CN107881246B - 凡纳滨对虾est-str标记及其扩增引物、检测方法和应用 - Google Patents

凡纳滨对虾est-str标记及其扩增引物、检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾EST‑STR标记及其扩增引物、检测方法和应用。本发明利用从NCBI数据库获得的凡纳滨对虾EST序列，开发获得8个具有高度多态性的凡纳滨对虾EST‑STR标记，编号分别为Lv‑F2a、Lv‑F7a、Lv‑F8a、Lv‑F9a、Lv‑F30a、Lv‑F31a、Lv‑F36a和Lv‑F40a。本发明的凡纳滨对虾EST‑SSR标记可用于凡纳滨对虾遗传关系分析及分子标记辅助育种，为凡纳滨对虾遗传多样性研究及优良品种的辅助选育奠定基础。

Description

凡纳滨对虾EST-STR标记及其扩增引物、检测方法和应用
技术领域：
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及凡纳滨对虾EST-STR标记及其扩增引物、检测方法和应用。
背景技术：
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾)养殖业是我国水产养殖的支柱性产业，目前我国凡纳滨对虾养殖年产量超过100万吨，占养殖对虾总产量的80％。但由于目前我国引进和繁育的凡纳滨对虾大多是人工繁育群体，容易引起遗传衰退。因此，良种选育是保障我国凡纳滨对虾养殖业可持续发展的重要举措。近年来，以分子标记为基础的分子标记辅助选育技术在水产育种中得到了广泛应用，加快了良种选育的进程。
微卫星(microsatellite)，又称为短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs)，是广泛分布于真核生物基因组，由2-6个核苷酸多次串联重复构成的长达十至几十个核苷酸的序列。由于微卫星标记具有杂合程度高、多态性丰富、重复性好、共显性遗传等优点，已广泛应用于群体遗传多样性研究、基因定位、遗传连锁图谱构建、种质鉴定和品种分类以及分子标记辅助育种中。随着功能基因组学的飞速发展，大量的表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)数据为开发STR标记提供了便利条件。与传统的STR标记相比，EST-STR标记的开发更省时省力。同时，由于EST-STR标记反映的是转录区的差异，它的多态性可能与基因功能直接相关。因此，EST-STR标记在分子标记辅助选择育种领域的应用价值更高。迄今为止，凡纳滨对虾EST-STR标记的开发较少，因此，我们希望通过高度多态性EST-STR标记的开发为凡纳滨对虾遗传多样性研究及优良品种的辅助选育奠定基础。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种凡纳滨对虾EST-STR标记及其扩增引物、检测方法和应用。为凡纳滨对虾遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供高度多态性的分子标记。
为实现上述发明目的，本发明利用从NCBI数据库获得的凡纳滨对虾EST序列，开发凡纳滨对虾高度多态性EST-STR标记，并提供多态性引物，为凡纳滨对虾遗传多样性研究及优良品种的辅助选育提供高度多态性的分子标记。
本发明从NCBI的dbEST数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.htm1)批量下载凡纳滨对虾的EST序列，并通过MISA软件进行微卫星位点查找，以二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸重复次数15次以上的序列为备选序列。采用PrimerPremier 5软件，共设计了40对引物，并利用这40对引物对凡纳滨对虾的基因组DNA进行PCR扩增，其中有8对引物能稳定扩增出目的条带。采用3730XL测序仪对PCR扩增产物进行分型，并利用GeneMapper 3.2软件读取等位基因片段的长度，用Cervus 3.0软件对多态性信息进行分析，最终确定了8个具有高度多态性的凡纳滨对虾EST-STR标记。
本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾EST-STR标记，所述的EST-STR标记编号为Lv-F2a、Lv-F7a、Lv-F8a、Lv-F9a、Lv-F30a、Lv-F31a、Lv-F36a和Lv-F40a；
所述的Lv-F2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的Lv-F7a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的Lv-F8a的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的Lv-F9a的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的Lv-F30a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的Lv-F31a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的Lv-F36a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的Lv-F40a的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述的凡纳滨对虾EST-STR标记的扩增引物，所述的扩增引物包括：
针对Lv-F2a位点：
Lv-F2a-F：5’-CCCCAAAATCGTCTTTCCAA-3’；
Lv-F2a-R：5’-GGTGGATTTAGGGAAGGCGTA-3’；
针对Lv-F7a位点：
Lv-F7a-F：5’-GAGGTGTTGAGGGAAGGTTGTG-3’；
Lv-F7a-R：5’-GAGGCCAATTACGATTGTTTCA-3’；
针对Lv-F8a位点：
Lv-F8a-F：5’-TCGCACATAGTCAAAATGGCA-3’；
Lv-F8a-R：5’-TGTGAGCCGTGCGAAAGTC-3’；
针对Lv-F9a位点：
Lv-F9a-F：5’-CTGCTGTTCGAGAAAGCTGTTC-3’；
Lv-F9a-R：5’-TTTTGGGCGCTTTGAGATTC-3’；
针对Lv-F30a位点：
Lv-F30a-F：5’-GTCCCATCGCCGAGTTGA-3’；
