CN103725793B - Prrsv的多重荧光定量rt-pcr扩增试剂 - Google Patents

Prrsv的多重荧光定量rt-pcr扩增试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测PRRSV多重荧光定量RT‑PCR方法及其应用。检测PRRSV荧光定量RT‑PCR引物和探针，引物包括AM‑PRRSV引物对和TJM‑PRRSV引物对，探针包括AM‑V‑PRRSV‑P探针、AM‑C‑PRRSV‑P探针、TJM‑PRRSV‑P探针；检测PRRSV多重荧光定量RT‑PCR方法，利用引物和探针进行荧光定量RT‑PCR扩增，扩增后收集荧光信号，出现扩增曲线者为阳性，其特征在于，所述RT‑PCR扩增体系包括上述引物和探针。本发明可同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、HP‑PRRSV及高致病性PRRS活疫苗TJM‑F92株，具有特异性强、敏感性高、自动化程度高优点。

Description

PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增试剂
技术领域
本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重荧光定量RT-PCR方法，及其应用于同时对PRRSV美洲型经典毒株、美洲型变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株进行快速检测。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起猪的一种高度接触性传染病，临床上主要表现为妊娠母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪的严重呼吸道疾病。PRRS最早于1987年在美国发生，1991年荷兰首次分离到PRRSV，美国亦于1992年分离到该病毒。此后，该病相继在各主要养猪国家发生，现已呈世界性流行，给世界各国养猪业造成巨大的经济损失。根据病毒基因组的差异，PRRSV可分为欧洲型和美洲型毒株，两种基因型毒株之间基因组差异很大，核苷酸序列同源性仅为60 %左右。1996年郭宝清等首次在国内分离到PRRSV，证实该病在我国存在。2006年国内爆发高致病性猪蓝耳病（HP-PRRS），并证实其病原是以Nsp2蛋白481 aa和533~561 aa发生30个氨基酸不连续缺失为标志的高致病性变异毒株（HP-PRRSV）。2010年我国开始在临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗，以便有效防控HP-PRRS。这些弱毒疫苗毒株包括由JXA1株致弱的JXA1-R株、由HuN4株致弱的HuN4-R株、由TJ株致弱的TJM-F92株等。其中，TJM–F92疫苗株是在HP-PRRS发病猪体内分离的高致病性强毒TJ 株通过噬斑筛选后，在Marc-145细胞上传代至92 代，获得了致弱的疫苗毒TJM–F92株。TJM–F92株Nsp2蛋白除了与其它HP-PRRSV一样在多变区不连续缺失30 aa以外，还出现了第1882~2441 aa共120个氨基酸(360个碱基)的连续缺失。2010年农业部批准临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗以来，广西一直采购、使用TJM–F92株活疫苗，而未采购、使用其他弱毒株活疫苗，以便于正确区分临床发病猪体内的PRRSV野毒株和疫苗株。
当前，国内PRRSV美洲型流行毒株既有经典毒株，也有HP-PRRSV，加上临床使用的弱毒疫苗株，在临床检测中经常发现在同一地区甚至同一养殖场的猪群中同时存在两种或两种以上的病毒株，给该病的诊断带来极大的困难，这就使得建立PRRSV的快速鉴别检测方法显得尤为重要。迄今，国内外建立了一些技术，包括双抗体夹心ELISA、间接免疫荧光抗体试验（IFA）、原位杂交技术（ISH）、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、单重及多重荧光定量RT-PCR等。但是已经建立的技术都无法同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗毒株。因此，建立能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗株的检测方法不仅能弥补现有技术在这一领域的空白，还具有创新性实践意义。
荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对待测模板进行定性、定量分析的方法。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、基因突变及其多态性的研究等多个领域。多重荧光定量PCR是荧光定量PCR的一种特殊形式，是在同一反应体系中加入多对引物和多条探针，同时扩增、检测多个模板的荧光定量PCR技术。
发明内容
本发明的目的是采用多重TaqMan荧光定量RT-PCR技术，针对PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株基因组中的保守序列，建立同时检测PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，提供同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的引物、探针及其方法。本发明特异性强、灵敏度高，操作安全方便，能实现PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株等三种毒株的同时检测，为PRRSV美洲型野毒株、弱毒疫苗株的同时快速鉴别检测及有效防控HP-PRRS提供了新的途径，具有良好的应用前景。
本发明的技术方案为：
