CN113699266A - 大麻ssr分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农作物分子生物学技术领域，具体涉及大麻SSR分子标记及其应用。本发明提供12个大麻SSR分子标记，还提供一套适于毛细管电泳平台的检测所述SSR分子标记的引物组合。利用这12个SSR分子标记可以：鉴定大麻品种及分析遗传多样性；区分大麻格列西亚和汉麻7号、龙大麻5号和龙麻1号、庆大麻3号和尤纱‑31等品种。通过本发明的大麻SSR分子标记的应用，能够在基因组水平上拓展大麻可用标记位点的范围；为大麻品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供新工具，应用前景良好。

Description

大麻SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及农作物分子生物学技术领域，具体涉及大麻SSR分子标记及其应用。

背景技术

大麻(Cannabis sativa L.)是大麻科大麻属一年生草本植物，有重要的工业及药用价值。大麻茎皮可以沤制纤维；果实因富含油脂可用作食物油；大麻仁是上等的中药材，具有润滑、活血等作用，可治疗肠燥便秘、消渴、热淋、风痹、癣痢等病。近年，欧洲通过大麻提取物临床应用发现大麻对癌症有抑制作用。大麻素是大麻生长发育过程中产生的萜酚类化合物，其中酚类化合物是主要的研究对象，包括大麻酚(CBN,cannabinol)、大麻二酚(CBD,cannabidiol)、次大麻二酚(CBDV,Cannabidivarin)等。以大麻二酚(CBD)为代表的酚类物质具有丰富的药理学作用。

大麻种植广泛，品种繁多，且随着育种进程的加快，其品种数量也急剧增加。对大麻品种的鉴定、遗传多样性分析及DNA指纹数据库的构建，可以客观、全面了解当前大麻品种现状，对于品种管理、品种选育以及种质资源收集和保护具有重要意义。大麻各类群间种质资源来源地较为混乱，其原因可能是种质资源在国与国之间、地区与地区之间频繁交流所致，导致部分品种的来源地并不是其原产地。并且大麻是雌雄异株、异花授粉作物，在培育过程中极易接受外来花粉干扰，品种间极易杂交，所以品种内易混杂、纯度低，严重影响工业大麻种子质量和新品种培育。目前，同名异物、同物异名的现象在国内已有显现。

大麻尤纱-31是中国从乌克兰引进的高纤维含量品种；格列西亚、汉麻7号、龙大麻5号、龙麻1号和庆大麻3号是中国经过育种改良的杂交品种，其除了纤维含量高、抗病抗倒伏的优点外，还适宜在中国东北部种植。将格列西亚、汉麻7号、龙大麻5号、龙麻1号、庆大麻3号和尤纱-31在田间种植，通过调查和观测其农艺性状发现，格列西亚和汉麻7号、龙大麻5号和龙麻1号、庆大麻3号和尤纱-31分别在子叶形状、子叶色、雄开花日数、雌开花日数、雌花色、株高和茎粗上有很大的相似性(表1)，在外观上很难加以分辨。这些品种的种子如若发生混淆，不仅造成市场混乱，品种优势不得体现，还会严重影响大麻育种研究工作。因此，对这些相似品种加以区分，对大麻的市场价值和科研价值都有着现实意义。而传统的品种真实性鉴定是田间种植后，通过对农艺性状的观测和调查来实现，这种方法工作量大、繁琐，费人力物力财力。

分子标记鉴定技术在作物指纹图谱构建中显示出了独特的优越性，是品种鉴定的主要手段。其中，简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)标记技术具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、扩增稳定、引物序列易于交流等特点而受到广泛重视。简单重复序列又称微卫星(Microsatellites)，是一种由1-6个核苷酸为重复单元的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组的编码区和非编码区。在植物育种中，SSR已经成为一种重要的分子标记，目前，基于SSR标记的水稻、玉米、马铃薯等作物主栽品种的DNA指纹图谱数据库已构建完成，但至今鲜有大麻SSR指纹图谱构建及品种鉴定的报道。因此，开发大麻SSR分子标记具有重要意义。

