CN114457172A - 蓖麻蚕est-ssr分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓖麻蚕EST‑SSR分子标记及其应用，属于分子生物学和蚕品种鉴别技术领域。本发明从蓖麻蚕转录组序列获得了EST‑SSR 12个分子标记位点信息，并设计合成了12对扩增效率高、多态性丰富的SSR引物。利用本发明建立的方法，以20份蓖麻蚕种质为材料进行了遗传多样性分析。利用PCR扩增和电泳检测技术可完成SSR标记的检测，可直接应用于蓖麻蚕种质资源的鉴定和遗传多样性分析，在DNA水平揭示各品系的遗传变异，也为分子标记辅助育种奠定了良好的分子基础。

Description

蓖麻蚕EST-SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和蚕品种鉴别技术领域，具体涉及蓖麻蚕EST-SSR分子标记及其应用。

背景技术

蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)又称木薯蚕、印度蚕，是一种具有多化性，在适宜的环境条件下无滞育期的吐丝类经济昆虫。16世纪就已经被印度人驯化饲养，20世纪前后被引进到20多个国家与地区进行饲养繁殖，40年代被引进到我国东北、华东和华南等地。蓖麻蚕是广食性昆虫，除了摄食蓖麻叶外，还可食用木薯、臭椿和马桑等叶片。蓖麻蚕具有发育较快、易饲养、抗病性强、蚕体健壮、背光群集等优点，已经成为我国仅次于家蚕和柞蚕的第三大经济昆虫，亦可作为良好的遗传研究素材。针对蓖麻蚕开展的研究还相对比较少，仅有报道采用ISSR方法在几个品种中检测遗传多样性的分析，但ISSR标记存在重复性差等缺点，目前未见有利用蓖麻蚕转录组序列开发EST-SSR标记的报道。针对蓖麻蚕开展标记选择，用于品种分子甄别，尤其是在生产优良品种的应用显得尤为迫切需要。

微卫星(Microsatellite)又称简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，是基因组组以少数几个核苷酸(多数为2-4个)为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列。SSR包括基因组SSR(Genomic SSR,gSSR)和表达区EST-SSR(genic-SSR或EST-SSR)。gSSR是基于基因组序列开发的，而EST-SSR则是存在于表达的基因序列内的SSR，不包括内含子及非表达调控区中的SSR位点。由于EST-SSR可利用数据库中的EST序列开发，比基因组SSR更加经济，而且EST-SSR来源于DNA的转录区域，比gSSR标记具有更高的通用性，因此近年来EST-SSR标记在动植物品种资源中得到广泛开发及应用。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供蓖麻蚕EST-SSR分子标记。

本发明还要解决的技术问题是提供利用上述蓖麻蚕EST-SSR分子标记设计EST-SSR分子标记引物。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述蓖麻蚕EST-SSR分子标记及引物蓖在麻蚕种质资源的鉴定、蓖麻蚕亲缘关系或遗传多样性分析、蓖麻蚕遗传育种中的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种蓖麻蚕EST-SSR分子标记，所述EST-SSR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～12所示。

上述蓖麻蚕EST-SSR分子标记在蓖麻蚕种质资源的鉴定、蓖麻蚕亲缘关系或遗传多样性分析、蓖麻蚕遗传育种中的应用。

蓖麻蚕EST-SSR分子标记引物，所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～36所示。

上述蓖麻蚕EST-SSR分子标记引物在蓖麻蚕种质资源的鉴定、蓖麻蚕亲缘关系或遗传多样性分析、蓖麻蚕分子标记辅助育种中的应用。

包含上述蓖麻蚕EST-SSR分子标记引物的试剂盒。

进一步地，在进行PCR反应时，PCR反应体系如下：2.5μL 10×PCR buffer，2μL2.5mmol/L dNTP，1μL 10mmol/L上游引物、1μL 10mmol/L下游引物，0.3μL DNA聚合酶，1μL500ng/μL DNA模板，加入ddH₂O定容到反应终体积25μL；

PCR扩增条件如下：PCR扩增在BIO RAD T100 Thermal Cycler上进行；反应条件设为95℃预变性3min，95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s；共35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。

