CN105603118A - 拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及葡萄酒和果汁中拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces？bailii)的快速定性检测技术，具体涉及拜氏接合酵母的检测用引物和探针及其检测方法。本发明选取拜氏接合酵母的26S核糖体RNA基因序列，设计一组特异性引物和探针，使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可实现针对葡萄酒和果汁中拜氏接合酵母的简便快速检测。

Description

拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法
技术领域
本发明涉及微生物的检测，具体涉及一种拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法。
背景技术
拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)是导致食品腐败的一类重要微生物，在食品和饮料行业中，尤其是葡萄酒和果汁，其原料和生产工艺注定了极大的污染概率。拜氏接合酵母能够在弱酸性防腐剂如苯甲酸、山梨酸下生长(PittandHocking,1999)，而且由拜氏接合酵母生长密度依赖很低，引起的食物腐败所需的细胞量很少，研究表明5个细胞就足以使得碳酸饮料变质(PittandHocking,1999)。拜氏接合酵母广泛存在于自然环境中，原料葡萄以及水、空气都可能会引进拜氏接合酵母。一些非酿造酵母与酿酒酵母之间复杂的相互作用为葡萄酒的产生独特的风味，而拜氏接合酵母却因其会产生大量的异味物质如乙酸等,使得葡萄酒感官变差，大量繁殖导致葡萄酒腐败变质。并且它们通常耐高温、高酒精、高酸、高糖和高防腐剂，不易被清除。
由于每年在食品行业造成重大经济损失(ThomasandDavenport,1985),为保证商品的贮藏周期和品质一贯性，同时作为产品生产品质控制的一种重要手段，葡萄酒和果汁中品质检测项目中检测拜氏接合酵母项目尤其重要。
目前已经开发的检测拜氏接合酵母方法，采用选择培养基方法，依赖于拜氏接合酵母在山梨酸酯或其他弱酸选择性培养基的生长能力，增殖时间通常需要4-5天，由于存在选择性山梨酸酯等选择压力，受损的细胞可能不能被检测到。随着分子生物学技术的发展，国外有学者有采用SYBRGreen荧光染料进行拜氏接合酵母检测，但荧光染料依靠双链DNA的结合产生荧光信号，具有一定的假阳性概率，特异性不高。实时荧光PCR探针法凭借其不依赖选择性培养，快速准确，特异性好，灵敏度高的优点，已经在很多微生物的检测分析中成功应用。因此建立一种能够满足葡萄酒和果汁中拜氏接合酵母的实时荧光PCR探针法有很强的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法。
本发明首先涉及一种拜氏接合酵母检测用的引物组和探针序列：
上游引物序列为：5’-TTTGATCAGACATGGTGTTTTGC-3’；
下游引物序列为：5’-ATGCTGGCCCAGTGAACTG-3’；
探针序列为：5’-CCCCTCGCCTCTCGTGGGTG-3’，其5’端标记FAM报告荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
本发明还涉及一种应用所述拜氏接合酵母检测用引物和探针进行拜氏接合酵母检测的方法，包括如下步骤：
(1)破碎样品细胞并提取DNA模板；
(2)使用所述引物进行实时荧光定量PCR检测，检测目标样品中是否含有拜氏接合酵母。
其中，步骤(1)所述的破碎样本细胞并提取DNA的步骤为：
1)取1mL样品加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，加入1mL10mmol/LTris-HClpH8.0重悬沉淀，8000r/min的转速离心5min，倒置于吸水纸上，吸干液体；
2)收集的菌体沉淀中加入600μL山梨醇buffer(配方为：每100mL中含有山梨醇22g；NaH2PO40.27g；Na2HPO41g；pH7.4，先配制成磷酸钠缓冲液再加入山梨醇)，加入50U溶细胞酶(Lyticase)，涡旋振荡器上震荡充分混匀(30℃处理30min)；
3)4000r/min离心10min，弃上清，保留沉淀；
4)破壁后细胞沉淀加700μL20g/LCTAB裂解液，涡旋振荡器上震荡充分混匀，置于65℃水浴中0.5～2h；
5)冷却至室温后，加入400μL酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，13000r/min离心8min，转移上清至新离心管中，弃沉淀；如水相和有机相之间有白色沉淀物，则重新抽提有机相，合并水相，将上清至新离心管中；
6)向上清液中加入1/10体积的3mol/LpH5.2的乙酸钠，用手指轻弹管壁，混匀；
7)加入等体积的异丙醇轻轻颠倒混匀，置于-20℃冰箱中，放置40min；
8)13000r/min离心8min，弃上清，保留沉淀；
9)加入600μL70％乙醇轻轻颠倒几次后离心1min,弃上清，沉淀即为样品DNA模板。
步骤(2)所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为25μL，包括：
12.5μL含有dNTP，Mg2+以及Taq酶的2×realtimePCRBuffer；