表1大麻品种的主要农艺性状调查

性状

格列西亚

汉麻7号

龙大麻5号

龙麻1号

庆大麻3号

尤纱-31

子叶形状

长椭圆

长椭圆

卵圆

卵圆

卵圆

卵圆

子叶色

绿

绿

深绿

深绿

深绿

绿

雄开花日数(天)

90.33±5.67

89.33±6.38

87.21±3.95

85.79±4.14

93.48±6.31

94.12±5.73

雌开花日数(天)

117.45±6.77

116.09±5.91

112.13±4.58

111.90±5.12

119.41±7.35

120.48±6.69

雌花色

黄绿

黄绿

绿

绿

黄绿

黄绿

株高(厘米)

165.35±23.24

153.87±25.17

197.03±22.72

195.28±28.43

111.76±23.74

108.88±20.38

茎粗(厘米)

0.78±0.14

0.72±0.13

0.64±0.15

0.67±0.14

0.53±0.17

0.59±0.15

发明内容

本发明的目的是提供大麻SSR分子标记及其扩增引物。本发明的另一目的是提供大麻SSR分子标记及其扩增引物的应用。

为了实现本发明的目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型种类丰富、代表性强的大麻材料，对相应材料的大麻基因组进行测序并比较，进而获得了大麻的SSR分子标记。

本发明提供大麻SSR分子标记，所述分子标记包括以下12个SSR分子标记的一个或多个，12个SSR分子标记分别为ANUCS306，47，CAN0126，H09CANN2，ANUCS303，CAN0576，CAN0039，C11CANN1，43，CAN2354，40，CAN0890。

所述12个SSR分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.1-2，SEQ IDNO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQID NO.23-24。

上述SSR分子标记可采用本领域常规技术手段进行检测，同时，本发明提供的上述大麻SSR分子标记能够适用于毛细管电泳检测技术。利用SSR标记技术进行品种鉴定的关键之一是扩增片段检测技术。现有研究多利用较为复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染进行检测。但该技术由于分辨率低，难以明确区分扩增片段间几个碱基的差异，且对仪器设备和人员技能要求相对较高，不利于普及。而基于毛细管电泳检测技术的SSR分子标记技术则可以得到定量的DNA片段分析数据。与常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，其结果更为精确、灵敏、高效，更适用于大批量品种的检测分析。

在进行毛细管电泳检测时，可将上述SSR分子标记分为若干个不同荧光标记组，每组内的荧光标记相同。

作为本发明的一种实施方式，可将上述SSR分子标记分为四个不同荧光标记组，每组内的荧光标记相同：

第一组由SSR分子标记ANUCS306，47，CAN0126，H09CANN2组成；第二组由SSR分子标记ANUCS303，CAN0576，CAN0039组成；第三组由SSR分子标记C11CANN1，43，CAN2354组成；第四组由SSR分子标记40，CAN0890组成。

进一步，本发明提供了用于扩增上述SSR分子标记的特异性引物。

优先地，所述特异性引物包括如下引物对中的一个或多个：SEQ ID NO.1-2，SEQID NO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQID NO.23-24。

本发明还提供一种试剂盒，其含有上述用于扩增上述SSR分子标记的特异性引物。

本发明还提供大麻基因组芯片，其含有以上所述的大麻SSR分子标记。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在构建大麻品种DNA指纹数据库中的应用。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻种质资源遗传多样性分析或种子质量检测中的应用。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻品种鉴定、亲缘关系分析、母系溯源中的应用。

对于大麻品种的鉴定，作为示例，本发明提供在区分大麻格列西亚和汉麻7号、龙大麻5号和龙麻1号、庆大麻3号和尤纱-31品种中的应用。

本发明还提供用于区分大麻格列西亚和汉麻7号、龙大麻5号和龙麻1号、庆大麻3号和尤纱-31品种的试剂盒，其含有针对本发明的12个大麻SSR分子标记的特异性引物组合。优选地，所述特异性引物组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-24所示。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供上述大麻SSR分子标记在制备大麻基因组芯片中的应用。

以上所述的应用，具体包括以下步骤：

1)提取待测大麻样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述大麻SSR分子标记，进行PCR扩增；