有益效果：

本发明基于蓖麻蚕转录组序列信息，利用MISA软件筛选EST-SSR分子标记，为种质资源保存和分子标记辅助育种提供技术支撑。本发明首先利用生物信息学方法，检测EST-SSR位点，开发出扩增良好、多态性丰富的蓖麻蚕EST-SSR分子标记，建立蓖麻蚕SSR扩增技术体系，并应用于蓖麻蚕种质资源的遗传多样性研究。

附图说明

图1 eSSR_P143在B1中的扩增峰图。

图2 eSSR_P143在B9中的扩增峰图。

图3 eSSR_P240在B1中的扩增峰图。

图4 eSSR_P240在B8中的扩增峰图。

图5 eSSR_P383在B3中的扩增峰图。

图6 eSSR_P383在B4中的扩增峰图。

图7基于12个EST-SSR对20个蓖麻蚕种质进化树分析。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：蓖麻蚕EST-SSR标记的开发方法

(1)蓖麻蚕转录组序列中SSR位点的筛选

使用MISA软件搜寻SSR位点，查找标准参数设置为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸与六核苷酸，最少重复次数分别为10、6、5、5、5与5。通过搜寻，获得含SSR位点的序列。

蓖麻蚕转录组经测序组装共产生了68 720条Contigs，总共碱基长度71 267170bp，最大的Contig长度为35 968bp，平均长度为1 037bp，GC含量为38.28％。用MISA软件在转录组序列中共检索发现存在25 174个EST-SSR位点，EST-SSR位点在转录组中总的发生频率为0.04％，平均每2.8kb出现1个EST-SSR。为了提高EST-SSR标记开发的准确性和通用性，对检索得到的含EST-SSR位点的序列与基因组数据进行了同源比对，筛选到412个具有多态性EST-SSR位点。

EST-SSR重复类型分别为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复这6类，且EST-SSR位点的重复类型的数量总体上也是随着重复基序长度的增加而减少。其中单核苷酸重复类型数量最多，为19 575个，占总EST-SSR的77.76％，其次为二核苷酸、三核苷酸重复类型，数量分别为3 250个与2 128个，占总数的12.91％与8.45％，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量最少，数量分别为179个、38个和4个，占总数的0.71％、0.15％与0.02％。EST-SSR重复基序的重复次数分布在5～70次之间。其中10～14次的EST-SSR重复次数最多为18 033个，占总数的71.63％；其次为5～9次的EST-SSR重复次数共有5 036个，占总数的20.00％；大于等于15次的EST-SSR重复次数最少有2 105个，占总数的8.36％(如表1所示)。

表1蓖麻蚕中EST-SSR的分布情况

(2)蓖麻蚕EST-SSR引物的设计与合成

利用Primer Premier 6.0软件，对SSR重复基序前后100bp左右序列进行评估并设计引物。SSR位点与侧翼序列的距离大约在50-300bp之间，引物序列的长度在18-27bp之间，GC含量为40％-60％，退火温度50-65℃之间，扩增产物的长度在80-300bp，尽量避免出现二聚体、发夹结构、错配等。

分段随机挑选40对EST-SSR利用Primer Premier 6.0软件，对SSR重复基序前后序列进行评估并设计保守引物。引物在生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

(3)蓖麻蚕EST-SSR引物的筛选

普通PCR反应：

PCR反应总体系25μL：2.5μL的10×PCR buffer，2μL的dNTP(2.5mmol/L)，各自1μL的上、下游引物(10mmol/L)，0.3μL DNA聚合酶，1μL DNA模板(500ng/μL)，加入ddH2O定容到反应终体积25μL。PCR扩增在BIO RAD T100 Thermal Cycler上进行。反应条件设为95℃预变性3min，95℃变性30s，退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s；共35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。取5μL PCR扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳初筛。

