CN112126679A - 一种基于植物花粉dna提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，属于生物技术领域。方法包括，步骤1：根据枇杷18S RNA的ITS序列，设计并获得了特异寡核苷酸引物和TaqMan探针；步骤2：利用改进的CTAB法提取了枇杷蜜中植物源（枇杷花粉）的DNA；步骤3：利用步骤1的寡核苷酸引物和TaqMan探针，以及步骤2中的提取的DNA，设计荧光定量PCR方法，进行扩增；步骤4：基于步骤3的结果对检测样品进行判定。使用本发明的植物花粉DNA提取和实时荧光定量PCR检测方法，能够特异、灵敏、准确地判定枇杷蜜样品中是否含有枇杷植物源成分，对枇杷蜜的掺杂、掺假鉴别起到一定作用。
Description
技术领域
本发明涉及到天然蜂蜜的植物源DNA提取和检测实验，具体涉及到枇杷蜜中枇杷花粉植物源DNA的提取，荧光定量探针引物的设计、实验和判定方法。
背景技术
枇杷蜜是由蜜蜂采集枇杷Eriobotrya japonica花蜜酿制而成，枇杷树的开花期于每年的10月至12月，此时温度较低，一般只有耐低温的中华蜜蜂Apis cerana cerana采集，由于枇杷花期特殊，产量较低，枇杷蜜又具有清肺、泄热、化痰、止咳平喘等保健功效，因此枇杷蜜在蜂蜜市场属于蜜中上品，经济价值较高。部分不法商贩以杂次蜜、浓缩加工蜜甚至假蜜进行掺伪，导致枇杷蜜市场混乱，市场上难以觅寻真正的枇杷蜜。目前蜂蜜的真伪检测一般以蜂蜜酿制过程中次生代谢产物的小分子化学物质为检测对象，通过大型仪器如核磁共振、高效液相色谱串联质谱等进行检测，方法复杂、成本较高，难以满足市场需求。
由于蜜蜂在采集枇杷蜜的过程中会自然混入枇杷植物成分，即枇杷花粉及其DNA，真正的天然成熟枇杷蜜一定会含有适量的枇杷DNA。而目前市场有如下非天然成熟枇杷蜜来源，即①混入杂蜜如廉价的油菜蜜等掺杂蜜，其仍然含有大量的植物DNA，但非枇杷成分；②而经过高温浓缩处理后的浓缩加工蜜，由于高温破坏而几乎不含植物花粉或极少量的花粉DNA；③另外还有以果葡糖浆或大米糖浆等进行掺混的假蜜，由于并非蜂蜜，亦不会含有任何DNA成分。因此，通过对枇杷蜜中是否含有一定量的枇杷花粉DNA，即通过提取蜂蜜DNA的含量大小来判断是否是浓缩加工或掺假蜜；结合枇杷特异DNA荧光定量PCR结果，来判断是否是真正的枇杷蜜。本发明通过对枇杷植物源DNA的准确判定，对市场天然枇杷蜜的真伪情况提供一种可靠的判定方法。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明的目的在于提供一种准确判断枇杷蜜中是否含有枇杷花粉及其DNA含量的检测方法，可实现对市售枇杷蜜是否天然无掺假掺杂情况的准确判断。
所述的一种用于枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）根据枇杷18S RNA的ITS序列，进行寡核苷酸引物和TaqMan探针的设计
2）利用CTAB法提取枇杷蜜中植物源的DNA成分；
3）利用步骤1的寡核苷酸引物和TaqMan探针，以及步骤2中的提取的DNA成分，设计荧光定量PCR方法，进行扩增，记录Ct值数据；
4）基于步骤3的Ct值数据结果对检测样品进行判定。
所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤1中ITS序列为枇杷Eriobotrya japonica的18S RNA，全长681 bp,Genbank注册号为KJ170761~KJ170775。
所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤1中寡核苷酸引物，上游序列为5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’；下游序列为5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’，扩增长度为212 bp；扩增序列位于枇杷18S RNA中第96至307bp范围。
所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤1中TaqMan探针序列为FAM-5’-CGTATTGCGCCAAGGAACTCGAACGAAAGAG-3’-TAMRA，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为淬灭荧光基团；TaqMan探针序列位于寡核苷酸上游引物下游40bp处，及寡核苷酸下游引物的上游101bp处。
所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于，步骤2中枇杷蜜中的DNA提取采用改进后的CTAB法，20 mL蜂蜜样品中提取DNA浓度为10~500 ng/μL。
所述的枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤3中设计的荧光定量方法中反应体系为20μL，其中Premix Ex Taq (2×)为10 μL；PCR上游和下游引物(10 μM)均为0.4 μL；TaqMan探针为0.8 μL；DNA模板为2 μL（20~50 ng），灭菌水为6.4 μL。
所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤3中设计的荧光定量方法中第一步95℃ 20秒，1个循环；第二步95℃ 1秒，60℃ 20秒，40个循环数。激发波长为494 nm，记录波长为522 nm。
