgatt 180
ttatcctaaa atctttcgga acgacatggc a 211
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<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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<211> 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
catggctggt gtgcagtaga 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcacaatctg gactgttgcc 20
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tgcattcaca cttaaacagg gac 23
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tcggcagtct aacacacatg t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
actgctctgt ttgctgtgag t 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gagaaccaca cgagctctcc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tgtgtgcgag cagatctctg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ccattgcatt gtccttggcc 20
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
agcagcacta cagtaacatc aca 23
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gtctcagaca gtgactcggc 20
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaggcagcag ttttgtgatg a 21
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctacacccgg cagatacacg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tgccatgtcg ttccgaaaga 20
Claims (4)
1.大鳞副泥鳅多态微卫星标记组合，其特征在于该组合包括第1微卫星标记pd-01～第20微卫星标记pd-20，所述第1微卫星标记pd-01～第20微卫星标记pd-20的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示。
2.检测权利要求1所述的大鳞副泥鳅多态微卫星标记组合的引物对组合物，其特征是所述引物对组合物包括如下引物对：
检测第1微卫星标记pd-01的引物对：正向引物为SEQ ID NO.21，反向引物为SEQ IDNO.22；
检测第2微卫星标记pd-02的引物对：正向引物为SEQ ID NO.23，反向引物为SEQ IDNO.24；
检测第3微卫星标记pd-03的引物对：正向引物为SEQ ID NO.25，反向引物为SEQ IDNO.26；
检测第4微卫星标记pd-04的引物对：正向引物为SEQ ID NO.27，反向引物为SEQ IDNO.28；
检测第5微卫星标记pd-05的引物对：正向引物为SEQ ID NO.29，反向引物为SEQ IDNO.30；
检测第6微卫星标记pd-06的引物对：正向引物为SEQ ID NO.31，反向引物为SEQ IDNO.32；
检测第7微卫星标记pd-07的引物对：正向引物为SEQ ID NO.33，反向引物为SEQ IDNO.34；
检测第8微卫星标记pd-08的引物对：正向引物为SEQ ID NO.35，反向引物为SEQ IDNO.36；
检测第9微卫星标记pd-09的引物对：正向引物为SEQ ID NO.37，反向引物为SEQ IDNO.38；
检测第10微卫星标记pd-10的引物对：正向引物为SEQ ID NO.39，反向引物为SEQ IDNO.40；
检测第11微卫星标记pd-11的引物对：正向引物为SEQ ID NO.41，反向引物为SEQ IDNO.42；
检测第12微卫星标记pd-12的引物对：正向引物为SEQ ID NO.43，反向引物为SEQ IDNO.44；
检测第13微卫星标记pd-13的引物对：正向引物为SEQ ID NO.45，反向引物为SEQ IDNO.46；
检测第14微卫星标记pd-14的引物对：正向引物为SEQ ID NO.47，反向引物为SEQ IDNO.48；
检测第15微卫星标记pd-15的引物对：正向引物为SEQ ID NO.49，反向引物为SEQ IDNO.50；
检测第16微卫星标记pd-16的引物对：正向引物为SEQ ID NO.51，反向引物为SEQ IDNO.52；
检测第17微卫星标记pd-17的引物对：正向引物为SEQ ID NO.53，反向引物为SEQ IDNO.54；
检测第18微卫星标记pd-18的引物对：正向引物为SEQ ID NO.55，反向引物为SEQ IDNO.56；
检测第19微卫星标记pd-19的引物对：正向引物为SEQ ID NO.57，反向引物为SEQ IDNO.58；
检测第20微卫星标记pd-20的引物对：正向引物为SEQ ID NO.59，反向引物为SEQ IDNO.60。
3.权利要求2的引物对组合物在大鳞副泥鳅遗传多样性检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是包括如下步骤：
（1）大鳞副泥鳅基因组DNA的提取；
（2）微卫星标记的PCR扩增：在权利要求2所述的引物对组合物中的正向引物5’端连接荧光基团进行修饰，以大鳞副泥鳅基因组为模板，用对应的修饰的正向引物，和反向引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
（3）扩增产物在ABI 3730XL 基因分析仪上进行分型，用GS-500 LIZ作为内参，用peakScanner Software v1 .0 软件读取个体的基因型；
（4）遗传多样性分析：根据每个个体微卫星位点的基因型，利用PopGene 32计算遗传多样性参数。
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