CN105420362B

CN105420362B - 兔中型艾美耳球虫荧光定量pcr检测引物和试剂盒

Info

Publication number: CN105420362B
Application number: CN201510927370.4A
Authority: CN
Inventors: 林瑞庆; 许家园; 翁亚彪; 胡会朋; 李国良; 何茜; 吕梦娜
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2035-12-14
Also published as: CN105420362A

Abstract

本发明涉及检测技术领域，具体公开了兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测引物和试剂盒，所述引物为Me‑F和Me‑R，其序列如SEQ ID NO：1～2所示，基于所述引物优化反应体系和反应条件，研制出一种基于荧光染料法的定量检测兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观。该方法可实现对兔球虫病的流行病学调查及临床诊断，为兔球虫的诊断和防治技术，临床快速而准确的检测兔球虫的感染情况提供技术支持。

Description

兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及检测技术领域，更具体地，涉及兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测引物和试剂盒。

背景技术

兔球虫病是一类由兔艾美耳球虫寄生于家兔肝胆管和肠道上皮细胞内所引起的一种最常见的原虫性疾病。该病危害严重，流行广泛，感染率高，对养兔业的危害极大，每年造成巨大的经济损失，呈世界分布，据报道1～3月龄的幼兔感染率可达100％，患病后幼兔的死亡率高达70％左右，在我国很多地区也均有感染报道。该病病原种类多达11个种，分别是斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai)、穿孔艾美耳球虫(Eimeria perforans)、大型艾美耳球虫(Eimeria magna)、梨型艾美耳球虫(Eimeria piriformis)、肠艾美耳球虫(Eimeriaintestinalis)、维氏艾美耳球虫(Eimeria vejdovskyi)、中型艾美耳球虫(Eimeriamedia)、无残艾美耳球虫(Eimeria irresidua)、小型艾美耳球虫(Eimeria exigua)、黄艾美耳球虫(Eimeria flsvescens)和盲肠艾美耳球虫(Eimeria coecicola)。其中流行病学调查显示中型艾美耳球虫流行广泛。

目前常用的诊断方法是饱和盐水漂浮法，浮卵后通过显微镜检测粪便中的卵囊。兔球虫呈混合感染，各个虫种卵囊之间的形态特征不是十分明显，增加了临床操作人员鉴别诊断的难度。因此建立一种准确、简便、快速的兔球虫鉴别诊断方法意义重大。

实时定量PCR(Real-time PCR)技术在PCR反应体系中加入荧光基团，以荧光信号的强度实时监测整个PCR反应的进程，最后达到对未知模板进行定量分析的方法。反应体系中加入荧光基团后，随着反应的每一步扩增荧光信号逐渐增强，这些荧光信号可以被仪器设备实时地采集、分析，同时绘制出一条循环反应数与荧光信号强度的标准曲线。PCR反应初期产生的荧光信号弱，当DNA扩增进入指数期，产生的荧光信号越来越强，达到能被检测到的水平，因此选取DNA指数扩增期的某一点来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含量，达到对模板的定量检测。常用的有SYBR Green I染料法和TaqMan探针法，SYBR GreenI法成本低、操作简便，虽然其特异性不如TaqMan探针法，但使用特异性高的引物，优化反应体系与条件，消除非特异性扩增和二聚体的生成，也能达到很高的特异性。SYBR Green I能结合到dsDNA小沟部位，是一种具有绿色激发波长的染料，它只有与dsDNA结合才会发出荧光，在变性时，DNA双链分开，不产生荧光，在复性和延伸时，形成dsDNA，SYBR Green I发出荧光。与普通PCR相比，荧光定量PCR具有灵敏、精确、简单、快速等优点，在PCR的扩增及分析过程均在同一封闭系统下完成，只需一次打开PCR反应管，避免交叉污染导致假阳性的产生，被广泛的应用于各种临床病原的检测。

ITS序列是位于核糖体DNA序列中的一段内转录间隔区序列，ITS序列不同于其两端的大小亚基基因，ITS区不加入成熟的核糖体，功能上不受限制，受到的选择压力较小，导致其在核苷酸长度和序列上出现了很大的变异。特别适合作为种间分类鉴定的分子标记，已广泛应用于寄生虫病原的分类鉴定研究上。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中兔球虫病检测所存在的缺陷，提供一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对。

本发明的第二个目的是提供含有所述检测引物的检测试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对，所述引物对为Me-F和Me-R，其序列如SEQ ID NO：1～2所示。

本研究首先对兔中型艾美耳球虫广西玉林分离株兔球虫的核糖体ITS序列进行PCR扩增、测序分析，与GenBank中公布的序列进行序列分析，发现ITS序列表现出种内相对保守而种间差异较大的特征。适合作为种间分子鉴定的分子标记序列。发明人通过设计多对引物，最终筛选获得一对能特异性检测兔中型艾美耳球虫病的引物。

本发明还提供检测兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒含有所述的检测引物对和荧光定量检测试剂。

