CN103451288B - 一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒 - Google Patents
一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体地，公开了一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒。所述引物是根据柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫7种艾美耳球虫的IGS和ITS特异序列设计得到。将这7对引物用于制备得到的荧光定量PCR试剂盒可以准确、客观并定量检测出以上7种鸡艾美耳球虫，而且，检测试剂盒的特异性和灵敏性非常高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒。
背景技术
鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种常见的寄生虫病。该病危害极为严重，每年全球因球虫病的感染造成大约30亿美元的损失，是鸡病中引起经济损失最为严重的疾病之一。现已发现并公认的鸡艾美耳球虫有7种，即柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫，所有的球虫均有一定的致病性。该病分布很广，感染时常表现两种或两种以上的混合感染，发病率高达50%～70%，死亡率为20%～30%，严重者高达80%。病愈的鸡生长发育受阻，增重缓慢，成年鸡多为带虫者，对养鸡业危害极大，据统计每年给中国养鸡业造成数十亿元损失。其中，致病力最强的是柔嫩艾美耳球虫，分布也最为广泛，其主要寄生于盲肠。其次是毒害艾美耳球虫，主要寄生于小肠。在集约化鸡场中，鸡大多情况下混合感染多种球虫，因此球虫种类的诊断鉴别更为复杂和困难。
长期以来，球虫的分类和鉴定主要依赖于卵囊和孢子囊的形态特征(即形状和大小)、肠道中寄生部位、最短潜在期、最短孢子化时间、肠道病变、致病性和免疫原性等生物学特征。然而各个虫种之间的特征性指标不是十分明显，而且球虫又多是混合感染，有些鉴定指标还依赖于实验操作人员的主观判断，不同的操作人员很有可能得出不一样的结论。因此尽管这些鉴定指标迄今仍然用于鸡球虫的流行病学研究中，但临床上急需更为准确和操作方便的鉴定方法。
自1985年Mullis等创立聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR)技术以来，它已成为分子生物学领域最为常见的方法之一。并且以PCR技术为基础，经过不断的探索和完善，研究者们已发展出多种相关技术应用于寄生虫遗传变异和种类鉴定的分子生物学方法研究，包括特异PCR、DNA序列分析、多重PCR、扩增片段长度多态性（AFLP）、聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、单链构象多态性（SSCR）以及荧光定量PCR等，为分子寄生虫学和分子遗传学的发展提供了有利的工具。
荧光定量PCR原理是以荧光共振能量转移为基础，在反应体系中加入荧光探针或荧光染料，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR的反应过程。荧光染料可以结合在DNA双链的小沟中，当DNA扩增时，荧光染料可以与dsDNA结合，发出荧光信号，并且随着dsDNA的逐渐增多，荧光信号逐渐增强，当信号达到阈值时，荧光信号即可被荧光定量PCR仪器检测到。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。通过对不同稀释倍数的标准样品做荧光定量PCR，即可做出标准曲线。利用标准曲线可以对未知样品进行定性和定量检测。常用的荧光染料有Pico Green和SYBR Green，荧光染料法相对于荧光探针优势在于检测方法简单，检测成本低。实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有灵敏度高，特异性强，自动化程度高等优点，并且能有效解决PCR污染问题。
发明内容
本发明为了克服现有技术球虫种类的诊断鉴别技术不准确和复杂的缺陷，提供一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物。
本发明的另一个目的是提供一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR试剂盒。
本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：
一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物，核苷酸序列如下：
Tn引物对序列如SEQ ID NO:1~2所示；
Ne引物对序列如SEQ ID NO:3~4所示；
Mx引物对序列如SEQ ID NO:5~6所示；
Ac引物对序列如SEQ ID NO:7~8所示；
Mt引物对序列如SEQ ID NO:9~10所示；
Pr引物对序列如SEQ ID NO:11~12所示；
Br引物对序列如SEQ ID NO:13~14所示；
其中，Tn引物对用于检测柔嫩艾美耳球虫；Ne引物对用于检测毒害艾美耳球虫；Mx引物对用于检测巨型艾美耳球虫；Ac引物对用于检测堆型艾美耳球虫；Mt引物对用于检测和缓艾美耳球虫；Pr引物对用于检测早熟艾美耳球虫；Br引物对用于检测布氏艾美耳球虫。
