CN110079595A - 一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法 - Google Patents

一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法，所述的外源植物糖浆包括玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆或甘蔗糖浆；所述的引物探针组合物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～15所示，利用该组合物可以通过数字PCR快速准确测定出蜂蜜中是否含有外源植物糖浆。为进一步准确测量，所述的引物探针组合物还包括植物18s rRNA的保守同源序列设计内参基因的数字PCR检测引物和探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。本发明检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。

Description

一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及蜂蜜及其产品中掺入外源植物糖浆的检测，具体为一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法。
背景技术
养蜂业是农业的一大组成部分，在我国的国民经济中占有较重要的地位。养蜂业不但能够向社会提供丰富的蜜蜂产品，而且还可以帮助农民脱贫致富，我国拥有蜂群数量820万群，平均年产蜂蜜30万吨，产量、出口量始终稳居于世界各国前列。近年来市场上蜂产品质量良莠不齐，一些蜂产品掺假、造假等欺骗消费者现象屡见不鲜，其中，向蜂蜜中掺入外源植物糖浆的情况比较严重和普遍，掺入的外源糖浆主要有大米糖浆、甜菜糖浆、玉米糖浆和甘蔗糖浆等，由于蜂蜜中的葡萄糖和果糖含量占其总量65％以上，而掺入的外源糖浆在感观及一些化学性质方面与蜂蜜中的糖的性质比较相近，所以掺入后其各项理化指标完全符合国家标准，甚至对一些理化指标还起到了强化作用，并且多种类型的糖浆同时用于蜂蜜掺假中的现象愈发严重，并且没有可同时检测到所有这些掺杂物的可利用的方法，目前针对蜂蜜中外源糖浆的检测方法主要利用同位素质谱法、薄层色谱法及红外光谱等方法，这些方法一方面比较费时费力，另一方面，有时只能针对一种类型糖浆的检测，无法满足对蜂蜜检测的需要。为了保护消费者的利益和蜂产业的健康发展，急迫需要发展新型的蜂蜜中外源糖浆的检测方法。
外源糖浆来源于植物，而每个物种都有其特有的内标准基因，根据稳定可靠的内标基因片段序列，设计出与靶序列两端互补的特异性可靠的寡核苷酸引物序列，通过PCR技术检测，如果可以扩出该段基因即可说明该样本中含有此物种，从而判断蜂蜜中是否掺入了相应植物来源的糖浆。由于从蜂蜜或糖浆中提取的少量DNA，及其中DNA的降解，需要更精确的PCR技术对其进行检测。数字PCR(Digital PCR，dPCR)是近几年新兴起的一种核酸绝对定量技术，可以很好的提高检测的灵敏度。dPCR是一种针对单分子目标DNA扩增的绝对定量技术，其原理是将含有DNA模板的反应液分配到大量独立的反应室中进行扩增，通过反应终点统计反应室里的阳性信号来达到绝对定量DNA拷贝数的新型PCR技术手段
数字PCR方法具有快速高效、特异性强、灵敏度高等特点，不需要建立标准曲线，在蜂产品检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用数字PCR方法同时检测蜂蜜中的玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆和甘蔗糖浆的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于利用数字PCR扩增来源于外源糖浆中的相应植物的内标准基因，从而快速检测蜂蜜中是否掺入相应的植物糖浆的方法，主要用于同时快速鉴定蜂蜜中是否掺有大米糖浆、甜菜糖浆、玉米糖浆或甘蔗糖浆。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物，所述的外源植物糖浆包括玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆或甘蔗糖浆；
检测玉米糖浆引物探针组合物包括正向引物M-F、反向引物M-R和探针M-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示；
检测大米糖浆引物探针组合物包括正向引物R-F、反向引物R-R和探针R-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.7～9所示；
检测甜菜糖浆引物探针组合物包括正向引物B-F、反向引物B-R和探针B-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.10～12所示；
检测甘蔗糖浆引物探针组合物包括正向引物S-F、反向引物S-R和探针S-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.13～15所示。