优选地，所述试剂盒中Me-F和Me-R的浓度分别为25pmol/uL。

优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。

优选地，所述荧光定量检测试剂为SYBR Green Primix Ex Taq II，所述DNA提取试剂为QIAamp DNA Stool Mini Kit。

更优选地，所述QIAamp DNA Stool Mini Kit为100个反应的140mL的ASL Buffer、1.5mL的proteinase K、20mL的Buffer AL、50mL的Buffer AW1、50mL的Buffer AW2、10mL的Buffer AE、20mL的96％～100％酒精。

优选地，所述试剂盒的荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green Primix Ex Taq II10μL，Me-F和Me-R各0.25μL，模板DNA 2μL，dd H₂O 7.5μL，共20μL。

优选地，所述试剂盒的荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，59℃退火30s，72℃延伸30s共运行40个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过设计筛选获得一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对，所述引物对为Me-F和Me-R，其序列如SEQ ID NO：1～2所示，基于所述引物优化反应体系和反应条件，研制出一种基于荧光染料法的定量检测兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观。该方法可实现对兔球虫病的流行病学调查及临床诊断，为兔球虫的诊断和防治技术，临床快速而准确的检测兔球虫的感染情况提供技术支持。

附图说明

图1为兔中型艾美耳球虫的荧光定量PCR特异性扩增图及溶解曲线；其中1～4分别为中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫。

图2为兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR扩增曲线及标准曲线；1～5分别为兔中型艾美耳球虫DNA原液按10～10⁵倍稀释得到的五个稀释度DNA，其中，图2A是兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR扩增曲线，图2B是兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR标准曲线。

图3为兔中型艾美耳球虫荧光定量检测方法的敏感性试验扩增图；1～6分别为兔中型艾美耳球虫DNA原液按10～10⁶倍稀释得到的6个稀释度DNA。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。

实施例1 引物设计和筛选

首先对兔中型艾美耳球虫广西玉林分离株兔球虫的核糖体ITS序列进行PCR扩增、测序分析，与GenBank中公布的序列进行序列分析，发现ITS序列表现出种内相对保守而种间差异较大的特征，适合作为种间分子鉴定的分子标记序列。在种内保守的区域设计特异性引物，并参考国外已报到的特异性引物，通过实验验证筛选出最为合适的引物，用于定量实验。

表1 兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR引物设计

由表1所设计的序列进行荧光定量PCR，结果表明：只有引物组1能够特异性的扩增。

为了验证引物的特异性，将4种艾美耳球虫(中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫)分别作为模板做荧光定量PCR实验，检测中型艾美耳球虫引物特异性，同时设无模板阴性对照。反应体系和反应条件同上，扩增完做熔解曲线，结果显示本发明所述引物的荧光定量检测方法特异性强，见图1。

实施例2 试剂盒的制备和使用方法

试剂盒内含粪便DNA提取试剂(QIAamp DNA Stool Mini Kit)，其中含100个反应的140mL的ASL Buffer、1.5mL的proteinase K、250mL的Buffer AL、50mL的Buffer AW1、50mL的Buffer AW2、10mL的Buffer AE、20mL的96％～100％酒精；荧光定量PCR反应液为100个反应的SYBR Green Primix Ex Taq II试剂、终浓度为25pmol/μL的中型艾美耳球虫特异性引物。

一、上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)粪便DNA的提取：

参照QIAamp DNA Stool Mini Kit的使用说明，具体操作步骤如下：

a.称取200mg粪便放置在2mL的离心管。

b.加入1.4mL ASL Buffer和0.4g玻璃珠(1mm)，震荡1～2h。

c.将悬浮液放置70℃，5min。

d.漩涡震荡15s，然后离心样品15000rpm，1min。

c.吸取1.2mL悬浮液到2mL离心管中。

e.加入1个InhibitEx Tablet到离心管中，立即漩涡震荡1min，直到InhibitExTablet完全悬浮，室温下静置1min。

f.离心样品15000rpm，3min。

g.吸取所有上清液到新的1.5mL离心管中，离心样品15000rpm，3min。

h.吸取15μL proteinase K到新的1.5mL离心管中。

i.吸取步骤g中的200μL上清液到乘有proteinase K中的1.5mL离心管中。

j.加入200μL Buffer AL，漩涡震荡15s。

k.瞬时离心，70℃水浴10min。

l.加入200μL酒精(96％-100％)，漩涡震荡混匀，瞬时离心。

m.小心地将步骤l中的液体加入到QiAamp Mini Spin Column中，盖上盖子，离心15000rpm，1min。将QiAamp Spin Column放入一个新的2mL的Collection Tube。(注：如果离心完后，看到QiAamp Spin Column中仍有液体，再离心一次。)

n.小心打开QiAamp Spin Column，加入500μL Buffer AW1，盖上盖子，离心15000rpm，1min。将QiAamp Spin Column放入新的2mL Collection Tube。

o.小心打开盖子，加入500μL Buffer AW2。盖上盖子离心15000rpm，3min。

建议：将QiAamp Spin Column放入一个新的2mL的Collection Tube，离心15000rpm，1min。

p.将QiAamp Spin Column放入一个新的1.5mL离心管中，小心打开QiAamp SpinColumn盖子，加入50μL Buffer AE在QiAamp Spin Column膜上。盖上盖子，在室温下静置1min，然后离心15000rpm，1min，离心管里即为DNA。