一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法, 该方法利用AM-PRRSV引物对、TJM-PRRSV引物对、AM-V-PRRSV-P探针、AM-C-PRRSV-P探针、TJM-PRRSV-P探针对阳性对照样品、检测样品进行荧光RT-PCR扩增，扩增后收集荧光信号，其特征在于，所述的TJM-PRRSV引物对其上游引物核苷酸序列为5'- CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3'，下游引物核苷酸序列为5'- TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3'；所述的TJM-PRRSV-P探针为5'-F- AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC -Q-3'，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。收集得到的检测样品荧光信号与阳性对照样品（标准品）荧光信号标准曲线进行比对，检测样品荧光定量RT-PCR扩增出现类似阳性对照样品（标准品）的扩增曲线者为阳性，未出现扩增曲线者为阴性。
作为本发明的进一步限定，所述的AM-PRRSV引物对的上游引物核苷酸序列为5'- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3'，下游引物核苷酸序列为5'- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3'；所述的AM-V-PRRSV-P探针为5'-F- TAGAACTGTGACAACAACGCTGA -Q-3'； 所述的AM-C-PRRSV-P探针为5'-F- AACTGTGTCTCGACCGGTGAC -Q-3'；其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
作为本发明的进一步限定，所述的F为FAM、TAMRA、JOE中的任一种；所述的Q为BHQ或MGB。
作为本发明的进一步限定，所述RT-PCR扩增反应体系还包括Premix Ex TaqTM试剂、ROX 参比染料、模板、灭菌双蒸水。
作为本发明的进一步限定，当RT-PCR扩增体系为阳性对照样品反应时，所述的模板为p-C-Nsp2质粒、p-V-Nsp2质粒和p-TJM-F92质粒标准品混合液；当RT-PCR扩增体系为检测样品反应时，所述的模板为从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提的总RNA反转录获得的cDNA。
作为本发明的进一步限定，所述p-C-Nsp2质粒为含有美洲型经典毒株VR-2332株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p-V-Nsp2质粒为含有美洲型变异毒株JXA1株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p-TJM-F92质粒为含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的阳性标准质粒。
作为本发明的进一步限定，所述的RT-PCR扩增反应条件为95℃ 2min→95℃ 10s→54℃ 30s，进行40个循环，同时收集荧光信号。
作为本发明的进一步限定，所述的RT-PCR扩增反应体系包括：Premix Ex TaqTM10~12.5ul, 25pmol/µL AM-PRRSV上游引物0.2~0.4ul，25pmol/µL AM-PRRSV下游引物0.2~0.4 ul，25pmol/µL AM-V-PRRSV-P探针0.15~0.25ul，25pmol/µL AM-C-PRRSV-P探针0.2~0.4ul，25pmol/µL TJM-PRRSV上游引物0.8~1.2ul，25pmol/µL TJM-PRRSV下游引物0.8~1.2ul，25pmol/µL TJM-PRRSV-P探针0.5~0.7ul，ROX 参比染料0.4~0.5ul，模板1.0~2.0ul，双蒸水2.0~8.25ul。
作为本发明的进一步限定，所述的RT-PCR扩增反应体系包括：Premix Ex TaqTM12.5ul, 25pmol/µL AM-PRRSV上游引物0.4ul，25pmol/µL AM-PRRSV下游引物0.4 ul，25pmol/µL AM-V-PRRSV-P探针0.25ul，25pmol/µL AM-C-PRRSV-P探针0.4ul，25pmol/µL TJM-PRRSV上游引物1.2ul，25pmol/µL TJM-PRRSV下游引物1.2ul，25pmol/µL TJM-PRRSV-P探针0.7ul，ROX 参比染料0.5ul，模板2.0ul，双蒸水5.45ul。
一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法的应用，检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法用于快速检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗毒株。所述高致病性PRRS活疫苗株为TJM-F92株。高致病性PRRS活疫苗株的判定依据是检测样品出现两条扩增曲线，一条要类似于美洲型变异毒株标准曲线，另一条要类似于高致病性PRRS活疫苗株标准曲线。
本发明的具体原理是，针对PRRSV美洲型经典毒株Nsp2基因、变异毒株Nsp2基因以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因，设计了用于多重荧光定量RT-PCR检测的扩增引物和TaqMan 探针，分别使用FAM、JOE、TAMRA等基团作为探针的发光基团，设计并构建标准阳性质粒、计算出其拷贝数，建立阳性对照样品标准曲线，优化RT-PCR的反应体系，以及其反应步骤，以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测，构建出基于引物和荧光探针的PRRSV多重荧光定量RT-PCR检测方法。本法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点，用于快速检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株，弥补了现有技术在这一领域的空白，具有实用性。试验方法及具体过程如下：