所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤4中当循环阈值Ct值界于26.9~31.2时被认为枇杷蜜中具有合理的枇杷植物源成分。
所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤4中，以20 mL蜂蜜提取的50 ng DNA为模板,若Ct值＞34，则判定为浓缩掺杂蜜，此时提取的DNA浓度越高，混掺杂蜜越多；反之掺入浓缩蜜或假蜜越多。若提取DNA浓度＜10 ng/μL,或DNA浓度极低或Ct过高，均被判定为浓缩或掺假蜜。
本发明的有益效果是：可以通过定量检测市售天然枇杷蜜中是否含有适的枇杷花粉DNA，来判断该其是否为天然成熟枇杷蜜，亦或是浓缩加工或掺杂掺假蜜及其混合组成。
附图说明
图1是本发明实施的技术路线和框架示意图。
图2是阳性参照的PCR照片。左起第一为100-1000 bp DNA Ladder（第①条），依次为枇杷花（第②，③条），山茶叶片（第④条）。其中枇杷花呈现出清晰明亮的条带，长度均为200 bp。
图3是阴性对照组，阳性对照组与空白对照组的荧光定量PCR扩增曲线图。其中①为枇杷花（阳性对照组）扩增曲线，②为山茶叶片（阴性对照组）扩增曲线，③为空白对照组（以水代替模板）扩增曲线。
图4是全部样品荧光定量PCR扩增曲线图。其中纵轴ΔRn=R+n（每一点的荧光强度）- R-n（基线荧光强度），即PCR过程中产物增加的量，横轴为循环数。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：本发明实施的技术路线和框架示意图
如图1所示，待检测枇杷蜜样品经改进后的CTAB提取以后，若提取DNA浓度<10 ng/μL,或无DNA成功提取，均被判定为浓缩加工蜜或假蜜；50ng的DNA经TaqMan探针法定量测定后，如26.91 <Ct值< 31.2，则被判定为天然成熟枇杷蜜；如Ct值 > 34，则判定为浓缩加工或掺杂蜜，DNA浓度越高，混掺杂蜜越多；反之，DNA浓度越低，掺入浓缩加工蜜或假蜜越多。
实施例2：改进的CTAB法提取枇杷蜜样品中的植物源DNA
分别称取12.75 g山梨醇，2.42 g Tris•HCl pH 8，0.29 g EDTA，溶于200 mL无菌水中，用浓盐酸与NaOH将溶液PH调至8，制成提取缓冲液，灭菌后保存在4℃。再称取4.85 gTris•HCl pH 8，2.92 g EDTA pH 8，23.28 g NaCl，5 g十二烷基肌氨酸钠，溶于200 ml无菌水中，同样将PH调至8，制成裂解缓冲液，高压灭菌后置于4℃保存。将提取缓冲液、裂解缓冲液各取41.7 mL，Sarcosyl stock取16 ml于同一个试剂瓶中，向其中加入0.5 g亚硫酸氢钠，2 g聚乙烯吡咯烷酮-40，振荡混匀，制成100 ml工作溶液。工作溶液在一般情况下现配现用，配制完成后可以放置于室温下，保存4-5天。工作溶液放置时间过长会出现分层现象，需要振荡混匀后再使用。
每一个蜂蜜样品分别取20 mL，与30 mL的无菌水混合，振荡混匀。在室温下8000rpm离心25 min。弃去上清液。将蜂蜜样品离心后得到的沉淀溶解于1 mL现配的工作溶液中，并转移到新的1.5 ml的离心管中。将离心管放置在37℃的水浴中温育过夜。在最初的1~2个小时内每隔20 min将离心管颠倒混匀。次日，向每一个离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇（按照24∶1的比例混合），将离心管缓慢颠倒混匀30 min，混合物在4000 rpm条件下离心20 min。将离心所得的水相转移到新的离心管中，向其中加入与水等体积的，于4℃预冷的冷异丙醇。混合物在室温条件下，4000 rpm离心30 min，在这一阶段，核酸形成了白色的沉淀。将上清液弃去，向离心管中加入70 %的乙醇，用移液器反复吹打，以去除先前沉淀DNA时所残余的盐离子。离心后弃去乙醇，待乙醇完全挥发后，将提取的DNA溶解于25 μL的TE中，利用紫外-可见分光光度计，测定其浓度。最后将DNA样品保存在–20 °C备用。
实施例3：利用TaqMan荧光定量法对提取枇杷蜜样品中植物源DNA的检测
在20 μL的反应体系中，按照以下反应体系：即Premix Ex Taq (2×)为10 μL；PCR上游(5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’)和下游引物(5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’)(各10 μM)均为0.4 μL；TaqMan探针(FAM-5’-CGTATTGCGCCA AGGAACTCGAACGAAAGAG-3’-TAMRA)为0.8μL；DNA模板为2 μL，灭菌水为6.4 μL进行。添加除模板以外的试剂于一个离心管中，Taq酶使用前需要颠倒混匀，溶解沉淀。使用八联管分装预混液，移液器贴壁向每一管中加入18 μL预混液，尽量避免气泡的产生影响后续实验。最后向每一管中加入2 μL DNA模板（20~50ng，本发明中，将DNA模板统一稀释到50 ng）。每一个样品做三个重复，预混液可适当配置过量。操作过程中尽量减少与八联管管壁或管盖的接触，全程操作在冰上进行。