Lv-F30a-R：5’-TTTGAATCAGCGACACGACAG-3’；
针对Lv-F31a位点：
Lv-F31a-F：5’-CGCCAACGAATGTCTAAGAGC-3’；
Lv-F31a-R：5’-GCAATATGCAAAATGCCTGTTC-3’；
针对Lv-F36a位点：
Lv-F36a-F：5’-GCCTCGGTAACATTGTGAAGAG-3’；
Lv-F36a-R：5’-ACAGCAACCAGGGTATTCAGG-3’；
针对Lv-F40a位点：
Lv-F40a-F：5’-CATTTCCCTTTCGCATTTCTC-3’；
Lv-F40a-R：5’-GCAATGATTCCATCAGGTTCG-3’。
优选，所述的扩增引物的正向引物的5’端标记有荧光基团。
所述的荧光基团优选为FAM、HEX或TAMRA。
本发明的第三个目的是提供一种凡纳滨对虾EST-STR标记的检测方法，包括以下步骤：
(1)、提取凡纳滨对虾基因组DNA；
(2)、以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用上述的针对Lv-F2a位点的引物对Lv-F2a-F/R、针对Lv-F7a位点的引物对Lv-F7a-F/R、针对Lv-F8a位点的引物对Lv-F8a-F/R、针对Lv-F9a位点的引物对Lv-F9a-F/R、针对Lv-F30a位点的引物对Lv-F30a-F/R、针对Lv-F31a位点的引物对Lv-F31a-F/R、针对Lv-F36a位点的引物对Lv-F36a-F/R和针对Lv-F40a位点的引物对Lv-F40a-F/R进行PCR扩增；
(3)、利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。
优选，所述的PCR扩增，其反应体系25μL，包括：不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl2 2.0μL、10mM dNTP 0.5μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
所述的PCR扩增，其反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
本发明的第四个目的是提供上述的EST-STR标记或扩增引物在凡纳滨对虾群体遗传多样性研究、基因定位、遗传连锁图谱构建、种质鉴定、品种分类或分子标记辅助育种中的应用。
本发明利用从NCBI数据库获得的凡纳滨对虾EST序列，开发获得8个具有高度多态性的凡纳滨对虾EST-STR标记，编号分别为Lv-F2a、Lv-F7a、Lv-F8a、Lv-F9a、Lv-F30a、Lv-F31a、Lv-F36a和Lv-F40a。本发明的凡纳滨对虾EST-SSR标记可用于凡纳滨对虾遗传关系分析及分子标记辅助育种，为凡纳滨对虾遗传多样性研究及优良品种的辅助选育奠定基础。
附图说明：
图1是Lv-F2a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
图2是Lv-F7a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
图3是Lv-F8a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
图4是Lv-F9a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
图5是Lv-F30a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
图6是Lv-F31a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
图7是Lv-F36a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
图8是Lv-F40a位点引物扩增12个凡纳滨对虾基因组DNA的STR分型图；其中S1-S12代表12个样品。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由上海生物工程有限公司完成。
实施例1：
1、凡纳滨对虾EST-STR序列的筛选及EST-STR标记引物的设计
从NCBI的dbEST数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.htm1)批量下载凡纳滨对虾的EST序列，并通过MISA软件进行微卫星位点查找，以二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸重复次数15次以上的序列为备选序列。
采用Primer Premier 5软件，针对筛选出的40个凡纳滨对虾EST序列的40个STR位点进行STR引物设计。引物设计的要求为：引物长度18-22bp，GC含量为40-60％，Tm值为55-65℃，上下游引物的Tm值之差不大于5，并尽量避免引物二聚体、发夹结构及错配等；扩增产物长度为100-550bp。共设计和合成40对EST-STR引物，引物序列见表1。
表1凡纳滨对虾EST-STR标记引物特性表
(位点、重复基序、引物序列、退火温度、dbEST Id)
Figure BDA0001491777640000071
Figure BDA0001491777640000081
2、凡纳滨对虾EST-STR标记引物的筛选及结果分析
2.1凡纳滨对虾基因组DNA的提取
选取来自于广东深圳、珠海、湛江、徐闻和茂名等地12个养殖场的凡纳滨对虾12尾，分别取肌肉组织，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡纳滨对虾基因组DNA，操作步骤严格按照说明书进行。基因组DNA定量采用NanoDropTM2000分光光度计完成，质量采用琼脂糖电泳来检测。
2.2引物的初步筛选
从上述提取的凡纳滨对虾基因组DNA中随机抽取一份做模板，分别采用表1中的40对引物对该基因组DNA进行PCR梯度扩增，其反应体系25μL，包括：10×PCR buffer(withoutMg2+)2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，5U/μL高保真PCR酶(
Figure BDA0001491777640000091