1. 设计引物和探针。
针对PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的Nsp2基因，设计了用于多重荧光定量RT-PCR检测的扩增引物和TaqMan 探针，分别使用FAM、JOE、TAMRA等基团作为探针的发光基团F，以BHQ等基团作为探针的淬灭基团Q，以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测。引物和探针序列如表1所示。
表1 检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR所用引物和探针序列
2.构建阳性质粒标准品。
以重组质粒p-Nsp2-VR2332、p-Nsp2-JXA1（上述质粒由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室保存）以及弱毒活疫苗TJM-F92株的cDNA为模版，以AM-PRRSV-F/R、TJM-PRRSV-F/R特异性引物分别进行PCR扩增得到195bp、108bp、133bp目的片段。用胶回收试剂盒纯化PCR产物后，连接到pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞，涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG培养平板。挑取阳性菌落进行增菌培养后，用质粒抽提试剂盒提取质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定。构建的重组质粒标准品，各命名为 p-C-Nsp2、p-V-Nsp2和p-TJM-F92。用紫外分光光度计测定质粒的光吸收值(OD260 )，计算出摩尔浓度，根据公式换算成拷贝数：每µL样品中检测基因的拷贝数＝浓度（ng/µL）×阿佛加德罗常数×10-9/(660×重组质粒碱基数)。质粒置于-20℃保存，用前稀释。
3. 优化多重荧光定量RT-PCR的反应体系
通过反复试验，优化多重荧光定量RT-PCR的反应体系，确定采用的RT-PCR反应体系为总体积25μL，所需各组分及相应浓度、相应用量见表2。表中作为阳性对照样品的模板表示：p-C-Nsp2、p-V-Nsp2、p-TJM-F92阳性质粒标准品按体积比例1:1:2混合总共2 µL，用灭菌双蒸水补至 25 µL。其中三种阳性质粒标准品浓度如下：p-C-Nsp2 为 5.67×109拷贝/µL，p-V-Nsp2为6.86×109拷贝/µL，p-TJM-F92为3.45×109拷贝/µL，按优化好的比例混合，以双蒸水作10 倍系列稀释成 7 个梯度，p-C-Nsp2为5.67×109～5.67×103拷贝/µL，p-V-Nsp2为6.86×109～6.86×103拷贝/µL，p-TJM-F92 为3.45×109～3.45×103拷贝/µL。作为检测样品的模板为从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提的总RNA反转录获得的cDNA。检测样品cDNA获得过程为：按宝生物工程(大连)有限公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒使用说明从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提总RNA后，应用PCR试剂盒, 在高压灭菌后的PCR反应管内，以抽提的总RNA为模板，按RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒使用说明进行反转录，获得cDNA。反转录（RT）反应程序：①30℃ 10min；②42℃ 30min；③99℃ 5min。所获得的cDNA，置于-20℃保存备用。
表2 检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR反应体系
反应体系组分 用量（μL）
Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time） 12.5
AM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 0.4
AM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 0.4
AM-V-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.25
AM-C-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.4
TJM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 1.2
TJM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 1.2
TJM-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.7
ROX 参比染料 0.5
模板 2
双蒸水 5.45
总体积 25ul
4.多重荧光定量RT-PCR反应条件优化如下：
多重荧光定量RT-PCR扩增条件：95℃ 2min；95℃ 10s, 54℃ 30s,40 个循环，同时收集荧光信号。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明设计了特异性强的PRRSV多重荧光定量RT-PCR扩增引物和探针，建立了一种同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的多重荧光定量RT-PCR检测方法，弥补了现有技术在这一领域的空白，引物和探针检测灵敏度可达10拷贝/ul，为检测PRRSV美洲型野毒株、弱毒活疫苗株提供了一种特异、敏感、快速、高效的方法。
（2）本发明的多重荧光定量RT-PCR检测方法扩增反应快速、高效、简便，整个扩增不到1个小时即可完成，无需凝胶电泳，操作安全方便，提高了工作效率，降低了检测成本。