以上引物对是发明人通过对来自于不同流行区的鸡艾美耳球虫分离株的核糖体DNA进行遗传变异分析，发现核糖体IGS序列和ITS序列在同种不同株艾美耳球虫间差异很小，而在不同种间的差异非常大。因此本申请人根据7种艾美耳球虫的IGS和ITS特异序列设计了上述引物对。
一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR反应体系，如上所述7对引物各自配制一个反应体系，共配制7个反应体系；每个反应体系为SYBR
GREEN I 反应混合液 8µL，引物各1µL，双蒸水10µL，待检测样品DNA模板 5µL。
所述每个反应体系的荧光定量PCR扩增条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火1 min，80℃延伸1 min，在此处采集荧光，共40个循环。
一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒含有如下成分：待检测粪便样品DNA提取液，SYBR
GREEN I反应混合液；终浓度为50 pmol/µL的如上所述的各引物对。
所述试剂盒还含有1 mm的玻璃珠和Inhibit
Ex Tablet。
所述待检测粪便样品DNA提取液含有ASL
Buffer、proteinase K、Buffer AL、Buffer AW1、Buffer AW2、Buffer
AE、96%～100%酒精、10%次氯酸钠；以上每种溶剂单独存放于一溶剂瓶中。其中，ASL
Buffer、proteinase K、Buffer AL、Buffer AW1、Buffer AW2和Buffer
AE来源于天根的DNA提取试剂盒，当然，本发明所述待检测粪便样品DNA的提取也可以采用本领域其它常规的粪便DNA的提取方法。
所述SYBR GREEN I反应混合液是从TaKaRa公司购买的试剂，其组成为：TaKaRa Ex Taq HS、dNTP
Mixture、 Mg2+和SYBR® Green I 。
优选地，所述试剂盒的容量规格一般为50个反应的量，因此，所述试剂盒含有的待检测粪便样品DNA提取液组分为：50个反应的140 mL的ASL Buffer、1.4
mL的proteinase K、33 mL的Buffer AL、19 mL的Buffer AW1、13 mL的Buffer AW2、12 mL的Buffer AE、10 mL的96%～100%酒精和100 mL的10%次氯酸钠；
荧光定量PCR反应液：为400个反应的SYBR GREEN I反应混合液、终浓度为50
pmol/uL的七种艾美耳球虫特异性引物。
本发明同时提供所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.待测粪便DNA的提取：待测粪便DNA的提取方法可参照QIAamp DNA Stool
Mini Kit的使用说明；当然也可以采用本领域其它常规的粪便DNA的提取方法。下面以QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒来介绍粪便DNA的提取。
（1）称取200
mg粪便放置在2 mL的离心管，粪便用1.5
mL的10%次氯酸钠在冰上漂白10
min，漂白完后粪便用水洗两次。
（2）加入1.4
mL ASL Buffer和0.4 g玻璃珠（1 mm），震荡1～2 h。
（3）将悬浮液放置70℃，5 min。
（4）漩涡震荡15 s，然后离心样品20000 rpm，1 min。
（5）吸取1.2
mL悬浮液到2 mL离心管中。
（6）加入1个InhibitEx Tablet到离心管中，立即漩涡震荡1 min，直到InhibitEx Tablet完全悬浮，室温下静置1 min。
（7）离心样品20000
rpm，3 min。
（8）吸取所有上清液到新的1.5
mL离心管中，离心样品20000 rpm，3 min。
（9）吸取15 μL proteinase K到新的1.5
mL离心管中。
（10）吸取步骤（8）中的200 µL上清液到盛有proteinase K的1.5 mL离心管中。
（11）加入200
µL Buffer AL，漩涡震荡15 s。
（12）瞬时离心，70℃水浴10 min。
（13）加入200
µL 96~100%的酒精，漩涡震荡混匀，瞬时离心。
（14）小心地将步骤13中的液体加入到QiAamp Mini Spin Column中，盖上盖子，离心20000
rpm，1 min。将QiAamp
Spin Column放入一个新的2 mL的Collection
Tube。（注：如果离心完后，看到QiAamp Spin Column中仍有液体，再离心一次。）
（15）小心打开QiAamp Spin Column，加入500 μL Buffer AW1，盖上盖子，离心20000
rpm，1 min。将QiAamp
Spin Column放入新的2 mL Collection Tube。
（16）小心打开盖子，加入500
µL Buffer AW2。盖上盖子离心20000 rpm，3 min。
建议：将QiAamp Spin Column放入一个新的2 mL的Collection Tube，离心20000 rpm，1 min。
（17）将QiAamp
Spin Column放入一个新的1.5 mL离心管中，小心打开QiAamp