HS DNAPolymerase)0.2μL，10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL，25ng/μL DNA模板0.5μL，无菌双蒸水18.3μL。反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火(温度从48℃到65℃)30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。PCR扩增产物经2％琼脂糖电泳检测，显示有8对引物在特定退火温度下能稳定扩增出条带。分别对扩增产物进行测序，结果显示该8对引物均可扩增出目的条带，位点分别为：Lv-F2a(如SEQ ID NO.1所示)、Lv-F7a(如SEQID NO.2所示)、Lv-F8a(如SEQ ID NO.3所示)、Lv-F9a(如SEQ ID NO.4所示)、Lv-F30a(如SEQ ID NO.5所示)、Lv-F31a(如SEQ ID NO.6所示)、Lv-F36a(如SEQ ID NO.7所示)和Lv-F40a(如SEQ ID NO.8所示)。
2.3多态性引物的筛选及结果分析
对上述初步筛选出的8对引物的上游引物的5’端分别用FAM、HEX或TAMRA进行荧光标记，以上述提取的12个凡纳滨对虾基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系同步骤2.2，反应程序除退火温度为60℃外均与步骤2.2中所述一致。PCR扩增产物先用2％琼脂糖电泳进行检测，后采用3730XL测序仪进行分型，并使用GeneMapper3.2软件判读等位基因片段的具体数值，确定了8个具有多态性的凡纳滨对虾功能基因EST-STR标记(见图1-8)，位点分别为：Lv-F2a(如SEQ ID NO.1所示)、Lv-F7a(如SEQ ID NO.2所示)、Lv-F8a(如SEQ ID NO.3所示)、Lv-F9a(如SEQ ID NO.4所示)、Lv-F30a(如SEQ ID NO.5所示)、Lv-F31a(如SEQ IDNO.6所示)、Lv-F36a(如SEQ ID NO.7所示)和Lv-F40a(如SEQ ID NO.8所示)。
采用Cervus 3.0软件计算期望杂合度、观察杂合度及多态性信息含量(polymorphic information content,PIC)。结果表明：上述8个多态性微卫星标记的等位基因数分别为9、16、11、8、13、14、9和9个；观测杂合度分别为0.833、0.917、1.000、0.917、1.000、0.833、1.000和0.917；期望杂合度分别为0.866、0.946、0.895、0.899、0.928、0.949、0.884和0.822；PIC值分别为0.810、0.900、0.843、0.846、0.879、0.903、0.830和0.760(表2)，均大于0.5，说明这8个EST-STR标记均具有高度多态性，可用于凡纳滨对虾遗传关系分析及分子标记辅助育种。
表2凡纳滨对虾功能基因EST-STR标记特性表
Figure BDA0001491777640000101
Figure BDA0001491777640000111
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 凡纳滨对虾EST-STR标记及其扩增引物、检测方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 1
cccccaaaat cgtctttcca agctagaagt aagaaaaaaa tatatatata aatataatgg 60
agaagtcaac gctgaaaccc aaatccccaa gattatattc tacgcacgag aaaaatgcat 120
aataagtgtc gtacacattt tagggtgatg tcacttgctg aatgcagatg aagtggctcg 180
tgtaagtgac tgcaaagtgt ctgttttttt ggcactgctc cgttggggtg tcgatgtgcg 240
tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 300
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtacg tgtatatcga agtatgtata 360
tgtatatatc gatgccttcc gacaaataac caacacatgc atgagtacgc cttccctaaa 420
tccacc 426
<210> 2
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<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 2
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gtgtccgaaa gccgttaaac cttaaaagga gatgtgtccg aattgcaaca catgtttgaa 120
attatatttc tttctttgtt agtcaccaag atggaaaaca tgtatctgtg gcaccagtgg 180
atcttgacct agggagtaac cagtgatgga acgtgtcctc gtgttgtaag actagcaaga 240
agactatgta tccacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 300
cacacacaca cacacacaca cacacacaca tacacacata cataaaatgt acatgtagag 360
ttgtccattt tcttggcatt gcttattatg aaacaatcgt aattggcctc 410
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<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
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ttgattacag aattaccatc atgagtacta tggctagatc cgagactagg tcttgcagcg 180
atggaccatc aacttatata gtgaggaatc gttataaaaa aaccattgag cgtcgaagtt 240
ttttgttctt ccttgcacga tttttggaaa cttatctcct ttttcccatc ttatttacta 300
tttaacgtct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 360