(2)荧光定量PCR反应体系与扩增条件：

反应体系为：SYBR Green Primix Ex Taq II 10μL，上下游引物(25pmol/μL)各0.25μL，模板DNA 2μL，dd H₂O 7.5μL，共20μL。

PCR扩增条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，59℃退火30s，72℃延伸30s(40个循环)。

(3)荧光定量PCR结果分析：从终端电脑上读取荧光定量PCR扩增结果。

二、试剂盒的标准曲线

吸取含10⁶个卵囊的兔中型艾美耳球虫进行DNA提取，提取得到的DNA称为DNA原液，将DNA原液做1：10～1：10⁵倍比稀释，得到的5个梯度的DNA样品相当于卵囊数分别为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹所提取得到的DNA，将这5个梯度的DNA样品进行实时荧光定量PCR，反应体系和条件同上，根据荧光定量PCR的动力学曲线结果，检测仪系统自动生成标准曲线(图2B)以及回归方程(表2)；本发明用兔中型艾美耳球虫种特异性引物对未知模板DNA进行SYBRGreen染料荧光定量PCR扩增，阳性结果会出现“S”扩增曲线，阴性结果则不会出现。将得到的CT值代入标准方程即可求得未知样品的卵囊含量。

表2 兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR标准方程

样品	CT值(10<sup>5</sup>、10<sup>4</sup>、10<sup>3</sup>、10<sup>2</sup>、10<sup>1</sup>)	标准方程	R<sup>2</sup>	阈值
					E.media	15.25、19.28、22.41、26.40、29.57	CT＝-3.576*log10X+33.313	0.998	0.1

注：x＝卵囊量，CT值为荧光信号达到设定阈值时的循环数。

实施例3 试剂盒的敏感性试验

将兔中型艾美耳球虫10⁶个卵囊DNA原液做1：10～1：10⁶倍比稀释，用实施例2所建立的real-time PCR方法进行检测，分析敏感性结果见图3，最低能检测到10个卵囊的DNA。

实施例4 试剂盒的稳定性试验

将兔中型艾美耳球虫DNA原液分别做1：10～1：10⁵倍比稀释形成5个梯度，进行3次组内和组间重复试验，用实施例2所述荧光定量PCR体系和反应条件进行PCR扩增，根据检测结果计算CT平均值和变异系数(CV)，评价这些方法的稳定性，结果见表3。结果显示所建立的几种方法组内组间重复性变异系数CV为0.1％～1.8％，均小于2％。说明该方法具有良好的稳定性。

表3 中型艾美耳球虫实时荧光定量PCR的组内和组间重复性实验结果

实施例5 实施例2所述试剂盒对临床样品的检测

采集佛山芦苞地区几个规模化的兔场粪便样品共计32份，其中种兔12份，幼兔20份，对每份样品分别称取200mg的粪便进行粪便DNA提取(QIAGEN粪便DNA提取试剂盒)，再用实施例2建立的荧光定量方法检测，得到每个样品的CT值，通过标准方程计算出卵囊含量，再推算出OPG(每克粪便中的卵囊含量)大小，计算兔中型艾美耳球虫球虫的感染情况。定量检测结果及显微镜计数(显微镜计数结果是11种球虫混合卵囊的量)结果如表4(1～12号样品为种兔，13～32号为幼兔)。

表4 临床样品荧光定量检测结果及镜检结果(OPG)

由上表可以看出，传统的显微镜检查有一定局限性，不易定种，且只有当OPG在100以上才能被检测出，而荧光定量PCR检测方法的精确度更高，能检测出显微镜检测为阴性的样品。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测引物和试剂盒

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Me-F

<400> 1

gttttgggag ttcgtgcttt ttgg 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Me-R

<400> 2

tggtggtgac ctatgggcga aag 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> F2

<400> 3

gcatcacatt atccgtcgct tca 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> R2

<400> 4

ctgcctcact cctactactc accacaa 27

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> F3

<400> 5

cattgtgctg tgttgttggc ttg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> R3

<400> 6

atttttcccc accaccgtat ctc 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> F4

<400> 7

tcctgttttg ggagttcgtg c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> R4

<400> 8

gtggtgacct atgggcgaaa g 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> F5

<400> 9

tgttttggga gttcgtgctt tttgg 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> R5

<400> 10

tggtgaccta tgggcgaaag atgc 24

Claims

1.一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对，其特征在于，所述引物对为Me-F和Me-R，其序列如SEQ ID NO：1～2所示。

2.一种检测兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的检测引物对和荧光定量检测试剂，所述试剂盒中Me-F和Me-R的浓度分别为25 pmol/μL。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括DNA提取试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量检测试剂为SYBR GreenPrimix Ex Taq II，所述DNA提取试剂为QIAamp DNA Stool Mini Kit。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green Primix Ex Taq II 10 μL，Me-F和Me-R各0.25 μL，模板DNA 2 μL，dd H₂O 7.5μL，共20 μL。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的荧光定量PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s共运行40个循环。