所述的上游引物和下游引物各1μL，终浓度各为0.2μM；
所述的探针序列1μL，终浓度为0.2μM；
步骤(1)提取的样品DNA模板2μL；纯水7.5μL；
步骤(2)所述实时荧光定量PCR检测反应程序为：
预变性：温度95℃，时间10分钟；
PCR扩增：温度95℃，时间15秒，温度63℃，时间1分钟，循环40次。
荧光检测设置报告荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为TAMRA，仪器自动选择波长。
本发明还涉及所述的引物组和探针序列在制备检测拜氏接合酵母的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还涉及所述的引物组和探针序列的用于检测拜氏接合酵母的试剂或试剂盒。
本发明的有益效果在于：根据拜氏接合酵母的物种特异基因序列设计用于实时荧光PCR检测的引物和探针，同时对样品处理、细胞破壁、DNA提取和PCR扩增体系条件等做了优化，提供了一种拜氏接合酵母的实时荧光PCR检测方法，可准确、快速鉴定拜氏接合酵母，能够有效检测葡萄酒和果汁饮料中拜氏接合酵母，保证商品的贮藏周期和品质一贯性，同时作为产品生产品质控制的一种重要手段，减少生产企业损失，保证消费者权利。
本发明通过优化改良了样品前处理、细胞破壁方式以及DNA提取方法可以有效减少所提取DNA中的杂质干扰，DNA纯度更高，提高了检测的灵敏度，比商业化的试剂盒更为经济。针对引物和探针序列采取的PCR扩增体系也保证了检测的特异性与灵敏度。
本发明针对拜氏接合酵母的物种特异遗产物质DNA的PCR分子鉴定技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低的特点，能够准确客观的提供实验证据。
附图说明
图1为拜氏接合酵母实时荧光PCR检测方法特异性实验图；
图2为拜氏接合酵母实时荧光PCR检测方法灵敏性实验图。
具体实施方式
结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1，实时荧光PCR检测方法特异性引物的设计
下载GenBank中公布的各种微生物基因序列，通过DNAMAN软件比对分析，选取拜氏接合酵母的26S核糖体RNA基因序列设计出鉴别检测拜氏接合酵母的荧光PCR特异性引物和探针(只能扩增出拜氏接合酵母DNA限制性片段，而扩增不出其它微生物DNA限制性片段)，引物和探针分别如下：
上游引物序列为：5’-TTTGATCAGACATGGTGTTTTGC-3’；
下游引物序列为：5’-ATGCTGGCCCAGTGAACTG-3’；
探针序列：5’(FAM)-CCCCTCGCCTCTCGTGGGTG-3’(TAMRA)。
实施例2，待测样品DNA模板的提取
(2.1)取1mL样品加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，加入1mL10mmol/LTris-HClpH8.0重悬沉淀，8000r/min的转速离心5min，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；
(2.2)酵母细胞破壁：收集的菌体沉淀中加入600μL山梨醇buffer见附录A.2，加入50U溶细胞酶(Lyticase)，涡旋振荡器上震荡充分混匀，30℃处理30min。4000r/min离心10min，弃上清，保留沉淀；
(2.3)破壁后细胞沉淀加700μL20g/LCTAB裂解液，涡旋振荡器上震荡充分混匀，置于65℃水浴中0.5～2h；
(2.4)抽提液抽提：冷却至室温后，加入400μL酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，13000r/min离心8min，转移上清至新离心管中，弃沉淀。如果水相和有机相之间有白色沉淀物，则重新抽提有机相，合并水相，将上清至新离心管中；
(2.5)乙酸钠调节：向上清液中加入1/10体积的3mol/LpH5.2的乙酸钠，用手指轻弹管壁，混匀；
(2.6)异丙醇沉淀：加入等体积的异丙醇轻轻颠倒混匀，置于-20℃冰箱中，放置40min；
(2.7)70％乙醇洗涤：13000r/min离心8min，弃上清，保留沉淀。加入600μL70％乙醇轻轻颠倒几次后离心1min,弃上清，用干净的吸水纸吸干净残留液；
(2.8)干燥：将离心管静置至干燥。
定容与含量测定：干燥后的离心管底部加入50μLTE，置于65℃水浴中40min,室温下测定DNA含量。纯化后的DNA溶液稀释成100ng/μL，作为PCR工作液浓度，4℃保存。以上DNA的提取为优化改良的CTAB法，DNA纯度高，量大，DNA片段较完整，高质量的DNA提取方法对于提高后续PCR灵敏度很重要。
实施例3，拜氏接合酵母实时荧光PCR检测
利用上述实施例1中设计的特异性引物和探针，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。
(3.1)实时荧光PCR反应体系为25μL，包括12.5μL2×realtimePCRBuffer(包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶)，设计的上游引物和下游引物各1μL(终浓度为0.2μM)，探针1μL(终浓度为0.2μM)，提取的产品DNA模板2μL，纯水7.5μL；
(3.2)PCR反应程序为：预变性：温度95℃，时间10分钟，然后进行PCR扩增：温度95℃，时间15秒，温度63℃时间1分钟，循环40次；
