CN104988230A

CN104988230A - 用于五倍子蜂蜜的实时荧光pcr检测方法

Info

Publication number: CN104988230A
Application number: CN201510403006.8A
Authority: CN
Inventors: 孙涛; 夏明星; 张学健; 孔德英; 王昱; 李应国; 夏晓华
Original assignee: CHONGQING FOGO ECOLOGICAL APIARIAN Co Ltd
Current assignee: CHONGQING FOGO ECOLOGICAL APIARIAN Co Ltd
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2015-10-21

Abstract

本发明公开了一种用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，包括反应混合液，反应混合液中包括PCR反应预混液、灭菌去离子水和DNA待测模板，反应混合液中还包括探针和一对引物，一对引物的基因序列分别为：AAACCTGCCTAGCAGAACGA；TAAGATTTCCTTGGCGCAAT；探针的基因序列端为：ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA；探针的基因序列两端分别设置有荧光基团、荧光淬灭基团。本发明价格便宜、检测难度低的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法。

Description

用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物分子学领域，具体涉及针对五倍子树ITS序列设计并筛选出的一组特异引物和探针，用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经过在巢脾内转化、脱水、贮存至成熟的过程而成的天然甜物质。蜂蜜含有丰富的必需氨基酸、维生素、多酚类、类黄酮类、多糖、活性酶和类胡萝卜素等活性物质，具有多种生理功能，如抗氧化、抗菌、加速创伤修复和增强免疫等。

五倍子蜂蜜是中药材蜜种，也是难得的森林蜜种，具有解毒、止腹泻、杀菌及收敛作用，对肺肾双虚，脾肾虚寒，气促喘乏，痰火郁肺有良好辅疗效果，特别适合虚汗、肺虚、肾虚、久泻久痢、痔血、便血等人士日常食疗保健之用；市场需求较大，五倍子蜂蜜市场售价是普通蜂蜜价格的3-5倍，市场上出现较多以常见廉价蜂蜜假冒五倍子蜂蜜产品的现象，极大的损害消费者利益，亟待建立切实可靠的五倍子蜂蜜鉴别技术。

目前，蜂蜜种类鉴别技术有感官分析、花粉分析、常规理化分析、色谱、光谱等鉴别技术。我国已有检测真假蜂蜜的国家标准方法，即采用稳定同位素质谱仪测定蜂蜜中的碳-4-植物糖，但是，质谱仪的价格通常在100万左右，价格较贵，另外，在测定时，由于五倍子树有相近似的属种，因此，在检测时，需要不断筛选，寻找出五倍子蜂蜜的蜜源植物，且试剂较贵，因此，对企业来说，检测的方法难度大，由于以上两点，现有的稳定同位素质谱仪的方法难以在企业中推广。

实时荧光PCR技术是近年来兴起的分子检测技术，配以PCR反应液、耐热DNA 聚合酶(Taq emzyme)、4 种脱氧核酸苷酸(dNTP) 等成分，同时在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量定量分析的方法。目前，实时荧光PCR技术已经广泛应用，例如：公开号为CN103014172A、名称为一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法的中国发明专利，则公开了甘蔗黄锈病菌的检测，且PCR仪通常只需要10万、20万左右的即可，且检测时，仅需要将样品提取后的DNA与反应预混液、设计好的引物、探针、灭菌去离子水等加入反应混合液中，放入PCR仪中即可，操作简单方便且价格便宜，由此可见，如果用PCR技术检测五倍子蜂蜜的DNA提取模板，则可针对性的定性、定量鉴别五倍子蜂蜜的DNA，从而判定其真假，且价格便宜、检测方法简单，适于企业推广。目前为止，未发现有类似的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题提供一种价格便宜、检测难度低的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，包括反应混合液，反应混合液中包括第一引物、第二引物和探针，