（3）本发明以三种质粒标准品混合液为模板，进行多重TaqMan荧光定量PCR，p-V-Nsp2、p-C-Nsp2、p-TJM-F92的灵敏度测试结果表明，其检出下限均为10拷贝/µL，普通 PCR 的检出下限为103个拷贝/µL，表明多重TaqMan荧光定量PCR比普通 PCR 敏感 100倍。
（4）本发明检测方法特异性强，相应的引物和探针只产生相应特异性对数扩增曲线，未出现与其它病毒的交叉反应现象。
附图说明
图1是本发明检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增曲线图。
1：含有美洲型变异毒株JXA1株Nsp2基因的p-V-Nsp2质粒阳性对照样品（标准品）荧光定量RT-PCR扩增曲线；2：含有美洲型经典毒株VR-2332株Nsp2基因的p-C-Nsp2质粒阳性对照样品（标准品）荧光定量RT-PCR扩增曲线；3：含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的p-TJM-F92质粒阳性对照样品（标准品）荧光定量RT-PCR扩增曲线；1’：疑似PRRSV感染的组织样品cDNA为模板；2’： 疑似PRRSV感染的组织样品cDNA为模板；3’-1、3’-2：疑似PRRSV感染的组织样品cDNA为模板（荧光定量RT-PCR扩增曲线共有两条，3’-1为类似于美洲型变异毒株标准曲线，3’-2为类似于高致病性PRRS活疫苗株标准曲线）；4：猪口蹄疫病毒（FMDV）cDNA为模板；5：猪瘟病毒（CSFV）cDNA为模板；6：猪伪狂犬病病毒（PRV）DNA为模板；7：猪细小病毒（PPV）cDNA为模板；8：猪圆环病毒2型（PCV2）DNA为模板；9：灭菌双蒸水为模板。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围。以下实施例中用到实验试剂如无特殊说明，均可通过商业手段获得。实施例中用到的相关实验材料、试剂、仪器如下：
（1）实验材料
PRRSV美洲型经典毒株（VR-2332株）、美洲型变异毒株（JXA1株）、TJM–F92疫苗株、猪瘟病毒(CSFV，疫苗毒C株)、 猪伪狂犬病病毒(PRV，疫苗毒Bartha-K61株)、猪细小病毒（PPV，疫苗毒N株）、猪口蹄疫病毒（FMDV，疫苗毒O/MYA98/BY/2010株）、猪圆环病毒2型(PCV2，疫苗毒LG株)由本实验室保存。含有PRRSV美洲型毒株Nsp2基因的重组质粒p-Nsp2-VR2332和p-Nsp2-JXA1，含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的p-TJM-F92重组质粒由本实验室保存。
（2）试剂与仪器
Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒购自宝生物(大连)工程有限公司。ABI Step one plus型实时定量PCR仪为Applied Biosystems 公司产品。
实施例 1
一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，该RT-PCR方法中的扩增反应体系包括以下引物、探针及相关试剂，详见表3。引物及探针为本实验室自行设计，其他试剂均可从市场上购买。实施操作过程中，设置多个浓度梯度的阳性对照样品（标准品）进行RT-PCR扩增反应获得标准曲线（对照曲线），检测样品的RT-PCR扩增反应与阳性对照样品RT-PCR扩增反应在不同的反应孔中同时进行RT-PCR。
表3 检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR反应体系
反应体系组分 用量（μL）
Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time） 12.5
AM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 0.4
AM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 0.4
AM-V-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.25
AM-C-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.4
TJM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 1.2
TJM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 1.2
TJM-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.7
ROX 参比染料 0.5
模板 2
双蒸水 5.45
总体积 25ul
本实施例中用到的AM-PRRSV上游引物其序列为5'- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3'，AM-PRRSV下游引物其序列为5'- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3'，AM-V-PRRSV-P探针其序列为FAM-TAGAACTGTGACAACAACGCTGA-BHQ1，AM-C-PRRSV-P探针其序列为JOE-AACTGTGTCTCGACCGGTGAC-BHQ1，TJM-PRRSV上游引物核苷酸序列为5'- CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3'，TJM-PRRSV下游引物核苷酸序列为5'- TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3'，TJM-PRRSV-P探针其序列为TAMRA-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC-BHQ2，阳性对照样品RT-PCR扩增反应体系模板为p-C-Nsp2、p-V-Nsp2、p-TJM-F92阳性质粒标准品按体积比例1:1:2混合，检测样品RT-PCR扩增反应体系模板为疑似感染PRRSV野毒株或是PRRS活疫苗毒株的组织样品cDNA。此外，为了进一步排除其他疑似病毒的可能性，本实施例还设置了多组以其他病毒cDNA或DNA为模板的对照RT-PCR扩增反应。
