CN105624321A - 利用ssr指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，涉及到茶树全基因组中特异的SSR标记(SEQ？ID？No:1)及引物(SEQ？ID？No:4和5)。利用四份省级茶树优良品种作为样本材料，在茶树全基因组中选取415对SSR引物进行多态性筛选，最终确定1对引物作为黄魁品种鉴定的核心SSR引物，可有效将黄魁和其它三个省级茶树品种区分开，不仅有利于黄魁品种的保护及推广，还对市售黄魁茶的真伪鉴别提供了一个快速、准确的方法。

Description

利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法。

背景技术

黄化茶是由老茶树或老茶树上的部分茶枝受到外界环境因素的影响发生自然变异由原来的绿色变为黄色。这一黄化过程的机理比较复杂，外界环境不同，其黄化程度也不同。黄魁属于黄化茶之一，其特点是干茶嫩黄荷香、茶汤杏黄醇厚、叶底金黄富贵，茶氨酸和叶黄素含量高。黄魁茶树原种来源于安徽省郎溪县毕桥镇地方茶树群体中的自然变异单株，通过单株选育出具有优良性状的茶树黄化新品种——“黄魁”。“黄魁”茶树树姿呈半开状，芽叶呈金黄色，茸毛较少，发芽率高，每年的亩产量约120斤，黄魁品种适应性强，适合生长在地山丘陵地带。

近几年随着我国黄化茶新品种不断增多，市场上不同品种的黄化茶仅凭肉眼从外观形态上很难区分，随着国家对植物新品种保护制度的不断完善，急需开发有效的技术措施对黄魁新品种进行精准鉴定。本发明利用SSR指纹图谱技术对黄魁茶树品种进行鉴定，从DNA水平上给予黄魁茶独特的指纹身份，有效防止其他品种冒充黄魁茶，从而达到保护黄魁优良品种的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法。

本发明利用SSR指纹图谱技术鉴别黄魁品种，其中涉及茶树基因组中一个特异的微卫星SSR标记，该标记的重复单元是由二碱基组成，其变异程度在茶树基因组中最高，特异SSR标记的核苷酸序列为：5′-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQIDNo:1)。

上述SSR标记的左、右侧翼保守序列分别如SEQIDNo:2和3所示。

基于SSR引物设计原则，根据上述SSR标记的侧翼序列设计引物，引物序列为：

上游引物：5′-AGGCTAAAGAAGATGGAG-3′，Tm：53.8℃(SEQIDNo:4)

下游引物：5′-GAGGGAATGGGTTGTCTA-3′，Tm：53.8℃(SEQIDNo:5)

SSR引物的筛选步骤如下：以四份省级茶树优良品种黄魁、黄金芽、黄金茶2号和天台黄茶作为样本材料，茶树样品总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位点的选择和引物的设计筛选，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，然后采用FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物。

本发明中茶树总DNA提取是采用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组DNA。对茶树全基因组序列进行SSR标记的选择和引物设计筛选，在获得10万个含SSR位点的序列中，二碱基是茶树基因组中较丰富的微卫星类型，出现最多的碱基重复单元是AT、CT，从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了415对引物，其中SSR引物筛选的原则如下：

①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。

②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。

③退火温度在45℃-55℃，最好在50℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃。

④引物3’端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。

所述的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，具体是将PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，选取扩增率大于等于75％、条带单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引物的初筛。并通过FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统进行复筛，能够精确地反映等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物，最终确定一对核心引物(SEQIDNo:4和5)用于黄魁品种的鉴定。

本发明还提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述核心引物，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出214bp和236bp大小的特征条带，则待测植株为黄魁茶树品种。

PCR扩增体系：50ng/μL基因组DNA2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，10×EasyTaq酶缓冲液2μL，EasyTaqDNA聚合酶1U，2.5mMdNTP2μL，ddH₂O加至总量20μL。

PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

步骤3)中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色；或者通过毛细管电泳检测PCR扩增产物。

优选用FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统检测PCR扩增产物，由于FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此利用所述核心引物对待测植株扩增出的两条带分别是214±3bp、236±3bp，均可判定为黄魁品种。