荧光引物PCR扩增：

PCR反应总体系为25μL：2.5μL的10×Taq Buffer(with MgCl2)，1μL的dNTP(mix,10μM)，各自1μL的上、下游引物(10μM,引物的5'端带有HEX或6-FAM荧光素)，0.5μL Taq酶(5U/μL)，1μL DNA模板(20～50ng/μL)，加入ddH2O定容到反应终体积25μL。PCR扩增在美国ABI的VeritiTM 96well PCR仪上进行，反应条件设为95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s，先进行10个循环；94℃变性30s，55℃退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s，再进行35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。

(4)全自动毛细管核算分析仪检测

取96孔反应板，使用记号笔标明板名、实验日期，制作电子版短片段重复序列(Short tandem repeat,STR)检测表，并自动生成上机表。使用连续加样器，吸取990μLHIDI和10μL LIZ500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10μL，将96孔板置于平板离心机中，1 200rmp离心15s。使用12排10μL排枪，对照STR检测表，在96孔板对应的孔中加入1μL的样品，将96孔板置于平板离心机中，1 200rmp离心15s。使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1 200rmp离心30s，置于PCR仪。变性程序为98℃，5min，不加热热盖，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却。将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心15s，使用美国ABI 3730xl设备检测STR样本。并且由GeneMapper v3.7软件自动生成各位点在每个样品上的图谱文件，根据峰值图获取产物片段大小。

(5)数据统计与分析

使用CONVERT(version 1.31)软件转化数据格式，利用POP-GENE(version 1.32)与PIC-CALC软件软件计算各基因座等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、近交系数(Fis)以及香农(Shannon)信息指数(I)等指标，并检验多态性位点等位基因频率是否偏离哈温平衡(Hardy-Weinbergequilibrium,HWE)。使用Structrue 2.3.4软件对群体的基因型进行贝叶斯聚类分析，检测蓖麻蚕群体潜在的遗传结构。使用PowerMarker V3.25软件对蓖麻蚕种质进行遗传距离(Nei,1983)与聚类分析(1 000次Bootstrap method检验)。

在20份蓖麻蚕种质资源中进行扩增检测。琼脂糖凝胶电泳检测发现，40对引物有9对引物出现无扩增条带或非特异性条带，其余31对聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)扩增产物均与目的条带一致，可作为候选标记进行进一步实验，有效扩增率达到77.5％。选取稳定扩增的特异性引物添加荧光标记，利用全自动毛细管核酸测序仪在20份蓖麻蚕种质资源中进行多态性性检测，最终获得12对扩增效率高、多态性丰富的EST-SSR引物，eSSR_P4，eSSR_P16，eSSR_P24，eSSR_P29，eSSR_P45，eSSR_P14，eSSR_P14，eSSR_P148，eSSR_P159，eSSR_P163，eSSR_P240eSSR_P383。

上述蓖麻蚕EST-SSR标记所对应的核苷酸序列分别为：

eSSR_P4：

GCTTTTTTGTATTTACAGGTAGAAAAATAAATGGTCTGCAACAGGAAGATTTTTTACTTTTACTGTTTTGCACACATCTATCTATAATCTCAAACTATGAAGTTTTAAAGTTTAAACGTTTTGCAATATAATTTGACATGATAAAAATTCTACGATTCAATATTAATTCGGTAATTTTCCAATTAAGCCTATATATTGTCAATAATAATAATAATAATAAATTTGTTATATATTGTTTACTATTCCTTTGTTGCTCTTGCCTATCATTTTATTTTGTTAAAATTGTAATTGCAACAGGTCAATTTAGATGAATATTTAATAAGACGATGAATATAAGAGTACTCAAATTTCATTTAAAATATTTACTCACGAGTCAAGCGCTGATAAACCCTAATACCCTGATTATTAAATATATTGG

eSSR_P24：

ATTCCTTGTTCGTTCACAAAATTCCATGTTTATGTTCGATCTCATTATTTAATTTAGAAAAGTAAAAAAACGAGGTAAAGACTACACAGTTTTTGGGATCAAATTTGGATGTGTTAATGTAACGTGTATAAAAAAAATAAAAATAAAAGAGACCATTGTATATAACTTTTGTGAATGGTGTATTATTGACAGGGAGAGAAAGAGAGAGAGAGAAGATAGAGAGAAAGAGTGAGAGACGAAGTAGAATTTTATCAGAGCATTAACCGCTTACGATATATTATATTATAGTAAGATTTTTTATTACCTTGAAAATGATTATTGTAATTTGTACAGTATTTTTATAATGAGTATTTTATATGATATTTGTTTAGTAAGTCGTTGTCGCGAGGAGGGTCTCTCGTCCACGCTTTGA