Spin Column盖子，加入50 µL Buffer AE在QiAamp Spin Column膜上。盖上盖子，在室温下静置1 min，然后离心20000 rpm，1 min，离心管里即为DNA。
S2.荧光定量PCR扩增：如上所述7对引物各自配制一个反应体系，共配制7个反应体系；每个反应体系为：SYBR
GREEN I反应混合液 8 µL，引物各1 µL，双蒸水10 µL，模板DNA 5 µL。按照扩增样品数n（n=n+1）取PCR反应液，根据引物的不同混于7个离心管中，混匀，分装。取各样品DNA加入对应反应管中，各反应管标记后混匀离心，置于荧光定量PCR仪上反应。
每个反应体系的荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火1 min，80℃延伸1 min共40个循环。
S3.荧光定量PCR结果分析：从终端电脑上读取荧光定量PCR扩增结果。
本发明的有益效果：
1、本发明通过对来自于不同流行区的鸡艾美耳球虫分离株核糖体DNA的遗传变异分析，发现核糖体IGS和ITS序列在同种不同株艾美耳球虫间差异很小，而在不同种间的差异非常大。在此基础上本申请人根据7种艾美耳球虫的IGS和ITS特异序列设计七对特异引物，建立了用于定量检测7种鸡艾美耳球虫荧光定量PCR检测方法。
2、本发明通过优化反应体系和反应条件，研制出一种基于荧光染料法的定量检测7种鸡艾美耳球虫荧光定量PCR试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观。该方法可实现对鸡球虫病的流行病学调查、隐性感染的检测和临床诊断，为鸡球虫的诊断和防治技术等进一步研究奠定了基础。
说明书附图
图1. 柔嫩艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图。
图2. 毒害艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图。
图3. 巨型艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图。
图4. 堆型艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图。
图5. 缓艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图。
图6. 早熟艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图。
图7. 布氏艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图。
图8. 柔嫩艾美耳球虫的荧光定量PCR扩增曲线（左）及标准曲线（右）。
图9. 毒害艾美耳球虫的荧光定量PCR扩增曲线（左）及标准曲线（右）。
图10. 巨型艾美耳球虫的荧光定量PCR扩增曲线（左）及标准曲线（右）。
图11. 堆型艾美耳球虫的荧光定量PCR扩增曲线（左）及标准曲线（右）。
图12. 缓艾美耳球虫的荧光定量PCR扩增曲线（左）及标准曲线（右）。
图13. 早熟艾美耳球虫的荧光定量PCR扩增曲线（左）及标准曲线（右）。
图14. 布氏艾美耳球虫的荧光定量PCR扩增曲线（左）及标准曲线（右）。
图15. 20株艾美耳球虫中柔嫩艾美耳球虫检测结果。
图16. 20株艾美耳球虫中毒害艾美耳球虫检测结果。
图17. 20株艾美耳球虫中巨型艾美耳球虫检测结果。
图18. 20株艾美耳球虫中堆型艾美耳球虫检测结果。
图19. 20株艾美耳球虫中缓艾美耳球虫检测结果。
图20. 20株艾美耳球虫中早熟艾美耳球虫检测结果。
图21. 20株艾美耳球虫中布氏艾美耳球虫检测结果。
图22. 19份临床样品中柔嫩艾美耳球虫检测结果。
图23. 19份临床样品中毒害艾美耳球虫检测结果。
图24. 19份临床样品中巨型艾美耳球虫检测结果。
图25. 19份临床样品中堆型艾美耳球虫检测结果。
图26. 19份临床样品中缓艾美耳球虫检测结果。
图27. 19份临床样品中早熟艾美耳球虫检测结果。
图28. 19份临床样品中布氏艾美耳球虫检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。
实施例1
7对特异引物的设计：本研究对来自于不同流行区的鸡艾美耳球虫分离株的核糖体DNA进行遗传变异分析，发现核糖体IGS序列和ITS序列在同种不同株艾美耳球虫间差异很小，而在不同种间的差异非常大。发明人根据7种艾美耳球虫的IGS和ITS特异序列设计7种特异引物如下表1：
表1 七种艾美耳球虫荧光定量PCR特意性引物
实施例2
定量检测7种艾美耳球虫的荧光定量PCR试剂盒
所述试剂盒包括待检测粪便DNA提取液；400个反应的SYBR GREEN I反应混合液；终浓度为50
pmol/µL的实施例1所示的7种艾美耳球虫特异性引物；无菌水。所述SYBR GREEN I反应混合液是从TaKaRa公司购买的试剂，SYBR GREEN I反应混合液含有TaKaRa Ex Taq HS、dNTP
Mixture、 Mg2+和SYBR® Green I 。
待检测粪便DNA提取液包括：50个反应的140 mL的ASL Buffer；1.4 mL的proteinase K；33 mL的Buffer AL；19 mL的Buffer AW1；13 mL的Buffer AW2；12 mL的Buffer AE；10 mL的96%～100%酒精；100 mL的10%次氯酸钠。其中，ASL Buffer、proteinase K、Buffer