本发明进一步提供用于筛选或鉴别黄魁茶树品种的PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包含如SEQIDNo:4和5所示的核心引物。

本发明具有以下优点：

(一)本发明基于茶树基因组开发出SSR引物，与EST-SSR相比，具有多态性高、数量多的特点。通过大量的引物筛选，最终确定一对核心引物用于对黄魁品种的鉴定。

(二)本发明采用SSR指纹图谱技术，该技术具有稳定性好、操作简单，准确率高的特点，对黄魁优良品种鉴定提供一种精确、快速、简单的方法。

(三)本发明所选用的材料不受季节、环境和测试时间的限制，可以对黄魁品种生长任何时期内的任意器官，或制作好储存一段时间的干茶进行DNA提取，均不会影响鉴定结果。

(四)本发明进行引物筛选优选用FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对构建一套快速、精确的SSR指纹图谱技术起到重要作用，并缩短了黄魁优良品种鉴定的周期。

附图说明

图1为本发明实施例1中干茶或鲜叶总DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为本发明实施例3中利用核心SSR引物对四个茶树品种进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为本发明实施例3中四个茶树品种的SSR指纹图谱。

图4为本发明实施例3中核心SSR引物的PCR产物测序结果与目的片段比对图，旨在验证引物的真实性，即扩增产物序列中是否包含SSR位点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中引物序列由上海生工合成，PCR扩增产物测序工作由上海生工完成。PCR反应试剂购自Transgeng公司。

以下实施例中使用的CTAB提取液配方如下：20mMEDTA，100mMTris-HCl，0.075v/v‰β-巯基乙醇，1.0mMNaCl，4w/v％PVPP-40，CTAB/SDS2w/v％(十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠质量比1：6)。

实施例1干茶或鲜叶总DNA的提取

实验对象：茶树品种黄魁、黄金芽、黄金茶2号、天台黄茶。黄魁干茶和鲜叶由安徽宏云制茶有限公司提供，黄金芽和天台黄茶由安徽农业大学郭河现代农业示范区产学研基地提供，黄金茶2号由湖南茶科所提供。

用改良的CTAB法从干茶或鲜叶中提取总DNA，具体操作如下：

①取2ml离心管加磨碎的干茶粉末0.1g，加900mL预热至65℃的CTAB提取液，加20mLβ-巯基乙醇，65℃水浴20min，每隔10min轻轻上下摇匀几次，然后加10mLRNAase置于65℃水浴15min，每隔5min上下摇匀几次。

②13000r/min，离心10min，取上清液800mL，加400mLTris平衡酚，加等体积的氯仿：异戊醇(氯仿和异戊醇体积比为24:1)至2mL，上下颠倒混匀，13000r/min离心10min，取上清液650mL转移到新的2ml管中，加氯仿：异戊醇650mL，颠倒混匀，13000r/min离心5min，取上清液500mL置于新的2ml管中。

③加乙醇(预先放置于-20℃冰箱中，用完及时放入冰箱中)至2ml处，上下颠倒几次(会有絮状物出现)，置于-20℃冰箱中静置5min(放置时间可以略长)，倒掉管中的乙醇，再加入乙醇至2ml处，轻轻上下混匀几次后倒掉乙醇(注意不要将DNA倒掉)，然后8000r/min离心30s，倒掉剩余的乙醇。

④加500mLddH₂O，置于37℃水浴溶解DNA约4min，放冰上预冷5min，加冷乙醇至2mL，轻轻上下颠倒混匀。13000r/min离心3min，空柱8000r/min离心2min，如果看到沉淀物不是透明色重复步骤④。

⑤将空管放在真空泵抽提15min，根据固体剩余量加200mlddH₂O，测定核酸含量，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA(图1)。

实施例2SSR标记的选择和引物的初筛

在获得的10万个含有SSR位点的序列中，以二核苷酸为重复单元的SSR位点最多，约占71％，出现最多的碱基重复是AT、AG。其变异程度在茶树基因组中最高，特异SSR标记的核苷酸序列为：5′-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQIDNo:1)。该SSR标记的左、右侧翼保守序列分别如SEQIDNo:2和3所示。