(3.3)应用荧光定量PCR仪随机软件，设定反应参数，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果。
样品出现阳性扩增曲线，一般Ct值14-20之间，阴性对照(其他物种DNA)和空白对照(水)无扩增或者CT值与阳性差别明显，Ct值大于30，阳性对照(拜氏接合酵母DNA)产生典型阳性扩增曲线，据此可判定该样品检出拜氏接合酵母。
本方法的特异性与灵敏度验证说明。
(1)引物与探针的特异性验证
利用上述设计的特异性引物与探针，对拜氏接合酵母遗传关系较近的鲁氏接合酵母、陆生伊萨酵母、间型酒香酵母、异酒香酵母、酿酒酵母、热带假丝酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、粘红酵母以及葡萄酒和果汁中可能会存在的其他细菌如乳酸菌、醋酸菌进行DNA提取和荧光PCR检测，验证方法的特异性。
检测结果如图1所示，图1中：1为拜氏接合酵母；2为鲁氏接合酵母；3为陆生伊萨酵母；4为异酒香酵母；5为酿酒酵母；其余样品(间型酒香酵母、热带假丝酵母、孢汉逊酵母、粘红酵母以及乳酸菌、醋酸菌)未检测到信号。个别物种(鲁氏接合酵母；陆生伊萨酵母；异酒香酵母；酿酒酵母)出现的阳性扩增曲线，但其信号CT值与拜氏接合酵母相差很多(>15)，显示上述引物和探针有良好的特异性。
(2)实时荧光PCR的灵敏度验证
检测目标菌株拜氏接合酵母在葡萄酒典型代表基质—红葡萄酒、白葡萄酒和起泡酒中以及果汁代表基质—橙汁、苹果汁、葡萄汁中以3.0*105cfu/mL的菌液按10倍梯度稀释，选择阳性结果中浓度最低的稀释液，分别检测20个样品，若阳性率≥95％，确定检测方法的灵敏度。
验证结果如图2所示：
1号样品为3.0*105cfu/m拜氏接合酵母DNA样品；
2-6号样品分别为用超纯水依次10倍梯度稀释前一组样品的样品。
综合三种基质灵敏度的验证试验，该方法葡萄酒中拜氏接合酵母的检出限为3CFU/mL。
最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的技术方案的实质，并不用作对本发明保护范围的限定。

Claims (8)

1.一种检测拜氏接合酵母用的引物组和探针序列：
上游引物序列为：5’-TTTGATCAGACATGGTGTTTTGC-3’；
下游引物序列为：5’-ATGCTGGCCCAGTGAACTG-3’；
探针序列为：5’-CCCCTCGCCTCTCGTGGGTG-3’，其5’端标记FAM报告荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
2.一种述拜氏接合酵母检测方法，包括如下步骤：
(1)破碎样品细胞并提取DNA模板；
(2)使用所述引物进行实时荧光定量PCR检测，检测目标样品中是否含有拜氏接合酵母。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的破碎样本细胞并提取DNA的步骤为：
1)取1mL样品加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，加入1mL10mmol/LTris-HClpH8.0重悬沉淀，8000r/min的转速离心5min，倒置于吸水纸上，吸干液体；
2)收集的菌体沉淀中加入600μL山梨醇buffer(配方见附录A.2)，加入50U溶细胞酶(Lyticase)，涡旋振荡器上震荡充分混匀(30℃处理30min)；
3)4000r/min离心10min，弃上清，保留沉淀；
4)破壁后细胞沉淀加700μL20g/LCTAB裂解液，涡旋振荡器上震荡充分混匀，置于65℃水浴中0.5～2h；
5)冷却至室温后，加入400μL酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，13000r/min离心8min，转移上清至新离心管中，弃沉淀；如水相和有机相之间有白色沉淀物，则重新抽提有机相，合并水相，将上清至新离心管中；
6)向上清液中加入1/10体积的3mol/LpH5.2的乙酸钠，用手指轻弹管壁，混匀；
7)加入等体积的异丙醇轻轻颠倒混匀，置于-20℃冰箱中，放置40min；
8)13000r/min离心8min，弃上清，保留沉淀；
9)加入600μL70％乙醇轻轻颠倒几次后离心1min,弃上清，沉淀即为样品DNA模板。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为25μL，包括：
12.5μL含有dNTP，Mg2+以及Taq酶的2×realtimePCRBuffer；
所述的上游引物和下游引物各1μL，终浓度各为0.2μM；
所述的探针序列1μL，终浓度为0.2μM；
步骤(1)提取的样品DNA模板2μL；纯水7.5μL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述实时荧光定量PCR检测反应程序为：
预变性：温度95℃，时间10分钟；
PCR扩增：温度95℃，时间15秒，温度63℃，时间1分钟，循环40次。
6.权利要求1所述的引物组和探针序列在制备检测拜氏接合酵母的试剂或试剂盒中的应用。
7.含有权利要求1所述的引物组和探针序列的用于检测拜氏接合酵母的试剂或试剂盒。
8.权利要求2-5任一所述的方法在检测拜氏接合酵母中的应用。
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