eSSR_P29：

ATTAATAGAGTAATGTATATTTAATGAACGCAGGGGACGGACGTTTGTGAGGCGAGATTGAGTGTTGCGCGCCGGCGGGACGTAGGCGCCGTCACGTACACTGTGATACGTCATTCCGCCACCGGTCGCATCCGCCTCACATCCACTACACATCCGGCCCGCATCCCGGACTCGCTGCAACTGCCGGACCGGGATCGCGGATATATATATATATATATATAAATAATTTCTTTAGTCATTGACACCACCTTGGAACAATTTAAATTATTATAAACTCGTTAAGACGGGGGGTCCCTTATTCGTGTGGATGCGTATTTTAATTTAAACACATCAAAAAATATAAAAATTGAAACACCTACATACTCATACAAGACACATACACACCCCATACAAACATGTGTTAGTTATTTATTTGAACGG

eSSR_P383：

TAATTATTCTCGTTTGAAAGTACAAAAAATGGTTACATACGTGAAATATAATCTGTAACACAATACACATGGACATTAGAATTAATGAAGACAAATAATGTTATAATAAAACATAAGTAAAATAATCCTTTGCAATTTACGTCCGATTAAAATCATTATTACTATTATTATTAATAACACGTGCACTGAGTGTGACTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTAATCTGTAGCATGTTAGTTACATATGTATGGTAGCGGCAGTGTAACGAGCCTCACCCCGGCGCCAGTTCCATTGTGAGGGGCGATACTACAAACAAACAAACAAAGAAATAGTAAGAAAATTTATAAAAAAAGGTTTTCATACATTTAATCGTTATTTGAAATTACGACTTCCTAGCGCGCGTTTTTAGTAAAAT

eSSR_P45：

CACTATAAATTTATAGCCATAATCGTGTATCACAGCAACTCTAGCCTGAATTGTTAAATAGTAAAGAATGTGTTCTGCTGATTCACAGCCTAAAATCTAAAAGTAGATAATTTTATAATTATATTATTAATATTATTAAATAACTTGACACTTTGTAATACAGCCGTCATTAACAACGCTTCAACTGGCCGTTATGCCAAATATATATATATATATATATATAAATAATTATTATCGCCAAATTTACTAAGTTAATGACACCGTAAGGCTACTAATGATTGAAATAACGAACACAGTTCAATTCTATTAAAGCGATACACGCATGTATGTTGATTTTAAATACTTATAAGCAGCGGCGGCTCTAGACCTTGTAGCGCCCGTGTGCAACGAATAAATACCCTGGCGCCCTCAAGTAGGCGCAC

eSSR_P144：

TATATTTACTTTATATCTCTTTAATTCTTTAGCTTCATAAATTATATTATTTTTGTCTTAACTTGTAAAAACTAACTTTCAATTTATTAACTAACCGACTAACGATAACTAGATATACGTACGTTGCGCAATGTTGTGGCGTCCGCTCGTGTTCGTTCCGATAGTTATTAATCACTCTCCGGGCGGGTTGTTCATCCATCATTATTATTATTATTATTATAAATAAAATATAAATTAATGTCAAAAAAAAATAAAAAATAAAAACAAGTGATAGATTTCGTTGTAAAACTAGCCCCGGAAAGACACGCGCGGCCGCCACGCGTCGCCGAGAAAAACGTGAGATGGTACTCATAAATGTGTACGCACACACACACACACACACAGACGGGAACCGTAACGGTGCCGGCAGGAACCGATC