AL、Buffer AW1、Buffer
AW2和Buffer AE来源于天根的DNA提取试剂盒，当然，本发明所述待检测粪便样品DNA的提取也可以采用本领域其它常规的粪便DNA的提取方法。
以上试剂单独存于放于一个试剂瓶中。
所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.待测粪便DNA的提取：
（1）称取200 mg粪便放置在2 mL的离心管，粪便用1.5 mL的10%次氯酸钠在冰上漂白10 min，漂白完后粪便用水洗两次。
（2）加入1.4
mL ASL Buffer和0.4 g玻璃珠（1 mm），震荡1～2 h。
（3）将悬浮液放置70℃，5 min。
（4）漩涡震荡15 s，然后离心样品20000 rpm，1 min。
（5）吸取1.2
mL悬浮液到2 mL离心管中。
（6）加入1个InhibitEx Tablet到离心管中，立即漩涡震荡1 min，直到InhibitEx Tablet完全悬浮，室温下静置1 min。
（7）离心样品20000
rpm，3 min。
（8）吸取所有上清液到新的1.5
mL离心管中，离心样品20000 rpm，3 min。
（9）吸取15 µL
proteinase K到新的1.5 mL离心管中。
（10）吸取步骤（8）中的200 µL上清液到盛有proteinase K的1.5 mL离心管中。
（11）加入200
µL Buffer AL，漩涡震荡15 s。
（12）瞬时离心，70℃水浴10 min。
（13）加入200
µL 96~100%的酒精，漩涡震荡混匀，瞬时离心。
（14）小心地将步骤13中的液体加入到QiAamp Mini Spin Column中，盖上盖子，离心20000
rpm，1 min。将QiAamp
Spin Column放入一个新的2 mL的Collection
Tube。（注：如果离心完后，看到QiAamp Spin Column中仍有液体，再离心一次。）
（15）小心打开QiAamp Spin Column，加入500
µL Buffer AW1，盖上盖子，离心20000 rpm，1 min。将QiAamp Spin Column放入新的2 mL
Collection Tube。
（16）小心打开盖子，加入500
µL Buffer AW2。盖上盖子离心20000 rpm，3 min。
建议：将QiAamp Spin Column放入一个新的2 mL的Collection Tube，离心20000 rpm，1 min。
（17）将QiAamp
Spin Column放入一个新的1.5 mL离心管中，小心打开QiAamp
Spin Column盖子，加入50 µL Buffer AE在QiAamp Spin Column膜上。盖上盖子，在室温下静置1 min，然后离心20000 rpm，1 min，离心管里即为DNA。
S2.荧光定量PCR扩增：如上所述7对引物各自配制一个反应体系，共配制7个反应体系；每个反应体系为：SYBR
GREEN I反应混合液 8 µL，引物各1 µL，双蒸水10 µL，模板DNA 5 µL。按照扩增样品数n（n=n+1）取PCR反应液，根据引物的不同混于7个离心管中，混匀，分装。取各样品DNA加入对应反应管中，各反应管标记后混匀离心，置于荧光定量PCR仪上反应。
每个反应体系的荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火1 min，80℃延伸1 min共40个循环。
S3.荧光定量PCR结果分析：从终端电脑上读取荧光定量PCR扩增结果。
实施例3
实施例2所述试剂盒特异性试验
用经过DNA有效性验证的的7种鸡艾美耳球虫DNA各5 µL为模板，按照试剂盒的反应条件对7对引物进行特异荧光定量PCR扩增，同时设空白（空白对照的模板为无菌水）。反应体系为：SYBR GREEN I反应混合液 8 µL，引物各1µL，双蒸水10µL，模板DNA 5µL。
荧光定量PCR扩增条件为：
结果表明：七对引物均能特异性扩增出七种艾美耳球虫（见图1-7）。
实施例4 实施例2所述试剂盒的标准曲线及敏感性分析
分别以含有105，104，103，102，101，100个卵囊量的样品的球虫DNA为模板，制作标准曲线（见图8-14）和标准方程（表2）并分析其敏感性。结果显示荧光定量PCR在10以下时CT值未达到荧光阈值，可得出荧光定量PCR的最低检测个数为10个球虫卵囊。
表2七种艾美耳球虫荧光定量PCR标准方程
注：x=log10(卵囊含量），CT值为荧光信号达到设定阈值时的循环数。
实施例5 实施例2所述试剂盒的稳定性试验
取含有105，104，103,102,101个卵囊含量的DNA，每个梯度重复3次，计算每次的CT值，求得变异系数，评价其稳定性。
结果显示其变异系数CV为0.4%~2.8%，均小于3%（表3）。说明该方法具有良好的稳定性。
表3 七种艾美耳球虫荧光定量PCR稳定性试验结果
实施例6 实施例2所述试剂盒对20株艾美耳球虫的特异性检测
利用实施例2所述试剂盒对实验室保存的20株已定种的艾美耳球虫进行检测，来验证本试剂盒的特异性。
结果显示（见图15-21）均能特异性扩增所对应的艾美耳球虫，说明所建立的荧光定量PCR具有良好的特异性。
实施例7 实施例2所述试剂盒对临床样品的检测
分别对广东 惠州、斗门和新兴三个鸡场共19份样品进行检测。从粪便中直接提取DNA，利用传统方法以及本试剂盒进行荧光定量PCR检测。所检测样品CT值见表4和图22-28，将CT值代入表2的公式中可得出卵囊含量（表5），结果显示利用荧光定量PCR方法相比于传统方法更加特异和准确。