ctctctctct cctttcagtt cagtgacgtt tgtgaaggga tgttgtgcct tcgttctcgc 420
ttctttatcc tttatagcct ccctttttga tcaactcggc gatgggactt tcgcacggct 480
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cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 240
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taaaatagtt taggaaagtt atgtaattgg actgtataat tttttattta tttatttttt 300
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tcttcttctt ctctctctca ctctctcact ctcactctca ctctctctct ctctctctct 180
ctctctctct ctctctctct ttggatacaa ccccttttct tcttatcccg tccctcccct 240
ttataacatt ttttcacacc tccctttatt cgaacctgat ggaatcattg c 291

Claims (7)

1.一种凡纳滨对虾EST-STR标记的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物包括：
针对Lv-F2a位点：
Lv-F2a-F：5’-CCCCAAAATCGTCTTTCCAA-3’；
Lv-F2a-R：5’-GGTGGATTTAGGGAAGGCGTA-3’；
针对Lv-F7a位点：
Lv-F7a-F：5’-GAGGTGTTGAGGGAAGGTTGTG-3’；
Lv-F7a-R：5’-GAGGCCAATTACGATTGTTTCA-3’；
针对Lv-F8a位点：
Lv-F8a-F：5’-TCGCACATAGTCAAAATGGCA-3’；
Lv-F8a-R：5’-TGTGAGCCGTGCGAAAGTC-3’；
针对Lv-F9a位点：
Lv-F9a-F：5’-CTGCTGTTCGAGAAAGCTGTTC-3’；
Lv-F9a-R：5’-TTTTGGGCGCTTTGAGATTC-3’；
针对Lv-F30a位点：
Lv-F30a-F：5’-GTCCCATCGCCGAGTTGA-3’；
Lv-F30a-R：5’-TTTGAATCAGCGACACGACAG-3’；
针对Lv-F31a位点：
Lv-F31a-F：5’-CGCCAACGAATGTCTAAGAGC-3’；
Lv-F31a-R：5’-GCAATATGCAAAATGCCTGTTC-3’；
针对Lv-F36a位点：
Lv-F36a-F：5’-GCCTCGGTAACATTGTGAAGAG-3’；
Lv-F36a-R：5’-ACAGCAACCAGGGTATTCAGG-3’；
针对Lv-F40a位点：
Lv-F40a-F：5’-CATTTCCCTTTCGCATTTCTC-3’；
Lv-F40a-R：5’-GCAATGATTCCATCAGGTTCG-3’；
所述的EST-STR标记编号为Lv-F2a、Lv-F7a、Lv-F8a、Lv-F9a、Lv-F30a、Lv-F31a、Lv-F36a和Lv-F40a；
所述的Lv-F2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的Lv-F7a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的Lv-F8a的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的Lv-F9a的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的Lv-F30a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的Lv-F31a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的Lv-F36a的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的Lv-F40a的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物的正向引物的5’端标记有荧光基团。
3.根据权利要求2所述的扩增引物，其特征在于，所述的荧光基团为FAM、HEX或TAMRA。
4.一种凡纳滨对虾EST-STR标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、提取凡纳滨对虾基因组DNA；
（2）、以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，分别利用权利要求2所述的针对Lv-F2a位点的引物对Lv-F2a-F/R、针对Lv-F7a位点的引物对Lv-F7a-F/R、针对Lv-F8a位点的引物对Lv-F8a-F/R、针对Lv-F9a位点的引物对Lv-F9a-F/R、针对Lv-F30a位点的引物对Lv-F30a-F/R、针对Lv-F31a位点的引物对Lv-F31a-F/R、针对Lv-F36a位点的引物对Lv-F36a-F/R和针对Lv-F40a位点的引物对Lv-F40a-F/R进行PCR扩增；
（3）、利用测序仪对PCR扩增产物进行分型。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应体系25 μL，包括：不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5 μL、25 mM MgCl2 2.0 μL、10 mM dNTP 0.5 μL、高保真PCR酶1 U、10 μM 正向引物0.5 μL、10 μM 反向引物0.5 μL、DNA模板12.5 ng，其余由无菌双蒸水补足至25 μL。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
7.权利要求1所述的扩增引物在凡纳滨对虾群体遗传多样性研究、基因定位、遗传连锁图谱构建、种质鉴定、品种分类或分子标记辅助育种中的应用。
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