eSSR_P163：

TGATGTTCCCTTTATTGCCAGTGGGGACGTGCCCCAGACTCGACTCGACCCGACCCGTCTCGACCAGACTCGACCCGACCCGGATCGACCAGACTCGACCCGAGTGTCGGTAACTTGTTGAAACGAGTCGATATGCATGTTGCTCGACGCAGACAGGCCGCGCCCGACTACATACCTAAACGCTCGTCACACACGCACGTCACACACACACAACACACACATTAGTTATGATTACGTATGTACTGAAGCTTTATAAACAAACAACGTAACAATGTCTTTGAGAGAAACATCGCTGTATTACTTGAACTGAACGACGCAACGTTCGAAGGCACTAAATAAAACCTTGTACCAGTGACAATCACAATCGATTATGCAGATTAGGGGCCCTACAAGTATTACGTAAGCAATCTCT

eSSR_P148：

TTTCAGTTATAAAATTATTCAAACAATGTATGTTAAACATTAAGGCGCTTGTGTATTTTAAAATAATTACCTCGACTATTCAAATAATTAATTACGTTACGTAATTAATTAATTAATTCGATTACCTTGTGTATCTGTTATGTATTAAGGTAATTATTCTAAATATCTATGTGTAATTAATTATTTTACGTATTTATGTAATTATTATTATTATTATTATTATCGATTTTTATGCTGTATTTTAATCATTCTGGTTGTTTTATATTTTGATATATCGACCGCTAATGATTTAACACGACTTTATGCCTCGCGCGACATTATTATTGACTCTTTCCAAGGGTGTTTTTGATCGTCTATGTTCAATTTTTCAAAGAATTCACTTTAACCCCTTGAGCTACTAACCTGGCGTTTACGCCAGCTT

eSSR_P16：

TGTTTATCAATAATTGTTTGAATACTTAATATTACTCAGCAACAATAATAATTAACATCTCTTTCATTAGGATATATATTACAGTAATAAATGTAAGGCAAATACTATTTTTATTTTTGATAAACTTACTTGGTTTTTACAGTTAATAGGATTTGATCCATAACGAAATATATCCAAAATCTTCGTTTTAGTCCAAACTGACAACAACAACAACACGTTTGTTTTCTATTTATCAATATTGTTTTTGACATTTTTTACGATGTTACCATACATAAAATATTTTCCTTAATATTTATTAGGAAATTGATGTCTCTTTCAACTGACAACTCTTTTAACTTTAACCCGAACTAAAAGTTGGGTTGTGCACTCGAAACTTTGCTACTGTTATGGTTAAAGATATAGTAAAGATTAAGTT

eSSR_P143：

TTGTTAGTCTGATGATCCTTAATAATTTTAACTGACACAATAGCACCATAAGGACCAAACAGCTGCCACAATGTTAACTCCTCCACTTCAGAAGCAATATTATAAACATAAATAGACCATGTGCTTGGTGAATTGTGATCACCAATAGAGCTCAATTGATTAATCCAATGGTAAGGCCTCAATAGAGAATTTTTAGAAAAATTATTATTATTATTCTTATACTTATGAGGATTACTTTTATTTGCATACTTAACCGTTAATGGGTGTAAAAAGCCAGGCGGTGTAGAACCATTTATGTTTTGGATAGCTCTCTCTGCTTCATAATGGTGCTCATACAGAACGAAGGCAATACCAGCAGCTATACGAGAATTAACTATTCTACCAAATTGTGCGAACAGTCCATGTAAATCTTGCA

eSSR_P159：

CATGTTTTGAAATGATAAGTAATTTGTCGAAAAAAAATCCAGTATAACTTTAACTCAGTAAAGTATTTACGGAAAATTCAAAGAAACTGGTCATTTTATTAAGTAGAAAAATAAACAGTCGGAGGATTTCACATCGTTCGATTAAACCATATATAATAATGTGCAAGAACGCACACACGTATTTACTTGTATAAAACACTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGCAGCACATTCGGTTGATAGTGTCGTCAGGTTGTTTCGTTTGTCGCATCTTGTTTGTTCATGATTGTTTTAGTTATTGTTCTCGTCGTTCTGAAAACAAATTAATATGTTTCATTACATTTTTCTTATATTCTAATGTTTATTAATATGTCGATTGATGCCCGTAAAAATGAGACAATAGGGAAACGGTGGAAAGTTGG

