CN110846434B - 一种鉴别茶树品种的引物、试剂盒及其鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别茶树品种的引物、试剂盒及鉴别方法，属于分子生物学领域。本申请鉴别的茶树品种有赣茶2号、上梅州和大面白，通过先筛选SSR序列，设计引物、筛选确定引物，再进行茶树品种鉴别。茶树品种鉴别方法为：提取待测茶树的基因组DNA；与引物进行PCR扩增反应；毛细管电泳检测扩增产物，根据特征条带220bp和232bp，鉴别茶树品种。本申请设计、筛选得到了鉴别所选三种茶树品种的引物，检测方法简单、快速，结果可靠，有利于所选茶树品种的保护和推广。

Description

一种鉴别茶树品种的引物、试剂盒及其鉴别方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地，涉及一种鉴别茶树品种的引物、试剂盒及其鉴别方法。
背景技术
茶树广泛种植于全世界超过50个国家和地区，发挥着重要的经济作用。茶叶最早源于中国，且与咖啡、可可并称世界三大无酒精饮料。茶叶作为我国重要经济栽培作物之一，科学准确地对其开展茶树品种鉴定、遗传多样性分析和构建遗传连锁图谱，这对于茶树品种选育以及种质资源收集和保护具有重大意义。DNA分子标记能反映生物个体和种群之间基因组中DNA片段某种特异性差异，是从DNA水平上反映遗传多态性。利用分子标记的高多态性，结合相关分析、聚类分析等数量遗传分析手段，可以对不同亲缘品种进行分类，判断其亲缘关系，评价不同品种的异质性，进而划分杂交优势群。众多分子标记中,简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记,因其具有简便、快捷、重复性高、多态性高、共显性标记等优点而被广泛应用。
茶树品种是茶叶生产的基本材料，不同茶树品种其适宜种植区和适制的茶类不同，“婺绿”产区是中国绿茶金三角，所产绿茶品质优良，赣茶2号(鄣科1号)、上梅州、大面白3个茶树品种是以“婺绿”产区群体种为材料选育的国家级优良品种，制绿茶品质极优。但目前还没有快速、准确鉴别这几个茶树品种的方法。
发明内容
本申请解决了赣茶2号、上梅州和大面白三种茶树品种的鉴别问题，确定了所选茶树品种的指纹图谱位置。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一方面，本申请提供了一种鉴别茶树品种的引物，包括上游引物和下游引物，具体序列为：
上游引物：5′-CTTCGTCCTCCTCCTCTTTG-3′；
下游引物：5′-TCACATCATCAGCCTTGGGT-3′。
采用该组引物，能特异性鉴别赣茶2号、上梅州和大面白三个茶树品种，鉴别方法简单、快速，结果可靠。
优选地，引物鉴别的茶树品种包括：赣茶2号、上梅州和大面白。
优选地，所述引物的筛选方法为：
在茶树基因组序列中选择SSR位点，设计引物；
选择设计的引物进行PCR扩增，再采用琼脂糖凝胶电泳初筛、毛细管电泳复筛，得到鉴别茶树品种的引物。
优选地，所述引物对应的SSR位点的序列为：5′-GGTGGTGGTGGTGGTGGT-3′。
另一方面，本申请提供了一种鉴别茶树品种的试剂盒，该试剂盒包含前述的鉴别茶树品种的引物。
引物的特异性高，故含有该引物的试剂盒也能特异性鉴别茶树品种。
再一方面，本申请还提供了鉴别茶树品种的方法，包括以下步骤：
S1：提取待测茶树的基因组DNA；
S2：将步骤S1提取的DNA与引物进行PCR扩增反应；
S3：电泳检测步骤S2的扩增产物，根据特征条带，鉴别茶树品种。
该鉴别方法简单、快速，采用引物扩增、电泳后各茶树品种的特异性条带明显，结果准确。
优选地，所述步骤S2中的引物包括：
上游引物：5′-CTTCGTCCTCCTCCTCTTTG-3′；
下游引物：5′-TCACATCATCAGCCTTGGGT-3′。
优选地，所述步骤S1中提取待测茶树的基因组DNA的方法为：取茶树嫩叶,用液氮冷冻，再利用植物基因组试剂盒提取茶树DNA。
优选地，所述步骤S2中PCR扩增反应的程序为：94℃，4min；94℃、45s，63℃、30s，72℃、30s，10个循环；94℃、45s，53℃、30s，72℃、30s，25个循环；72℃，10min；4℃保存。
优选地，鉴别的茶树品种包括：赣茶2号、上梅州和大面白，所述特征条带为220bp和232bp。
与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：
(1)采用一组引物，就能特异性鉴别赣茶2号、上梅州和大面白三个茶树品种，含有该引物的试剂盒同样能特异性鉴别所选的三种茶树品种；鉴别方法简单、快速，结果可靠。
(2)利用筛选出来的引物与待测茶树DNA扩增，再采用荧光毛细管电泳平台检测PCR扩增产物，此系统分辨率高，三种茶树品种的特征条带明显，赣茶2号为232bp，上梅州为220bp和232bp，大面白为220bp,；即，通过特征条带220bp和232bp，就能确定待测茶树是否为前述三种茶树品种。
(3)本申请中的鉴别方法不受季节、环境和时间的限制，可以在任意时间对所选茶树品种进行鉴定。
(4)本申请提供的鉴别方法灵敏度高、快速、精准，缩短了优良品种鉴定的周期，同时也为茶树种群的综合利用提供了途径。
附图说明
图1为本发明实施例1中待测茶树提取DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为本发明实施例中利用引物对赣茶2号茶树品种的毛细管电泳图。