荧光定量测定在Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System进行，反应第一步95℃ 20秒，1个循环；第二步95℃ 1秒，60℃ 20秒，40个循环数。激发波长为494nm，记录波长为522nm。反应完毕后，用Step OnePlus Real-Time PCR System软件进行循环阈值(Cycling threshold, Ct)值的确定和计算。
实施例4：通过Ct值对枇杷蜜样品中的掺杂掺假进行判定
本发明采用了13个市售枇杷蜜样品进行了检测，同时以双蒸水作为空白对照，山茶叶作为阴性参照，枇杷花作为阳性参照。其中枇杷花的阳性参照Ct值为24.79±0.16，阴性参照山茶叶Ct值为33.89±0.08，空白Ct值为36.04±0.66。其中Ct值界于阳性和阴性参照中间的7个样品，Ct值从26.91至31.2被判定为成熟枇杷蜜，而Ct值界于阴性和空白中间的3个样品，即Ct值从34.15±0.29（HBWH）、36.04±0.66(GXNN)和35.36±0.35(SCCD)，其中前两者由于提取DNA浓度较高（分别为496.1和304.6 ng/μL），而Ct值较大，表明蜂蜜样品中有非枇杷的植物源成分，因此判定为掺杂蜜；而后者的DNA浓度较低（7 ng/μL），表明蜂蜜样品中仅含有极少量DNA成分，被判定为掺入了浓缩加工或杂蜜（因为高温浓缩加工会导致DNA降解，少量DNA有可能是混了少量其它天然杂蜜）。最后没有DNA成分的ANSX样品，被判定为完全为浓缩加工或掺假蜜。
因此，通过本实验中，以20 mL蜂蜜提取的50ng DNA为模板，若26.91< Ct值<31.2，则判定为天然成熟的枇杷蜜，若Ct值 > 34（阴性山茶叶的最大Ct值），如DNA浓度>50ng/μL，则判定为浓缩掺杂蜜，DNA浓度越高，混掺杂蜜越多（如HBWH和GXNN）；反之掺入浓缩加工蜜越多（如SCCD）。若DNA浓度<10 ng/μL,或DNA浓度极低或Ct过高，则均被判定为浓缩加工或掺假蜜（ANSX）。
表1. 天然枇杷蜜样品是否掺杂掺假的判定
Claims (9)
1.一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）根据枇杷18S RNA的ITS序列，设计了特异寡核苷酸引物和TaqMan探针；
2）利用改进的CTAB法提取枇杷蜜中植物源（枇杷花粉）的DNA成分；
3）利用步骤1的寡核苷酸引物和TaqMan探针，以及步骤2中的提取的DNA成分，设计荧光定量PCR方法，进行扩增，记录Ct值数据；
4）基于步骤3的Ct值数据汇合步骤2的DNA提取结果对检测样品进行判定。
2.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤1中ITS序列为枇杷Eriobotrya japonica的18S RNA，全长681bp,Genbank注册号为KJ170761~KJ170775。
3.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤1中寡核苷酸引物，上游序列为5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’；下游序列为5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’，扩增长度为212 bp；扩增序列位于枇杷18SRNA中第96至307bp范围。
4.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤1中TaqMan探针序列为FAM-5’-CGTATTGCGCCAAGGAACTCGAACGAAAGAG-3’-TAMRA，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为淬灭荧光基团；TaqMan探针序列位于寡核苷酸上游引物下游40bp处，及寡核苷酸下游引物的上游101bp处。
5.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤2中枇杷蜜中的DNA提取采用改进后的CTAB法，20 mL蜂蜜样品中提取DNA浓度为10~500 ng/μL。
6.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤3中设计的荧光定量方法中反应体系为20μL，其中Premix ExTaq (2×)为10 μL；PCR上游和下游引物(10 μM)均为0.4 μL；TaqMan探针为0.8 μL；DNA模板为2 μL（20~50 ng），灭菌水为6.4 μL。
7.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤3中设计的荧光定量方法中第一步95℃ 20秒，1个循环；第二步95℃ 1秒，60℃ 20秒，40个循环数，激发波长为494nm，记录波长为522nm。
8.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤4中当循环阈值Ct值界于26.9~31.2时被认为枇杷蜜中具有合理的枇杷植物源成分。
9.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于所述步骤4中，以20 mL蜂蜜提取的50ng DNA为模板，若Ct值 > 34，则判定为浓缩掺杂蜜，此时提取的DNA浓度越高，混掺杂蜜越多，反之掺入浓缩或假蜜越多；若提取DNA浓度<10 ng/μL，或DNA浓度极低或Ct 值>34，均被判定为浓缩或掺假蜜。
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