按照以上描述的RT-PCR扩增反应体系进行PCR，反应扩增条件：95℃ 2min；95℃ 10s, 54℃ 30s,40 个循环，同时收集荧光信号。采用荧光定量PCR仪自带的荧光信号分析软件分析样品，其结果如图1所示，将检测样品曲线与阳性对照样品标准曲线进行比对，结果判定：本样品同时检测到了美洲型经典毒株（1’曲线）、美洲型变异毒株（2’曲线）、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株（3’-1和3’-2曲线）。高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的判定依据为出现两条曲线，一条要类似于美洲型变异毒株标准曲线，另一条要类似于高致病性PRRS活疫苗株标准曲线，即如图1，出现3’-1类似美洲型变异毒株曲线和类似高致病性PRRS活疫苗株3’-2曲线。本方法可同时检测PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗株，三者能很好区分开，探针和引物对三种毒株特异性强、敏感性高，本方法具有自动化程度高、快速简便等优点。
实施例 2
一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，该RT-PCR方法中的扩增反应体系包括以下引物、探针及相关试剂同实施例中的表4。实施操作过程中，设置多个浓度梯度的阳性对照样品（标准品）进行RT-PCR扩增反应获得标准曲线（对照曲线），检测样品的RT-PCR扩增反应与阳性对照样品RT-PCR扩增反应在不同的反应孔中同时进行RT-PCR。
表4 本实施例检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR反应体系
反应体系组分 用量（μL）
Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time） 12.5
AM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 0.2
AM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 0.2
AM-V-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.15
AM-C-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.2
TJM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 0.8
TJM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 0.8
TJM-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.5
ROX 参比染料 0.4
模板 1.0
双蒸水 8.25
总体积 25ul
本实施例RT-PCR扩增反应体系中具体用到的AM-PRRSV上游引物其序列为5'- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3'，AM-PRRSV下游引物其序列为5'- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3'，AM-V-PRRSV-P探针其序列为JOE-TAGAACTGTGACAACAACGCTGA-BHQ1，AM-C-PRRSV-P探针其序列为FAM-AACTGTGTCTCGACCGGTGAC-BHQ1，TJM-PRRSV上游引物核苷酸序列为5'- CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3'，TJM-PRRSV下游引物核苷酸序列为5'- TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3'，TJM-PRRSV-P探针其序列为TAMRA-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC-BHQ2，阳性对照样品RT-PCR扩增反应体系模板为p-C-Nsp2、p-V-Nsp2、p-TJM-F92阳性质粒标准品按体积比例1:1:2混合，检测样品RT-PCR扩增反应体系模板为疑似感染PRRSV的组织样品cDNA。按照以上RT-PCR扩增反应体系进行PCR，反应扩增条件：95℃ 2min；95℃ 10s, 54℃ 30s,40 个循环，同时收集荧光信号。信号结果分析表明，本实施例样品检测到了美洲型经典毒株。本方法具有特异性强、敏感性高、自动化程度高、快速简便等优点。
实施例 3
一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，该RT-PCR方法中的扩增反应体系包括以下引物、探针及相关试剂同实施例中的表5。实施操作过程中，设置多个浓度梯度的阳性对照样品（标准品）进行RT-PCR扩增反应获得标准曲线（对照曲线），检测样品的RT-PCR扩增反应与阳性对照样品RT-PCR扩增反应在不同的反应孔中同时进行RT-PCR。
表5 本实施例检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR反应体系
反应体系组分 用量（μL）
Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time） 12
AM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 0.3
AM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 0.3
AM-V-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.2
AM-C-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.2