表4 19份样品荧光定量PCR检测CT值
表5 荧光定量PCR方法和传统方法对样品的检测结果
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Tn-F
<400> 1
gggatgtgcg aactctga
18
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<211> 18
<212> DNA
<213> Tn-R
<400> 2
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18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Ne-F
<400> 3
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20
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<212> DNA
<213> Ne-R
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18
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<212> DNA
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ttccaacatc cgctacat
18
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<211> 18
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<213> Mx-R
<400> 6
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<212> DNA
<213> Ac-F
<400> 7
tggaagtgct gggagatt
18
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<211> 18
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<213> Mt-F
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<211> 18
<212> DNA
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<400> 14
cgacgcaggt gagctact
18
Claims (2)
1.检测七种鸡艾美耳球虫的引物，其特征在于，核苷酸序列如下：
Tn引物对序列如SEQ ID NO:1~2所示；
Ne引物对序列如SEQ ID NO:3~4所示；
Mx引物对序列如SEQ ID NO:5~6所示；
Ac引物对序列如SEQ ID NO:7~8所示；
Mt引物对序列如SEQ ID NO:9~10所示；
Pr引物对序列如SEQ ID NO:11~12所示；
Br引物对序列如SEQ ID NO:13~14所示；
其中，Tn引物对用于检测柔嫩艾美耳球虫；Ne引物对用于检测毒害艾美耳球虫；Mx引物对用于检测巨型艾美耳球虫；Ac引物对用于检测堆型艾美耳球虫；Mt引物对用于检测和缓艾美耳球虫；Pr引物对用于检测早熟艾美耳球虫；Br引物对用于检测布氏艾美耳球虫。
2.一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR反应体系，其特征在于，权利要求1所述7对引物各自配制一个反应体系，共配制7个反应体系；每个反应体系为SYBR GREEN I 反应混合液 8μL，引物各1μL，双蒸水10μL，待检测样品DNA模板 5μL。
3.一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如下成分：待检测粪便样品DNA提取液；SYBR GREEN I反应混合液；终浓度为50 pmol/μL的权利要求1所述的各引物对。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有1 mm的玻璃珠和Inhibit Ex Tablet。
5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述SYBR GREEN I 反应混合液含有TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+和SYBR Green I。
6.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述待检测粪便样品DNA提取液含有10%次氯酸钠溶液、ASL Buffer、Proteinase K、Buffer AL、96%～100%酒精、Buffer AW1、Buffer AW2和Buffer AE；所述ASL Buffer、Buffer AL、Buffer AW1、Buffer AW2和Buffer AE来源于天根的DNA提取试剂盒。
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