进一步的，所述的引物探针组合物还包括植物18srRNA的保守同源序列设计内参基因的数字PCR检测引物和探针，所述的引物包括正向引物C-F和反向引物C-R，探针C-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
在本发明的另一方面，提供了一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的方法，包括以下步骤：
1)提取待测蜂蜜样品的基因组DNA。
2)配制数字PCR检测反应体系：在PCR反应管内加入模板DNA10ng/μL2μL、各正反引物终浓度0.45μM、各探针溶液0.2μM；
3)对照数字PCR，设置阴性对照与空白对照，以非玉米、大米、甜菜和甘蔗的其它植物基因组DNA为阴性对照，以水作为空白对照。
4)数字PCR反应：95℃预变性10min；95℃变性15S，58℃退火1min，共40个循环；98℃热失活10min。
5)数字PCR结果判断。
进一步的，内参基因得到了明显的扩增，玉米、大米、甜菜或甘蔗基因的任何一个出现明显的扩增现象，表明样品中检测出了玉米、大米、甜菜或甘蔗基因。
进一步的，内参基因得到了明显的扩增，而玉米、大米、甜菜或甘蔗基因没有得到扩增，表明样品中未检测出玉米、大米、甜菜或甘蔗基因。
进一步的，内参基因没有得到扩增，表明样品未检测出植物成分。
在本发明的另一方面，提供了所述的引物探针组合物在数字PCR中作为检测水稻种植资源或蜂蜜中外源植物糖浆的应用。
在本发明的另一方面，提供了一种检测蜂蜜中是否含有水稻糖浆的试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。
本发明的有益效果为：
本发明基于数字PCR检测玉米、大米、甜菜和甘蔗基因，从而快速鉴定蜂蜜中是否掺入有玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆或甘蔗糖浆，检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。
附图说明
图1是本发明植物18srRNA内参基因进行特异性检测的结果图；
图2是本发明玉米内标基因进行特异性检测的结果图；
图3是本发明大米内标基因进行特异性检测的结果图；
图4是本发明甜菜内标基因进行特异性检测的结果图；
图5是本发明甘蔗内标基因进行特异性检测的结果图；
图6是本发明对玉米糖浆进行灵敏度检测的结果图；
图7是本发明对大米糖浆进行灵敏度检测的结果图；
图8是本发明对甜菜糖浆进行灵敏度检测的结果图；
图9是本发明对甘蔗糖浆进行灵敏度检测的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1蜂蜜中外源植物糖浆检测方法的建立
根据植物18srRNA的保守同源序列设计内参基因的数字PCR检测引物和探针，所述的引物包括正向引物C-F和反向引物C-R，探针C-P，其核苷酸序列具体如下所示：
正向引物C-F：CCTGAGAAACGGCTACCAT(SEQ ID NO.1)；
反向引物C-R：CGTGTCAGGATTGGGTAAT(SEQ ID NO.2)；
探针C-P：FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1(SEQ ID NO.3)。
提取待测蜂蜜样品的基因组DNA，配制数字PCR检测反应体系：在PCR反应管内加入模板DNA2μL(10ng/μL)、检测正反引物终浓度0.45μM、探针溶液0.2μm；数字PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性15S，58℃退火1min，共40个循环；98℃热失活10min。即可测得蜂蜜样品中是否含有外源植物糖浆。
一般情况下，目前添加的外源植物糖浆为玉米、水稻、甜菜和甘蔗，为检测外源植物糖浆的种类，分别根据玉米、水稻、甜菜和甘蔗内标准基因的核苷酸序列，分别设计得到引物探针组合物，进行数字PCR扩增反应，从而检测得出外源植物糖浆的类型。
具体的，用以检测玉米的引物探针组合物为：
正向引物M-F：CGGTGGATGCTAAGGCTGATG(SEQ ID NO.4)；
反向引物M-R：AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC(SEQ ID NO.5)；
探针M-P：FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1(SEQ ID NO.6)。
用以检测水稻的引物探针组合物为：
正向引物R-F：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT(SEQ ID NO.7)；
反向引物R-R：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC(SEQ ID NO.8)；
探针R-P：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1(SEQ ID NO.9)。
用以检测甜菜的引物探针组合物为：
正向引物B-F：GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG(SEQ ID NO.10)；