图3为本发明实施例中利用引物对上梅州茶树品种的毛细管电泳图。
图4为本发明实施例中利用引物对大面白茶树品种的毛细管电泳图。
具体实施方式
下面以具体的实例来进一步说明本申请。需说明的是，引物序列由上海生工合成,扩增产物测序工作由上海派森诺基因科技有限公司完成，反应试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1
待测茶树基因组DNA的提取
(1)选用的茶树品种：赣茶2号(鄣科1号)、上梅州和大面白，由江西省蚕桑茶叶研究所的茶树种质品种园示范区提供。
(2)茶树基因组DNA的提取采用植物基因组试剂盒(Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒；生工生物工程(上海)股份有限公司；产品编号：B518261)提取，具体提取步骤为：
①将50-100mg的新鲜茶树叶片在液氮中充分研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中。
②加入600ul 65℃预热的Buffer PCR和12ulβ-巯基乙醇。震荡均匀，置于65℃水浴25min，间或混匀，在水浴后加入20ul的RNaseA(10mg/ml),室温放置5min。
③加入600ul的氯仿,充分混匀，12000rpm离心5min，吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中。
④加入等体积600ul的酚：氯仿(V/V＝1/1，PH8.0)反复混匀，12000rpm离心5min，取上清，反复抽提2次。
⑤加入与上层水相等体积Buffer BD，颠倒混匀3-5次，再加入与上层水相等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液枪将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。
⑥将吸附柱放回收集管中，加入500ul PW Solution,10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。
⑦将吸附柱放回收集管中，加入500ul Wash Solution,10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。
⑧将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。
⑨取出吸附柱，放入一个新的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50ul ddH2O，静置5min,12000rpm离心2min，得到DNA。
⑩提取结束后要对基因组DNA的质量进行检测，采用1％的琼脂糖凝胶电泳(30min/100V，电泳缓冲液为1×TAE)，基因组DNA的浓度用NanoDrop2000(ThermoScientific，美国)进行检测，为保证后续实验的需要，将DNA稀释至20ng/μl储存。
实施例2
引物的筛选
利用MISA软件对茶树全基因组序列进行SSR标记的选择，利用Primer5.0软件进行引物设计，在获得10万个含SSR位点的序列中，选取2923条含SSR位点的序列，设计了415对引物，引物的筛选原则为：
①引物的长度为18-23bp,目的片段在250bp左右。
②GC含量为45％-55％,引物序列中避免出现3或4个连续碱基。
③退火温度在45℃-55℃,最好在50℃左右,上、下游引物的退火温度值相差不大于3℃。
④引物3'端避免出现A或出现3个以上连续碱基,尽量避免引物二聚体和发夹结构。
将上述筛选出来的引物进行PCR扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳进行初筛，过程为：
①PCR扩增反应总体积为10μL，包括：5uL 2×Taq PCR Master Mix(包含dNTPs、Taq聚合酶、MgCL2等)，0.1uL 10uM的M13-tailed的上游引物，0.4uL 10uM的下游引物，0.3uL荧光标记M13引物(FAM)，2uL DNA模板和2.2uL ddH2O。其中，M13-tailed的上游引物是指在上游引物的5′端加上与M13通用引物一样的序列(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′FAM)，荧光标记M13引物(FAM)的序列为5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′，DNA模板是实施例1中提取得到的茶树基因组DNA。
②PCR扩增反应程序为：94℃，4min；94℃、45s，63℃、30s，72℃、30s，10个循环；94℃、45s，53℃、30s，72℃、30s，25个循环；72℃，10min；4℃保存。
③将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,选取扩增率大于等于75％、条带清晰,通过与目的片段比对,进行引物的初筛。
进一步复筛的方法为：
①将初筛得到的荧光标记产物用超纯水稀释30倍，吸取1ul加入到DNA分析仪(ABI3730xl DNA Analyzers:Applied Biosystems，美国)专用深孔板中，加入0.5ul LZ500(Gene ScanTM500Size Standard)分子量内标，8.5ul去离子甲酞胺；