3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。

上述应用的步骤2)中，PCR扩增采用20μL的反应体积，含样品DNA 10-40ng，正向引物、反向引物各0.4μM，2×聚合酶混合物10μL。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。

步骤3)中，可通过进行一次性毛细管电泳，将得到的扩增产物的电泳图进行比较，通过分析电泳图的条带情况确定大麻品种。

本发明提供的上述12对SSR引物可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，每对引物的其中一条的5'端标记荧光基团；配制PCR反应体系加入DNA、引物、聚合酶混合物；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。

优选地，将本发明的12对特异性SSR引物进行荧光染料标记，共选用了PET、NED、VIC、FAM四种荧光染料。将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.5μL LIZ500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LIZ500进行比较，直接给出目标DNA片段的准确大小。

在本发明的实施例的一个较佳实施方案中，FAM荧光标记组的SSR分子标记为ANUCS306，47，CAN0126，H09CANN2；VIC荧光标记组的SSR分子标记为ANUCS303，CAN0576，CAN0039；NED荧光标记组的SSR分子标记为C11CANN1，43，CAN2354；PET荧光标记组的SSR分子标记为40，CAN0890。以大麻格列西亚DNA为模板，分别用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物的PCR产物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以大麻格列西亚的DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物的PCR产物混合物进行一次毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与FAM、VIC、NED、PET四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1A-图1D)，可以看到，在FAM、VIC、NED、PET单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物组合(共12对引物)可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以汉麻7号(图2A-图2D)、龙大麻5号(图4A-图4D)、龙麻1号(图5A-图5D)、庆大麻3号(图7A-图7D)和尤纱-31(图8A-图8D)DNA为模板进行相同的实验，可得到相同的结论。

实施例中分别以大麻格列西亚和汉麻7号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合进行一次性毛细管电泳，分别得到大麻格列西亚和汉麻7号的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，格列西亚在93、111、132、144、186、195、200、206、220、226、232和236bp出现FAM蓝色峰，汉麻7号在93、108、144、186、200、232和235bp出现FAM蓝色峰；格列西亚在161、197、206和243bp出现VIC绿色峰，汉麻7号在170、197、206和231bp出现VIC绿色峰；格列西亚在172、179、241、313、315和331bp出现NED黄色峰，汉麻7号在172bp、229、236、310、325和328bp出现NED黄色峰；格列西亚在210和252bp出现PET红色峰，汉麻7号在210、216和255bp出现PET红色峰。格列西亚及汉麻7号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，且均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分格列西亚和汉麻7号。相同地，用本发明提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分龙大麻5号和龙麻1号(图6)、庆大麻3号和尤纱-31(图9)。

本发明的不同荧光标记的扩增产物可在同一泳道中进行电泳，其信号清晰，扩增片段大小差异明显，可精确计算片段大小，每个DNA样品电泳峰型各异，易于判断。具有灵敏度高、分辨力好，结果准确可靠、高效快速等优点。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将不同的大麻品种区分开(例如：格列西亚和汉麻7号、龙大麻5号和龙麻1号、庆大麻3号和尤纱-31品种)，实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势。本发明提供的该组引物可用于大麻指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。

附图说明

图1A-图1D分别为大麻格列西亚SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图1A为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图1B为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图1C为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图1D为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。各图比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的DNA指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。

图2A-图2D为大麻汉麻7号的SSR荧光标记毛细管电泳检测结果。其中，图2A为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图2B为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图2C为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图2D为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。各图的比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的DNA指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。图1A-图1D和图2A-图2D均为了说明同一个目的，两个品种(格列西亚和汉麻7号)的实验结果更能说明本发明提供的引物组合的实用性与可靠性。

图3为用本发明提供的12个大麻SSR分子标记对格列西亚和汉麻7号进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。结果说明，格列西亚(上图)显示的FAM目的峰(蓝色)与汉麻7号(下图)显示的FAM目的峰(均用箭头标出)清晰可辨，且目的峰分子量不同。同理，两个品种显示的VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本发明提供的引物组合能够对格列西亚及汉麻7号进行品种区分。