eSSR_P240：

AATAATGTTAAAATGGTATATTTATTACAATCCAATATCTCCAGTCGGCAATCGGTGTAACATCATACAAAAAATTTTTCTTACGCCGACTAATCCAATAATTCTAACAATTTATTATAAAATTATATAATCTTTTGGTACAATCCATTTTAAGTGCACTTTTTAAAATGTTACGACATAGTGACGTAAAGGCTACTCTTTATATATATATATATATATATATGTATGTATATATAGAATAAGCATATAGTTGTATGGGAATTCATAATTCCCTAATTTAATTAAATGTCTCTGAATTAGGCTGAAAGGATTCTATACCTTTGCTTTGAAATCAAACAAACGTAATAAAACTAACTAAAGATAAGGTCGTGCGTTGCGCCATTTCTTTTTTAAAATTGATATCTATATATCACCTATTTGGT

表2 EST-SSR中多态性条带与引物信息

注：B1-21为20个蓖麻蚕种质资源名称。(B1：闽白；B2：闽一A；B3：闽一B；B4：高一；B5：印黄；B6：白黄；B7：海蓝；B8：花蓝；B9：徐一；B10：75；B11：51；B12：镇蓖12；B13：油；B14：斑A；B15：闽75；B16：蓖樗A；B17：镇蓖17；B18：南一；B19：斑B；B21：樗B；)

实施例2：蓖麻蚕EST-SSR标记体系特征。

PCR反应总体系25μL：2.5μL的10×PCR buffer，2μL的dNTP(2.5mmol/L)，各自1μL的上、下游引物(10mmol/L)，0.3μL DNA聚合酶，1μL DNA模板(500ng/μL)，加入ddH₂O定容到反应终体积25μL。

PCR扩增在BIO RAD T100 Thermal Cycler上进行。反应条件设为95℃预变性3min，95℃变性30s，退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s；共35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。取5μL PCR扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳初筛。

引物序列、重复基序、片段大小及退火温度详细见下表3：

表3 EST-SSR引物序列信息

利用POP-GENE(Version 1.32)与PIC-CALC软件计算EST-SSR扩增等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、近交系数(Fis)、香农(Shannon)信息指数(I)，并检验多态位点等位基因频率是否偏离哈温平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE).结果表明，使用本专利公开的12对EST-SSR在20个蓖麻蚕品种中扩增，等位基因(Na)数检出28个，平均值2.33个。有效等位基因(Ne)数共检测出43.995个，变化范围在1.051～3.884个之间，平均值为1.629个。平均观测杂合度(Ho)与平均期望杂合度(He)分别为0.154、0.265。Fis平均值0.366，香农多态性指数I为0.426，说明20个蓖麻蚕总体上存在近亲交配现象，部分个体处于轻微的杂交状态。

表4 EST-SSR遗传多样性与Hardy-Weinberg平衡检验

①观察到等位基因数。

②有效等位基因数。

③观测杂合度。

④期望杂合度。

⑤多态信息含量。

⑥近交系数。

⑦香农指数。

⑧Hardy-Weinberg平衡卡方检验P值，*：P<0.050，**：P<0.010。

本发明的12个EST-SSR标记可用于蓖麻蚕种质资源的遗传多样性分析、分子标记辅助育种等，具有很好的多态性、重复性、通用性，是一种可靠有效的分子标记。

序列表

<110> 江苏科技大学

<120> 蓖麻蚕EST-SSR分子标记及其应用

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 418

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcttttttgt atttacaggt agaaaaataa atggtctgca acaggaagat tttttacttt 60

tactgttttg cacacatcta tctataatct caaactatga agttttaaag tttaaacgtt 120

ttgcaatata atttgacatg ataaaaattc tacgattcaa tattaattcg gtaattttcc 180

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tattcctttg ttgctcttgc ctatcatttt attttgttaa aattgtaatt gcaacaggtc 300

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atttactcac gagtcaagcg ctgataaacc ctaataccct gattattaaa tatattgg 418