TJM-PRRSV上游引物（25pmol/µL） 1.0
TJM-PRRSV下游引物（25pmol/µL） 1.0
TJM-PRRSV-P探针（25pmol/µL） 0.5
ROX 参比染料 0.5
模板 1.0
双蒸水 7.5
总体积 25ul
本实施例RT-PCR扩增反应体系中具体用到的AM-PRRSV上游引物其序列为5'- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3'，AM-PRRSV下游引物其序列为5'- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3'，AM-V-PRRSV-P探针其序列为TET-TAGAACTGTGACAACAACGCTGA-BHQ1，AM-C-PRRSV-P探针其序列为TAMRA-AACTGTGTCTCGACCGGTGAC-BHQ2，TJM-PRRSV上游引物核苷酸序列为5'- CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3'，TJM-PRRSV下游引物核苷酸序列为5'- TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3'，TJM-PRRSV-P探针其序列为JOE-CCTTGCTATGACCAGTTGTGTTCC-BHQ1，阳性对照样品RT-PCR扩增反应体系模板为p-C-Nsp2、p-V-Nsp2、p-TJM-F92阳性质粒标准品按体积比例1:1:2混合，检测样品RT-PCR扩增反应体系模板为疑似感染PRRSV野毒株或是PRRS活疫苗毒株的组织样品cDNA。按照以上RT-PCR扩增反应体系进行PCR，反应扩增条件：95℃ 2min；95℃ 10s, 54℃ 30s,40 个循环，同时收集荧光信号。信号结果分析表明，本实施例样品检测到了美洲型变异毒株。本方法具有特异性强、敏感性高、自动化程度高、快速简便等优点。
实施例 4
一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，该RT-PCR方法中的扩增反应体系包括的引物、探针及相关试剂同实施例1中的表3。本实施例RT-PCR扩增反应体系中具体用到的AM-PRRSV上游引物其序列为5'- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3'，AM-PRRSV下游引物其序列为5'- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3'，AM-V-PRRSV-P探针其序列为FAM-TAGAACTGTGACAACAACGCTGA-MGB，AM-C-PRRSV-P探针其序列为JOE-AACTGTGTCTCGACCGGTGAC-MGB，TJM-PRRSV上游引物核苷酸序列为5'- CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3'，TJM-PRRSV下游引物核苷酸序列为5'- TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3'，TJM-PRRSV-P探针其序列为TAMRA-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC-BHQ2，阳性对照样品RT-PCR扩增反应体系模板为p-C-Nsp2、p-V-Nsp2、p-TJM-F92阳性质粒标准品按体积比例1:1:2混合，检测样品RT-PCR扩增反应体系模板为疑似感染PRRSV野毒株或是PRRS活疫苗毒株的组织样品cDNA。按照以上RT-PCR扩增反应体系进行PCR，反应扩增条件：95℃ 2min；95℃ 10s, 54℃ 30s,40 个循环，同时收集荧光信号。信号结果分析表明，本实施例样品检测到了高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株。本方法具有特异性强、敏感性高、自动化程度高、快速简便等优点。
应用实施例
利用实施例1~4任一例中的具体检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，对各地规模猪场和养殖户送检的168份疑似PRRS临床样品进行检测，结果PRRSV阳性137份，检出率为81.55%，其中，美洲型经典毒株22份、美洲型变异毒株106份、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株9份；检测到三种毒株混合感染3份、美洲型经典毒株和变异毒株混合感染5份、美洲型经典毒株和PRRS活疫苗TJM-F92株混合感染4份、美洲型变异毒株和PRRS活疫苗TJM-F92株混合感染8份。同时，应用普通RT-PCR方法对上述168份疑似PRRS临床样品进行检测，结果PRRSV阳性131份，检出率为77.98%，与本研究所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测结果的符合率为95.62%，多重TaqMan荧光定量RT-PCR的检出率高于普通 RT-PCR。
核苷酸序列表
<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
<120> 检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法及其应用
<160> 7
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<223> 检测PRRSV的AM-PRRSV上游引物核苷酸序列
<400> 1
GAGTGGGTCG GCTCCAGTTC 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<223> 检测PRRSV的AM-PRRSV下游引物核苷酸序列
<400> 2
GCCTCATATT CCGTCTGTGA 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<223> 检测PRRSV的TJM-PRRSV上游引物核苷酸序列
<400> 3