图4A-图4D分别为龙大麻5号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图4A为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图4B为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图4C为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图4D为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图5A-图5D分别为大麻龙麻1号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图5A为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图5B为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图5C为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图5D为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图6为用本发明提供的12个大麻SSR分子标记对龙大麻5号和龙麻1号进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。两个品种显示的FAM、VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本发明提供的引物组合能够对龙大麻5号及龙麻1号进行品种区分。

图7A-图7D分别为大麻庆大麻3号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图7A为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图7B为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图7C为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图7D为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图8A-图8D分别为大麻尤纱-31SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图8A为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图8B为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图8C为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图8D为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图9为用本发明提供的12个大麻SSR分子标记对庆大麻3号和尤纱-31进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。同理，两个品种显示的FAM、VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本发明提供的引物组合能够对庆大麻3号及尤纱-31进行品种区分。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

若未特别说明，本发明实施例所用生化试剂均为市售，所用大麻材料均为本领域公知公用的大麻，其中，尤纱-31的品种审定登记编号为黑登记2006005，龙大麻1号的品种审定登记编号为黑登记2011003，龙大麻2号的的品种审定登记编号为黑登记2013009，火麻一号的品种审定登记编号为黑登记2015005，庆大麻1号的品种审定登记编号为黑登记2016012，龙大麻3号的品种审定登记编号为黑登记2016013，龙麻1号的品种审定登记编号为黑认定2017002，汉麻2号的品种审定登记编号为黑认定2017003，汉麻1号的品种审定登记编号为黑认定2017004，龙麻2号的品种审定登记编号为黑认定2017005，格列西亚的品种审定登记编号为黑认定2017006，汉麻5号的品种审定登记编号为黑认定2018001，汉麻4号的品种审定登记编号为黑认定2018002，牡麻1号的品种审定登记编号为黑认定2018003，庆大麻2号的品种审定登记编号为黑认定2018004，线麻1号的品种审定登记编号为黑认定2018005，龙大麻4号的品种审定登记编号为黑认定2019001，庆大麻3号的品种审定登记编号为黑认定2019002，庆大麻4号的品种审定登记编号为黑认定2019003，汉麻6号的品种审定登记编号为黑认定2019004，汉麻7号的品种审定登记编号为黑认定2019005，龙大麻5号的品种审定登记编号为黑认定2019006。

实施例1大麻SSR分子标记及引物的确定

根据22个大麻品种(尤纱-31、龙大麻1号、龙大麻2号、火麻一号、庆大麻1号、庆大麻3号、龙麻1号、汉麻2号、汉麻1号、龙麻2号、格列西亚、汉麻5号、汉麻4号、牡麻1号、庆大麻2号、线麻1号、龙大麻4号、庆大麻3号、庆大麻4号、汉麻6号、汉麻7号、龙大麻5号)的基因序列，寻找SSR位点，设计了300对SSR引物；提取大麻格列西亚、汉麻7号、龙大麻5号、龙麻1号、庆大麻3号和尤纱-31的DNA，分别用这300对引物对这六个品种进行PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析比较每对引物的退火温度、是否可扩增、条带特异性、清晰度以及是否均能在六个品种中获得稳定的单一条带等参数，初步筛选出200对引物；对这些引物进行荧光标记，然后对这六个品种的DNA进行PCR和毛细管电泳，根据每个引物的出峰强度、基因型读取难易程度等条件，筛选出60对引物；再根据每对引物的等位基因的分子量范围、PIC值等，初步对这些引物进行分组，根据每个组合由尽可能多的引物组成、且组内所有引物等位基因范围不叠加、引物间互不干扰程的条件，以及最重要的是，能准确读取格列西亚、汉麻7号、龙大麻5号、龙麻1号、庆大麻3号和尤纱-31的基因型数据，且对相应的品种组合能加以区分的条件，最终确定了四组共12对SSR引物。将这个引物组合并分别合成带FAM、VIC、NED、PET荧光基团的引物(见表2)。本领域技术人员能够理解，本领域内还可选择包括FAM、VIC、NED、PET在内的其他荧光基团来修饰表2中的四组引物，只要每组内引物标记相同的荧光基团即可，不限于选择哪一种荧光基团。