反向引物B-R：GAGTAATTGCTCCATCCTGTTCA(SEQ ID NO.11)；
探针B-P：FAM-CTACGAAGTTTAAAGTATGTGCCGCTC-BHQ1(SEQ ID NO.12)。
用以检测甘蔗的引物探针组合物为：
正向引物S-F：CCGTGCTGCGCTTCGT(SEQ ID NO.13)；
反向引物S-R：TCAGATCTCAGATTCTCCATTGCT(SEQ ID NO.14)；
探针S-P：FAM-TCCCGTTGGTTCATCCCGAGTAGCT-BHQ1(SEQ ID NO.15)。
在上述引物和探针的基础上，本发明公布了一种同时快速鉴定蜂蜜中是否掺有玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆或甘蔗糖浆的检测方法，具体包括以下步骤：
1)提取待测蜂蜜样品的基因组DNA。
2)配制数字PCR检测反应体系：在PCR反应管内加入模板DNA2μL(10ng/μL)、检测正反引物终浓度0.45μM、探针溶液0.2μm，根据选择的数字PCR的类型配制反应体系，但保证上述组分的终浓度不变。
3)对照数字PCR，设置阴性对照与空白对照，以非玉米、大米、甜菜和甘蔗的其它植物基因组DNA为阴性对照，以水作为空白对照。
4)数字PCR的微体系的生成，根据不同类型的数字PCR平台操作。
5)数字PCR反应：95℃预变性10min；95℃变性15S，58℃退火1min，共40个循环；98℃热失活10min。
6)数字PCR结果判断：阴性对照组中只有内参基因的扩增，空白对照组没有任何扩增现象，表明数字PCR反应体系正常工作，否则需要重新检测；根据阴性对照及空白对照的数字PCR扩增结果中扩增曲线的基线或终点荧光值的阈值来分析试样的检测结果，试样存在以下3种结果：
A：内参基因得到了明显的扩增，玉米、大米、甜菜或甘蔗基因的任何一个出现明显的扩增现象，表明样品中检测出了玉米、大米、甜菜或甘蔗基因；
B：内参基因得到了明显的扩增，而玉米、大米、甜菜或甘蔗基因没有得到扩增，表明样品中未检测出玉米、大米、甜菜或甘蔗基因；
C：内参基因没有得到扩增，表明样品未检测出植物成分。
实施例2引物与探针的适用性
对本发明中公布的植物18srRNA内参基因及玉米、大米、甜菜和甘蔗内标准基因的引物和探针的适用性进行RT-PCR实验，测试植物除了玉米、大米、甜菜和甘蔗，还有主要的蜜源植物及其它植物，及玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆和甘蔗糖浆，所有样品为：
S1-1：玉米叶片，S1-2：玉米种子，S2-1：水稻叶片，S2-2：水稻种子，S3：甜菜叶片，S4-1：甘蔗叶片，S4-2：甘蔗秸秆，S5：杨槐树叶，S6：荆树叶片，S7：油菜叶片，S8：椴树叶片，S9：桂树叶片，S10：荔枝叶片，S11：棉花叶片，S12：小麦叶片，S13：玉米糖浆，S14：大米糖浆，S15：甜菜糖浆，S16：甘蔗糖浆。
结果如图1～5所示，本实施例中，植物18srRNA内参基因在所有测试样品中均得到扩增，表明本发明中所用的内参基因满足内参的要求，另外，玉米、大米、甜菜和甘蔗内标准基因也只在其对应的植物和糖浆中有扩增，而在其它植物中没有得到扩增，表明本发明所述的玉米、大米、甜菜和甘蔗内标准基因具有很好的特异性，适用于对蜂蜜中外源植物糖浆来源的鉴定。
实施例3检测方法的灵敏度
对本发明中的检测方法的灵敏度进行实验，测试样品为实施例1中的玉米糖浆，大米糖浆，甜菜糖浆和甘蔗糖浆分别添加到纯蜂蜜中，配制4种糖浆质量含量分别为10％，5％和1％的样品，即：
(1)S1：含10％玉米糖浆的蜂蜜；
(2)S2：含5％玉米糖浆的蜂蜜；
(3)S3：含1％玉米糖浆的蜂蜜；
(4)S4：含10％大米糖浆的蜂蜜；
(5)S5：含5％大米糖浆的蜂蜜；
(6)S6：含1％大米糖浆的蜂蜜；
(7)S7：含10％甜菜糖浆的蜂蜜；
(8)S8：含5％甜菜糖浆的蜂蜜；
(9)S9：含1％甜菜糖浆的蜂蜜；
(10)S10：含10％甘蔗糖浆的蜂蜜；
(11)S11：含5％甘蔗糖浆的蜂蜜；
(12)S12：含1％甘蔗糖浆的蜂蜜。
结果如图6～9所示，本实施例中在含有外源植物糖浆含量分别为10％，5％及1％的样品中都有良好扩增，表明本发明所述的检测方法对外源植物糖浆具有很好的灵敏度，可以达到1％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物及方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgagaaac ggctaccat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtgtcagga ttgggtaat 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcgcgcctg ctgccttcct 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggtggatgc taaggctgat g 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagggccag gttcattatc ctc 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taaggagcac tcgccgccgc atctg 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtgagcgt tttgcagtct 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgatccact agcaggaggt cc 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgttgtgctg ccaatgtggc ctg 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacctccata ttactgaaag gaag 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagtaattgc tccatcctgt tca 23
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctacgaagtt taaagtatgt gccgctc 27
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccgtgctgcg cttcgt 16
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcagatctca gattctccat tgct 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcccgttggt tcatcccgag tagct 25

Claims (8)

1.一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物，其特征在于，所述的外源植物糖浆包括玉米糖浆、大米糖浆、甜菜糖浆或甘蔗糖浆；
检测玉米糖浆引物探针组合物包括正向引物M-F、反向引物M-R和探针M-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示；
检测大米糖浆引物探针组合物包括正向引物R-F、反向引物R-R和探针R-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.7～9所示；
检测甜菜糖浆引物探针组合物包括正向引物B-F、反向引物B-R和探针B-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.10～12所示；
检测甘蔗糖浆引物探针组合物包括正向引物S-F、反向引物S-R和探针S-P，核苷酸序列如SEQ ID NO.13～15所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的引物探针组合物，其特征在于，所述的引物探针组合物还包括植物18s rRNA的保守同源序列设计内参基因的数字PCR检测引物和探针，所述的引物包括正向引物C-F和反向引物C-R，探针C-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
3.一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测蜂蜜样品的基因组DNA。
2)配制数字PCR检测反应体系：在PCR反应管内加入模板DNA10ng/μL2μL、各正反引物终浓度0.45μM、各探针溶液0.2μM；
3)对照数字PCR，设置阴性对照与空白对照，以非玉米、大米、甜菜和甘蔗的其它植物基因组DNA为阴性对照，以水作为空白对照。
4)数字PCR反应：95℃预变性10min；95℃变性15S，58℃退火1min，共40个循环；98℃热失活10min。
5)数字PCR结果判断。
4.根据权利要求3所述的一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的方法，其特征在于，内参基因得到了明显的扩增，玉米、大米、甜菜或甘蔗基因的任何一个出现明显的扩增现象，表明样品中检测出了玉米、大米、甜菜或甘蔗基因。
5.根据权利要求3所述的一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的方法，其特征在于，内参基因得到了明显的扩增，而玉米、大米、甜菜或甘蔗基因没有得到扩增，表明样品中未检测出玉米、大米、甜菜或甘蔗基因。
6.根据权利要求3所述的一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的方法，其特征在于，内参基因没有得到扩增，表明样品未检测出植物成分。
7.一种检测蜂蜜中外源植物糖浆的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合物。
8.权利要求1所述的引物探针组合物在数字PCR中作为检测水稻种植资源或蜂蜜中外源植物糖浆的应用。
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