第一引物的基因序列为：AAACCTGCCTAGCAGAACGA；

第二引物的基因序列为：TAAGATTTCCTTGGCGCAAT；

探针的基因序列为：

ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA；

探针的基因序列两端分别设置有荧光基团、荧光淬灭基团。

采用本发明技术方案的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，应用荧光探针原理，加入一对五倍子树的特异性引物和一条特异性荧光双标记探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，PCR反应预混液中通常含有DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR 反应的增强剂和优化剂以及稳定剂。荧光基团连接在探针基因序列的 5’ 末端，淬灭基团标记在探针基因序列的 3’末端。当探针为完整时，荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭基团接近而被淬灭；而当探针与五倍子的DNA待测模板中的部分基因序列配对后，在DNA聚合酶的作用下，进行延伸时，DNA聚合酶的 5’外切酶活性将探针的酶切位点进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号；引物则实现DNA待测模板、探针的扩增和延伸，进而通过检测增强的荧光信号来进行结果判定。本方法相比现有的稳定同位素质谱仪的方式，特异性强、灵敏度高，可提高结果准确性，从分子层面解决蜂蜜蜜源植物问题，且价格相对较低，检测难度低，可针对性检测DNA待测模板，避免不断筛选，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。

进一步，所述的荧光基团、荧光淬灭基团分别为FAM、TAMRA。FAM、TAMRA较常用，且灵敏度高。

进一步，所述的PCR反应预混液的初始浓度为：2×荧光PCR反应预混液。采用2倍反应预混液，在反应时，配置为1倍的荧光PCR反应预混液，操作方便。

进一步，所述的反应混合液中的各组分浓度为：10μL 2×荧光PCR反应预混液，0.4μL浓度为10μmol/L的第一引物，0.4μL浓度为10μmol/L的第二引物，0.8μL浓度为10μmol/L的探针，4μL DNA，4.4μL灭菌去离子水。

进一步，反应的热循环参数为：

第一步：95℃ 30s；

第二步：95℃ 5s，60℃ 30s，40 个循环；

60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。此参数操作时，所用时间短，效率高。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明：

图1为本发明用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法实施例的荧光扩增曲线图；

图2是本发明的实施例的Ct检测结果图；

图3是本发明实验一的荧光扩增曲线图；

图4为本发明实验一的Ct检测结果图；

图5为本发明实验二的荧光扩增曲线图；

图6为本发明实验二的Ct检测结果图。

具体实施方式

实施例：

一、引物探针的设计和合成

参照GeneBank美国国家生物技术信息中心中盐肤木属物种基因序列，挑选种内保守、种间特异的ITS序列（GeneBank NO. AY641480.1），针对该基因，利用软件primer Express3.0 设计引物及探针，最后经过比较筛选确定的一对引物序列为：

Seq1：AAACCTGCCTAGCAGAACGA

Seq2：TAAGATTTCCTTGGCGCAAT

探针的序列为：

FAM-ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA-TAMRA；

FAM为荧光基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

二、检测步骤：

本发明用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法的具体操作：

1) 配制反应液：在试剂准备区配制反应混合液，各组分浓度体积如下：10μL 2×荧光PCR反应预混液，0.4μL引物Seq1（浓度为10μmol/L），0.4μL引物Seq2（浓度为10μmol/L），0.8μLTaqMan探针Seq3（浓度为10μmol/L），灭菌去离子水4.4μL。荧光PCR反应预混液采购自宝生物（大连）有限公司，货号为RR390。同时设置阳性对照（即五倍子树）、阴性对照（非五倍子树）和空白对照（去离子水），每个试验设置两次重复。

2) 加模板：在样本区，加入4μL DNA待测模板，本发明的DNA待测模板来自五倍子蜂蜜的DNA提取物，阳性对照的DNA待测模板来自于五倍子树的DNA基因组，阴性对照的DNA待测模板用洋槐花蜂蜜基因组DNA，空白对照的DNA待测模板用灭菌去离子水，盖上反应管盖。

3)实时荧光PCR 检测：在检测区，将配制好的PCR 反应管放到ABI StepOne Plμs荧光PCR 仪上，循环程序参数设定为：第一步：95 ℃ 30s；第二步：95℃ 5s，60℃ 30s，40 个循环。60℃时设置FAM荧光通道采集荧光，当然，在具体操作时，可根据PCR的检测反应调节循环程序参数的设定，此为本领域的公知技术，且其检测的效果一致。

4) 结果判定：

计算机根据检测的数据进行分析，分析结果为扩增曲线图和Ct值结果显示。

1、扩增曲线图：如图1所示，扩增曲线变化明显的曲线①为阳性对照样品，扩增曲线变化较明显的曲线②为五倍子蜂蜜样品，扩增曲线无变化的曲线③、④均为阴性对照样品或空白对照样品。