表2大麻SSR毛细管电泳引物及引物组合

实施例2利用本发明提供的SSR分子标记区分大麻品种

(1)DNA快速提取

采用CTAB法对大麻种子进行DNA提取。此方法操作快速简便，提取的DNA质量高，适用于植物分子生物学领域的DNA制备，而且对大幅度缩短种子纯度检验、转基因检测时间，提高检测效率，降低检测成本具有重要意义。具体操作步骤为：取大麻种子若干粒进行研磨成粉，置于1.5mL离心管中；在离心管中加入700μL CTAB提取液，65℃孵育30min；在离心管中加入500μL氯仿-异戊醇(24：1)，剧烈震荡，12000rpm离心10min；取上清，加入0.7倍体积的异丙醇，12000rpm离心5min；去掉上清液，用75％乙醇洗涤沉淀2次；室温干燥沉淀，加入200μL TE缓冲液(pH 8.0)，充分溶解后备用。

(2)DNA样品的质量和数量

在紫外分光光度仪上检测DNA样品260nm和280nm的OD值，选择OD_260/280值为1.8-1.9的样品用于检测。

(3)核心引物选择

通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、PCR扩增稳定性和扩增产物带型，选择实施例1确定的能够满足毛细管荧光检测技术的引物，具体见表2。

(4)PCR扩增和毛细管电泳检测

将筛选出的特异性SSR引物进行荧光染料标记，共选用PET、NED、VIC、FAM四种荧光染料。PCR扩增采用20μL的反应体积，含样品DNA 10-40ng，正向引物、反向引物各0.4μM，2×聚合酶混合物10μL。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。

将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.5μL LIZ500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LIZ500进行比较，直接给出目标DNA片段的准确大小。表2中各组引物扩增大麻格列西亚和汉麻7号所得的扩增产物的目的条带大小见表3。表2中各组引物扩增大麻龙大麻5号和龙麻1号所得的扩增产物的目的条带大小见表4。表2中各组引物扩增大麻庆大麻3号和尤纱-31所得的扩增产物的目的条带大小见表5。

表3格列西亚和汉麻7号的目的条带大小比较

表4龙大麻5号和龙麻1号的目的条带大小比较

表5庆大麻3号和尤纱-31的目的条带大小比较

(5)引物组合的判定

以大麻格列西亚DNA为模板，分别用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以格列西亚DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与FAM、VIC、NED、PET四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1A-1D)，可以看到，在FAM、VIC、NED、PET单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物混合物可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。分别以汉麻7号(图2A-2D)、龙大麻5号(图4A-4D)、龙麻1号(图5A-5D)、庆大麻3号(图7A-7D)和尤纱-31(图8A-8D)DNA为模板进行相同的实验，可得到相同的结论。

(6)大麻品种的区分

分别以大麻格列西亚和汉麻7号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到格列西亚和汉麻7号的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，格列西亚在93、111、132、144、186、195、200、206、220、226、232和236bp出现FAM蓝色峰，汉麻7号在93、108、144、186、200、232和235bp出现FAM蓝色峰；格列西亚在161、197、206和243bp出现VIC绿色峰，汉麻7号在170、197、206和231bp出现VIC绿色峰；格列西亚在172、179、241、313、315和331bp出现NED黄色峰，汉麻7号在172bp、229、236、310、325和328bp出现NED黄色峰；格列西亚在210和252bp出现PET红色峰，汉麻7号在210、216和255bp出现PET红色峰。格列西亚及汉麻7号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分格列西亚和汉麻7号。

分别以龙大麻5号和龙麻1号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到龙大麻5号和龙麻1号的毛细管电泳图并进行比较。从图6中可以看出，龙大麻5号在93、111、138、147、143、186、195、206、232和238bp出现FAM蓝色峰，龙麻1号在93、111、144、147、186、195、206、232和236bp出现FAM蓝色峰；龙大麻5号在161、164、197和243bp出现VIC绿色峰，龙麻1号在161、164、197和243bp出现VIC绿色峰；龙大麻5号在172、179、229、241、316和328bp出现NED黄色峰，龙麻1号在169、172、179、229、241、316和329bp出现NED黄色峰；龙大麻5号在210、218、252和255bp出现PET红色峰，龙麻1号在210bp、252和255bp出现PET红色峰。龙大麻5号及龙麻1号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分龙大麻5号和龙麻1号。