②然后将其在PCR仪上95℃变性5min,取出,立即置于冰上,冷却10min以上；瞬时离心10s后放置到毛细管电泳检测。
③用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统根据目标峰的位置与同一泳道中的内标进行比较,直接给出目标片段的准确大小。
根据结果分析：引物复筛包括以下几点要求：
①主带清晰，没有多余杂带；
②多态性值高，等位位点多；
③重复性、稳定性好；
④最终筛选出一对用于鉴别赣茶2号、上梅州和大面白的引物；即：
上游引物为：5′-CTTCGTCCTCCTCCTCTTTG-3′(SEQ ID No.2)
下游引物为：5′-TCACATCATCAGCCTTGGGT-3′(SEQ ID No.3)。
上游引物的5′加上荧光标记M13引物序列后，序列为：
5′-CACGACGTTGTAAAACGACCTTCGTCCTCCTCCTCTTTG-3′(SEQ ID No.4)。
引物对应的SSR标记的核苷酸序列为：
5′-GGTGGTGGTGGTGGTGGT-3′(SEQ ID No.1)。
利用筛选确定的引物对赣茶2号、上梅州和大面白茶树品种的基因组DNA进行扩增，再采用毛细管电泳检测扩增产物，得到两个特异性等位位点，分别是220bp和232bp,确定的两个特异性位点能够准确快速的鉴定出赣茶2号、上梅州和大面白品种，结果见表1和引物毛细管电泳检测指纹图2-图4。
表1引物在三个茶树品种中扩增出的基因型
实施例3
利用实施例2筛选的引物进行茶树品种鉴定
①供试材料：三份分别编号为A、B、C的茶树鲜叶。
②试验方法:采用实施例1中的方法分别提取待测的茶样DNA，利用实施例2确定的引物对上述三份样品进行PCR扩增；再用毛细管电泳检测PCR扩增产物。
③结果与讨论：通过对三个样品毛细管电泳峰值比对,分别统计其特异性等位位点。结果为：茶样A扩增出多态性条带大小为232bp，茶样B扩增出多态性条带大小为220bp，232bp，茶样C扩增出多态性条带大小为220bp，由此确定，茶样A、B、C分别为赣茶2号(鄣科1号)品种，上梅州和大面白茶树品种。该检测结果与A、B、C的实际茶树品种是对应的，说明检测结果准确。
实施例4
利用实施例2筛选的引物进行茶树品种鉴定
本实施例与实施例3的区别在于，共计检测了10个茶树品种，编号分别为①-⑩，检测结果见表2。
表2.引物检测结果
编号 特征条带 鉴定的品种
① 220bp，232bp 上梅州
② 220bp 大面白
③ 232bp 赣茶2号
④ 220bp 大面白
⑤ 无 非本申请所述3种
⑥ 232bp 赣茶2号
⑦ 232bp 赣茶2号
⑧ 无 非本申请所述3种
⑨ 220bp，232bp 上梅州
⑩ 220bp，232bp 上梅州
茶样提供者核对了上述检测结果，鉴别的茶样品种与茶样的来源完全对应，检测结果准确。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西省蚕桑茶叶研究所（江西省经济作物研究所）
<120> 一种鉴别茶树品种的引物、试剂盒及其鉴别方法
<130> 江西省蚕桑茶叶研究所（江西省经济作物研究所）
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 茶树(Camellia sinensis)
<400> 1
ggtggtggtg gtggtggt 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
cttcgtcctc ctcctctttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
tcacatcatc agccttgggt 20
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
cacgacgttg taaaacgacc ttcgtcctcc tcctctttg 39

Claims (3)

1.鉴别赣茶2号、上梅州和大面白茶树品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待测茶树的基因组DNA；
S2：将步骤S1提取的DNA与引物进行PCR扩增反应；
所述步骤S2中的引物包括：
上游引物：5′-CTTCGTCCTCCTCCTCTTTG-3′；
下游引物：5′-TCACATCATCAGCCTTGGGT-3′；
S3：电泳检测步骤S2的扩增产物，根据特征条带，鉴别茶树品种；所述特征条带为220bp和232bp。
2.根据权利要求1所述的鉴别赣茶2号、上梅州和大面白茶茶树品种的方法，其特征在于，所述步骤S1中提取待测茶树的基因组DNA的方法为：取茶树嫩叶,用液氮冷冻，再利用植物基因组试剂盒提取茶树DNA。
3.根据权利要求1所述的鉴别赣茶2号、上梅州和大面白茶茶树品种的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增反应的程序为：94℃，4min；94℃、45s，63℃、30s，72℃、30s，10个循环；94℃、45s，53℃、0s，72℃、30s，25个循环；72℃，10min；4℃保存。
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