从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了415对引物。

SSR引物筛选的原则如下：

①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。

②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。

③退火温度在45℃-55℃，最好在50℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃。

④引物3’端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。

PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛：

PCR扩增体系：50ng/μL基因组DNA2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，10×EasyTaq酶缓冲液2μL，EasyTaqDNA聚合酶1U，2.5mMdNTP2μL，ddH₂O加至总量20μL。

PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃±3℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

其中退火温度根据每个引物决定。将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，选取扩增率大于等于75％、条带清晰且单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引物的初筛。

实施例3FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统复筛引物

具体操作如下：

1、试剂的准备：

1)配胶：向200mLdsDNA800SeparationGel中加入10μLIntercalatingDye，充分混匀。

2)1×InterBuffer：将5×InterBuffer稀释5倍。

3)1×Capillaryconditioningsolution：将5×Capillaryconditioningsolution稀释5倍，向96孔板中分别加入1mLCapillaryconditioningsolution，避免出现气泡。

4)Marker：向96孔板中分别加入33μL35bpand500bpMarkers，每个孔里加入一滴Mineraloil封住，离心。

5)样品制备：向96孔板的各孔中加入20μLDolutionbuffer和3μLPCR产物，最后一个孔加入23μL35-400bpRangeDNALadder，离心避免出现气泡。

2、操作步骤：将所配制好的试剂放入仪器指定位置，点击仪器的运行程序。

3、数据记录和结果分析：每条带中选取峰值最高的条带，记录具体数值大小。对引物复筛的要求包括以下几点：(1)主带清晰，没有多余杂带；(2)多态性值高，等位位点多；(3)在两个相近的等位位点之间条带相差大小应大于4bp；(4)对符合上述三点的引物进行三次重复性扩增，选择重复性、稳定性好的引物，最终筛选出一对用于鉴定黄魁品种的核心SSR引物(SEQIDNo:4和5)。

上游引物：5′-AGGCTAAAGAAGATGGAG-3′，Tm：53.8℃(SEQIDNo:4)

下游引物：5′-GAGGGAATGGGTTGTCTA-3′，Tm：53.8℃(SEQIDNo:5)

利用该核心引物对黄魁品种扩增出两个特异性等位位点，分别是214bp和236bp，能够准确、快速的鉴定出黄魁品种，结果见表1和图2，核心引物的毛细管电泳指纹图谱见图3，由于FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此该核心引物对黄魁品种扩增出的两条带所允许范围分别是214±3bp、236±3bp。

表1核心引物在四个茶树品种中扩增出的基因型

核心SSR引物的PCR产物测序结果与目的片段比对图见图4。

实施例4黄魁茶树品种真实性的鉴定

供试材料：待测茶品种干茶样A，确定为黄魁品种的干茶样B。

试验方法：①分别对干茶样A、B提取DNA，②利用核心引物对上述两份DNA样品进行PCR扩增，③用FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统对PCR产物分析。

结果与讨论：通过与黄魁品种的毛细管电泳指纹图谱比对，如果茶样A扩增出与茶样B相同的多态性条带(即大小分别为213bp和236bp)，或者扩增条带与茶样B在一定误差范围内一致(分别为213±3bp、236±3bp)，则可以确定茶样A为黄魁品种，不符合上述原则的不是黄魁品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.茶树基因组中特异的SSR标记，其特征在于，所述特异的SSR标记的核苷酸序列为：5′-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′。

2.根据权利要求1所述SSR标记的侧翼序列设计的引物，其特征在于，引物序列为：

上游引物：5′-AGGCTAAAGAAGATGGAG-3′

下游引物：5′-GAGGGAATGGGTTGTCTA-3′

其中，所述SSR标记的左、右侧翼序列分别如SEQIDNo:2和3所示。

3.利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出214bp和236bp大小的特征条带，则待测植株为黄魁茶树品种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增体系：50ng/μL基因组DNA2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，10×EasyTaq酶缓冲液2μL，EasyTaqDNA聚合酶1U，2.5mMdNTP2μL，ddH₂O加至总量20μL。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色；或者通过毛细管电泳检测PCR扩增产物。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组DNA。

8.用于筛选或鉴别黄魁茶树品种的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求2所述引物。