CAACCCTGCA CCTGTGTCAT 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<223> 检测PRRSV的TJM-PRRSV下游引物核苷酸序列
<400> 4
TTCTCCCTTG GAGGGTGCC 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<223> 检测PRRSV的AM-V-PRRSV-P探针核苷酸序列
<400> 5
TAGAACTGTG ACAACAACGC TGA 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<223> 检测PRRSV的AM-C-PRRSV-P探针核苷酸序列
<400> 6
AACTGTGTCT CGACCGGTGA C 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<223> 检测PRRSV的TJM-PRRSV-P探针核苷酸序列
<400> 7
AGCTCCCTGG GTTCAGTGGC C 21

Claims (6)

1.一种PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增试剂，其特征在于，该试剂包括AM-PRRSV引物对、TJM-PRRSV引物对、AM-V-PRRSV-P探针、AM-C-PRRSV-P探针、TJM-PRRSV-P探针，所述的TJM-PRRSV引物对其上游引物核苷酸序列为5'- CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3'，下游引物核苷酸序列为5'- TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3'；所述的TJM-PRRSV-P探针为5'-F- AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC -Q-3'，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团；
所述的AM-PRRSV引物对的上游引物核苷酸序列为5'- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3'，下游引物核苷酸序列为5'- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3'；
所述的AM-V-PRRSV-P探针为5'-F- TAGAACTGTGACAACAACGCTGA -Q-3'；
所述的AM-C-PRRSV-P探针为5'-F- AACTGTGTCTCGACCGGTGAC -Q-3'；
其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
2.根据权利要求1所述的PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增试剂，其特征在于，所述的F为FAM、JOE中的任一种；所述的Q为BHQ或MGB。
3.根据权利要求1所述的PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增试剂，其特征在于，RT-PCR扩增试剂还包括Premix Ex TaqTM试剂、ROX 参比染料、模板、灭菌双蒸水。
4.根据权利要求3所述的PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增试剂，其特征在于，当RT-PCR扩增体系为阳性对照样品反应时，所述的模板为p-C-Nsp2质粒、p-V-Nsp2质粒和p-TJM-F92质粒标准品混合液；当RT-PCR扩增体系为检测样品反应时，所述的模板为从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提的总RNA反转录获得的cDNA；所述p-C-Nsp2质粒为含有美洲型经典毒株VR-2332株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p-V-Nsp2质粒为含有美洲型变异毒株JXA1株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p-TJM-F92质粒为含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的阳性标准质粒。
5.根据权利要求3所述的PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增试剂，其特征在于，所述的RT-PCR扩增试剂包括：Premix Ex TaqTM10~12.5µL, 25pmol/µL AM-PRRSV上游引物0.2~0.4µL，25pmol/µL AM-PRRSV下游引物0.2~0.4µL，25pmol/µL AM-V-PRRSV-P探针0.15~0.25µL，25pmol/µL AM-C-PRRSV-P探针0.2~0.4µL，25pmol/µL TJM-PRRSV上游引物0.8~1.2µL，25pmol/µL TJM-PRRSV下游引物0.8~1.2µL，25pmol/µL TJM-PRRSV-P探针0.5~0.7µL，ROX 参比染料0.4~0.5µL，模板1.0~2.0µL，双蒸水2.0~8.25µL。
6.根据权利5所述的PRRSV的多重荧光定量RT-PCR扩增试剂，其特征在于，所述的RT-PCR扩增反应体系包括：Premix Ex TaqTM12.5µL, 25pmol/µL AM-PRRSV上游引物0.4µL，25pmol/µL AM-PRRSV下游引物0.4µL，25pmol/µL AM-V-PRRSV-P探针0.25µL，25pmol/µL AM-C-PRRSV-P探针0.4µL，25pmol/µL TJM-PRRSV上游引物1.2µL，25pmol/µL TJM-PRRSV下游引物1.2µL，25pmol/µL TJM-PRRSV-P探针0.7µL，ROX 参比染料0.5µL，模板2.0µL，双蒸水5.45µL。
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