<210> 2

<211> 412

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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tatttgttta gtaagtcgtt gtcgcgagga gggtctctcg tccacgcttt ga 412

<210> 3

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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tactcataca agacacatac acaccccata caaacatgtg ttagttattt atttgaacgg 420

<210> 4

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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aatttactaa gttaatgaca ccgtaaggct actaatgatt gaaataacga acacagttca 300

attctattaa agcgatacac gcatgtatgt tgattttaaa tacttataag cagcggcggc 360

tctagacctt gtagcgcccg tgtgcaacga ataaataccc tggcgccctc aagtaggcgc 420

ac 422

<210> 6

<211> 418

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatatttact ttatatctct ttaattcttt agcttcataa attatattat ttttgtctta 60

acttgtaaaa actaactttc aatttattaa ctaaccgact aacgataact agatatacgt 120

acgttgcgca atgttgtggc gtccgctcgt gttcgttccg atagttatta atcactctcc 180

gggcgggttg ttcatccatc attattatta ttattattat aaataaaata taaattaatg 240

tcaaaaaaaa ataaaaaata aaaacaagtg atagatttcg ttgtaaaact agccccggaa 300

agacacgcgc ggccgccacg cgtcgccgag aaaaacgtga gatggtactc ataaatgtgt 360

acgcacacac acacacacac acagacggga accgtaacgg tgccggcagg aaccgatc 418

<210> 7

<211> 412

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgatgttccc tttattgcca gtggggacgt gccccagact cgactcgacc cgacccgtct 60

cgaccagact cgacccgacc cggatcgacc agactcgacc cgagtgtcgg taacttgttg 120

aaacgagtcg atatgcatgt tgctcgacgc agacaggccg cgcccgacta catacctaaa 180

cgctcgtcac acacgcacgt cacacacaca caacacacac attagttatg attacgtatg 240

tactgaagct ttataaacaa acaacgtaac aatgtctttg agagaaacat cgctgtatta 300

cttgaactga acgacgcaac gttcgaaggc actaaataaa accttgtacc agtgacaatc 360

acaatcgatt atgcagatta ggggccctac aagtattacg taagcaatct ct 412

<210> 8

<211> 421

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttcagttat aaaattattc aaacaatgta tgttaaacat taaggcgctt gtgtatttta 60

aaataattac ctcgactatt caaataatta attacgttac gtaattaatt aattaattcg 120

attaccttgt gtatctgtta tgtattaagg taattattct aaatatctat gtgtaattaa 180

ttattttacg tatttatgta attattatta ttattattat tatcgatttt tatgctgtat 240

tttaatcatt ctggttgttt tatattttga tatatcgacc gctaatgatt taacacgact 300

ttatgcctcg cgcgacatta ttattgactc tttccaaggg tgtttttgat cgtctatgtt 360

caatttttca aagaattcac tttaacccct tgagctacta acctggcgtt tacgccagct 420

t 421

<210> 9

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtttatcaa taattgtttg aatacttaat attactcagc aacaataata attaacatct 60

ctttcattag gatatatatt acagtaataa atgtaaggca aatactattt ttatttttga 120

taaacttact tggtttttac agttaatagg atttgatcca taacgaaata tatccaaaat 180

cttcgtttta gtccaaactg acaacaacaa caacacgttt gttttctatt tatcaatatt 240

gtttttgaca ttttttacga tgttaccata cataaaatat tttccttaat atttattagg 300

aaattgatgt ctctttcaac tgacaactct tttaacttta acccgaacta aaagttgggt 360

tgtgcactcg aaactttgct actgttatgg ttaaagatat agtaaagatt aagtt 415

<210> 10

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttgttagtct gatgatcctt aataatttta actgacacaa tagcaccata aggaccaaac 60