2、分析计算Ct值：通过判定CT值确定样品，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果Ct值≤35.0，则判定本发明的待测物为阳性；如果Ct值≥40，则判定为阴性；如果35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值≥40，则判定为阴性。本发明中，计算机在分析检测结果，经过分析得出Ct值，而计算机设置当Ct值≥40时，则显示为Undetermined，结果如图2所示。

由图2可得出，样品①、②均为Ct值≤35.0，因此，两者均为阳性，样品①为五倍子树的阳性对照样品，则可判定样品②为五倍子蜂蜜的样品；样品③、④为Ct值≥40，判定为阴性，样品④为去离子水空白对照，样品③则为不含有五倍子树成分的蜂蜜。

实验一、实时荧光PCR方法的特异性试验：

以五倍子树近缘种以及常见蜂蜜蜜源植物的DNA作为模板，其名称及代号为：白背麸杨（BBFY）、红麸杨（HFY）、油菜（YC）、枣（ZAO）、荆条（JT）、益母草（YMC）；以五倍子树（P）、两种五倍子蜂蜜（FM01、FM02）的DNA为阳性样品；以灭菌去离子水（NT）为空白对照样品；每个样品取两个重复样。

结果判定：

1、扩增曲线图：

如图3所示，扩增曲线变化明显的曲线①为五倍子树阳性样品；扩增曲线变化较为明显的曲线②为两种五倍子蜂蜜阳性样品，而扩增曲线无变化的曲线③为其余白背麸杨、红麸杨、油菜、枣、荆条、益母草、灭菌去离子水的样品。结果显示，只有五倍子树DNA及五倍子蜂蜜DNA为阳性扩增，其余的样品扩增曲线均为均为阴性扩增。

2、分析计算Ct值：

如图4所示：样品FM01的Ct值分别是33.7、33.87，FM02的Ct值分别是34.32、34.3，P的Ct值为19.52、19.49，Ct值≤35.0，因此，FM01、FM02、P均为阳性，P为五倍子树的阳性对照样品，FM01、FM02为五倍子蜂蜜的样品；而其余样品的Ct值≥40计算机显示Undetermined，判定为阴性。

由此可证明本发明的引物探针特异性良好；曲线变化明显的扩增曲线为阳性对照及五倍子蜂蜜DNA。

实验二、实时荧光PCR方法的灵敏度试验：

用灭菌去离子水将提取的五倍子树基因组DNA（浓度为5×10³pg/μL）10倍梯度稀释成7个系列梯度，稀释后浓度及其代号分别为：5×10³pg/μL（0）、5×10²pg/μL（-1）、5×10pg/μL（-2）、5pg/μL（-3）、0.5pg/μL（-4）、0.05pg/μL（-5）、0.005pg/μL（-6），取4μL作为模板进行灵敏度检测。

结果判定：

1、扩增曲线图：

如图5所示，扩增曲线变化幅度根据稀释浓度的变化而变化，直至浓度最低时，即为0.005pg/μL时扩增曲线无变化。

2、分析计算Ct值：

如图6所示：0.05pg/μL（-5）浓度以上均获得强的荧光扩增曲线，故最低检测限是0.2pg DNA/反应。由此可见，本发明的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法其特异性强、灵敏度高，针对性强。

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims

1.用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，包括反应混合液，反应混合液中包括PCR反应预混液、灭菌去离子水和DNA待测模板，其特征在于：反应混合液中还包括探针和一对引物，一对引物的基因序列分别为：

AAACCTGCCTAGCAGAACGA；

TAAGATTTCCTTGGCGCAAT；

探针的基因序列为：

ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA；

探针的基因序列两端分别设置有荧光基团、荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述的荧光基团、荧光淬灭基团分别为FAM、TAMRA。

3.如权利要求1或2所述用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR反应预混液的初始浓度为：2×荧光PCR反应预混液。

4.如权利要求3所述的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述的反应混合液中的各组分浓度为：10μL 2×荧光PCR反应预混液，0.4μL浓度为10μmol/L的第一引物，0.4μL浓度为10μmol/L的第二引物，0.8μL浓度为10μmol/L的探针，4μL DNA，4.4μL灭菌去离子水。

5.如权利要求4所述的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：反应的热循环参数为：

第一步：95℃ 30s；

第二步：95℃ 5s，60℃ 30s，40 个循环；

60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。