分别以大麻庆大麻3号和大麻尤纱-31DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到庆大麻3号和尤纱-31的毛细管电泳图并进行比较。从图9中可以看出，庆大麻3号在93、108、111、132、135、138、144、186、203和232bp出现FAM蓝色峰，尤纱-31在93、111、132、144、186、195、206、232和236bp出现FAM蓝色峰；庆大麻3号在161、164、167、194、197和200bp出现VIC绿色峰，尤纱-31在161、197、206和243bp出现VIC绿色峰；庆大麻3号在169、172、184、229和311bp出现NED黄色峰，尤纱-31在172、179、241、315和331bp出现NED黄色峰；庆大麻3号在213和252bp出现PET红色峰，尤纱-31在210和252bp出现PET红色峰。庆大麻3号及大麻尤纱-31的每个荧光标至少有2-3个差异峰的出现，均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分庆大麻3号和尤纱-31。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所

<120> 大麻SSR分子标记及其应用

<130> KHP211118089.1

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actattacta agcctcctca tca 23

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtaaaacga cggccagtgt ggtagtctca ttgttggtg 39

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctccaaaccc aacaacaca 19

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaaaacga cggccagttc aagccatgag agttgaga 38

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgtgtaac agaaaacccc 20

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtaaaacga cggccagtga gtaagagaag gcgaacca 38

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acacatacag agagagccc 19

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtaaaacga cggccagtcg tacagtgatc gtagttgag 39

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatcaacaa tgacaatggc 20

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtaaaacga cggccagtga ttaaggtcct cgacgata 38

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatcaatggg aaccactcag 20

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgtaaaacga cggccagtcg gttctggatt taggagtg 38

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcagccatag tcatggtgta 20

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtaaaacga cggccagtgt cattggaaag accagctt 38

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaattggtt acgatggcg 19

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtaaaacga cggccagtgt ggtggtgatg atgataatgg 40

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcacaaaag ctgagacaca 20

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtaaaacga cggccagttg gctctcatct cctacaca 38

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccagtcccac cactgtagat 20

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgtaaaacga cggccagtgg gccattgtaa ttcttagc 38

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaataacctc gccggtatga 20

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgtaaaacga cggccagtcg acaacaacga cgtttcag 38

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgaagcgtt ggtactaggc 20

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgtaaaacga cggccagtca aacaggggaa aagagaga 38

Claims (10)

1.大麻SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括以下12个SSR分子标记的一个或多个，分别为：ANUCS306，47，CAN0126，H09CANN2，ANUCS303，CAN0576，CAN0039，C11CANN1，43，CAN2354，40，CAN0890。

2.根据权利要求1所述的大麻SSR分子标记，其特征在于，所述12个SSR分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ ID NO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ IDNO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQ ID NO.23-24。

3.用于扩增权利要求1或2所述的大麻SSR分子标记的特异性引物；

优选地，所述特异性引物包括如下引物对中的一个或多个：SEQ ID NO.1-2，SEQ IDNO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQID NO.23-24。

4.试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的特异性引物。

5.大麻基因组芯片，其特征在于，含有权利要求1或2所述的大麻SSR分子标记。

6.权利要求1或2所述的大麻SSR分子标记或权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的大麻基因组芯片在构建大麻品种DNA指纹数据库中的应用。

7.权利要求1或2所述的大麻SSR分子标记或权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的大麻基因组芯片在大麻种质资源遗传多样性分析或种子质量检测中的应用。

8.权利要求1或2所述的大麻SSR分子标记或权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的大麻基因组芯片在大麻的品种鉴定、亲缘关系分析、母系溯源中的应用。

9.权利要求1或2所述的大麻SSR分子标记或权利要求3所述的引物或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的大麻基因组芯片在大麻分子标记辅助育种中的应用。

10.根据权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测大麻样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述大麻SSR分子标记，进行PCR扩增；

3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。

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