agctgccaca atgttaactc ctccacttca gaagcaatat tataaacata aatagaccat 120

gtgcttggtg aattgtgatc accaatagag ctcaattgat taatccaatg gtaaggcctc 180

aatagagaat ttttagaaaa attattatta ttattcttat acttatgagg attactttta 240

tttgcatact taaccgttaa tgggtgtaaa aagccaggcg gtgtagaacc atttatgttt 300

tggatagctc tctctgcttc ataatggtgc tcatacagaa cgaaggcaat accagcagct 360

atacgagaat taactattct accaaattgt gcgaacagtc catgtaaatc ttgca 415

<210> 11

<211> 446

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catgttttga aatgataagt aatttgtcga aaaaaaatcc agtataactt taactcagta 60

aagtatttac ggaaaattca aagaaactgg tcattttatt aagtagaaaa ataaacagtc 120

ggaggatttc acatcgttcg attaaaccat atataataat gtgcaagaac gcacacacgt 180

atttacttgt ataaaacact cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 240

cacacacgca gcacattcgg ttgatagtgt cgtcaggttg tttcgtttgt cgcatcttgt 300

ttgttcatga ttgttttagt tattgttctc gtcgttctga aaacaaatta atatgtttca 360

ttacattttt cttatattct aatgtttatt aatatgtcga ttgatgcccg taaaaatgag 420

acaataggga aacggtggaa agttgg 446

<210> 12

<211> 422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aataatgtta aaatggtata tttattacaa tccaatatct ccagtcggca atcggtgtaa 60

catcatacaa aaaatttttc ttacgccgac taatccaata attctaacaa tttattataa 120

aattatataa tcttttggta caatccattt taagtgcact ttttaaaatg ttacgacata 180

gtgacgtaaa ggctactctt tatatatata tatatatata tatgtatgta tatatagaat 240

aagcatatag ttgtatggga attcataatt ccctaattta attaaatgtc tctgaattag 300

gctgaaagga ttctatacct ttgctttgaa atcaaacaaa cgtaataaaa ctaactaaag 360

ataaggtcgt gcgttgcgcc atttcttttt taaaattgat atctatatat cacctatttg 420

gt 422

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgttttgca cacatctatc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggcaagagca acaaaggaat 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttcgtttta gtccaaactg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaagtttcga gtgcacaacc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgggatcaaa tttggatgtg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgtaagcggt taatgctctg a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgcctcacat ccactacaca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgcatccaca cgaataaggg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgcttcaact ggccgttatg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gccgccgctg cttataagta 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccatgtgctt ggtgaattgt ga 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttctacaccg cctggctttt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tacgttgcgc aatgttgtgg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgtctttcc ggggctagtt 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgattacctt gtgtatctgt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgaggcataa agtcgtgtta 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cggaggattt cacatcgttc g 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcgacaaacg aaacaacctg a 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acctaaacgc tcgtcacaca 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cgttgcgtcg ttcagttcaa 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

agtgacgtaa aggctactct 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gcaacgcacg accttatctt 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

taacacgtgc actgagtgtg 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gggtgaggct cgttacactg 20

Claims (6)

1.一种蓖麻蚕EST-SSR分子标记，其特征在于，所述EST-SSR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～12所示。

2.权利要求1所述蓖麻蚕EST-SSR分子标记在蓖麻蚕种质资源的鉴定、蓖麻蚕亲缘关系或遗传多样性分析、蓖麻蚕遗传育种中的应用。

3.蓖麻蚕EST-SSR分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQID NO:13～36所示。

4.权利要求3所述蓖麻蚕EST-SSR分子标记引物在蓖麻蚕种质资源的鉴定、蓖麻蚕亲缘关系或遗传多样性分析、蓖麻蚕分子标记辅助育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用权利要求3所述的蓖麻蚕EST-SSR分子标记引物进行PCR反应的反应体系及扩增条件如下：

PCR反应体系如下：2.5μL 10×PCR buffer，2μL 2.5mmol/L dNTP，1μL 10mmol/L上游引物、1μL 10mmol/L下游引物，0.3μL DNA聚合酶，1μL 500ng/μL DNA模板，加入ddH2O定容到反应终体积25μL；

PCR扩增条件如下：PCR扩增在BIO RAD T100 Thermal Cycler上进行；反应条件设为95℃预变性3min，95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s；共35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。

6.包含权利要求3所述蓖麻蚕EST-SSR分子标记引物的试剂盒。

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