CN104762416B - 鉴定或辅助鉴定h3亚型和h4亚型禽流感病毒的成套试剂 - Google Patents

鉴定或辅助鉴定h3亚型和h4亚型禽流感病毒的成套试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定H3亚型和H4亚型禽流感病毒的成套试剂。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂，由名称为H3‑T的成套DNA和名称为H4‑T的成套DNA组成；H3‑T由名称为H3的PCR引物对和名称为H3‑P的探针组成；H3由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；H3‑P为SEQ ID No.3所示的单链DNA；H4‑T由名称为H4的PCR引物对和名称为H4‑P的探针组成；H4由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成；H4‑P为SEQ ID No.6所示的单链DNA。

Description

鉴定或辅助鉴定H3亚型和H4亚型禽流感病毒的成套试剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定H3亚型和H4亚型禽流感病毒的成套试剂。
背景技术
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是单股负链、分节段的RNA病毒，属于正黏病毒科流感病毒属。根据AIV表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的抗原性差异，AIV可进一步分为不同的亚型，目前已鉴别出17种HA亚型(H1～H17)和10种NA亚型(N1～N10)。H3和H4亚型AIV属于低致病性AIV，在家禽中混合感染较常见。同时，研究表明当同一宿主细胞同时感染多种亚型AIV，不同毒株的8个基因片段会发生基因重排形成新的毒株，对人类公共卫生安全存在潜在威胁，因此，应加强对H3和H4亚型AIV混合感染的监测。
目前，针对AIV的诊断主要通过病原分离、传统血清学方法鉴定及普通RT-PCR的检测，该方法耗时费力、敏感性较低且对混合感染的AIV具有局限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂，由名称为H3-T的成套DNA和名称为H4-T的成套DNA组成；
所述H3-T由名称为H3的PCR引物对和名称为H3-P的探针组成；所述H3由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA(H3-F)和SEQ ID No.2所示的单链DNA(H3-R)组成；所述H3-P为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述H4-T由名称为H4的PCR引物对和名称为H4-P的探针组成；所述H4由序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA(H4-F)和SEQ ID No.5所示的单链DNA(H4-R)组成；所述H4-P为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的成套DNA。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的成套DNA为所述H4-T。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套引物。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套引物，由所述H3和所述H4组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对。
本发明所提供的PCR引物对，为鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的引物对；所述鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的引物对为所述H4。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的系统(产品和/或设备)，为下述H-K中的任一种：
H、含有所述成套试剂的系统；
I、含有所述H4-T的系统；
J、含有所述成套引物的系统；
K、含有所述PCR引物对H4的系统。
上述系统中，所述探针可标记有荧光染料。所述标记有荧光染料具体可为FAM和/或Eclipse和/或ROX。
在本发明的一个实施例中，所述H3-P的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；所述H4-P的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。
上述系统可包括荧光PCR所需的试剂和仪器。具体来说，所述系统可包括所述成套试剂、所述H3-T、所述H4-T、所述成套引物、所述PCR引物对H3或所述PCR引物对H4以及荧光PCR所需要的其它试剂和仪器。所述荧光PCR所需要的其它试剂可为DNA聚合酶。
上述系统还可仅包括所述成套试剂、所述成套DNA H3-T、所述成套DNA H4-T、所述成套引物、所述PCR引物对H3或所述PCR引物对H4。
所述成套试剂、所述成套DNA H3-T、所述成套DNA H4-T、所述成套引物、所述PCR引物对H3或所述PCR引物对H4以及荧光PCR所需要的其它试剂均可独立包装。所述成套试剂、所述H3-T、所述H4-T、所述成套引物、所述PCR引物对H3和所述PCR引物对H4中的各引物对和/或各引物对的两条单链DNA和/或探针均可独立包装。
荧光PCR所需要的其它试剂可包括Premix Ex Taq。荧光PCR所需要的其它仪器可包括PCR仪。
上述系统中，所述H还包括记载有下述内容的载体：在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或cDNA)为模板，用所述成套试剂进行荧光PCR；FAM通道的结果呈阴性(即扩增曲线为直线)、ROX通道的结果呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)，所述待测样品含有H4亚型禽流感病毒；FAM通道的结果呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)、ROX通道的结果呈阴性(即扩增曲线为直线)，所述待测样品含有H3亚型禽流感病毒；FAM通道和ROX通道的结果均呈阴性(即扩增曲线为直线)，所述待测样品不含H3或H4亚型禽流感病毒。
上述系统中，每20μL PCR反应体系可含有：所述PCR引物对H3(H3的每条引物在反应体系中的浓度均为0.6μM)，所述探针H3-P(H3-P在反应体系中的浓度为0.6μM)，所述PCR引物对H4(H4的每条引物在反应体系中的浓度均为0.4μM)，所述探针H4-P(H4-P在反应体系中的浓度为0.4μM)，Premix Ex Taq 10μL，待测病毒核酸，无菌蒸馏水补足20μL。
上述系统中，所述I还包括记载有下述内容的载体：在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或cDNA)为模板，用所述H4-T进行荧光PCR；ROX通道的结果呈阳性(即扩增曲线为S型曲线)，所述待测样品含有H4亚型禽流感病毒；ROX通道的结果呈阴性(即扩增曲线为直线)，所述待测样品不含有H4亚型禽流感病毒。
上述系统中，每20μL PCR反应体系可含有：所述PCR引物对H4(H4的每条引物在反应体系中的浓度均为0.4μM)，所述探针H4-P(H4-P在反应体系中的浓度为0.4μM)，PremixEx Taq 10μL，待测病毒核酸，无菌蒸馏水补足20μL。
上述系统中，所述FAM通道可为在530nm激发光下的FAM通道；所述ROX通道可为在610nm激发光下的ROX通道。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一方法：
1)所述成套试剂的制备方法，包括将各引物对的所述两条单链DNA和/或各引物对和/或各探针分别单独包装得到所述成套试剂的步骤；
2)所述H4-T的制备方法，包括将所述H4的所述两条单链DNA和/或所述H4-P分别单独包装得到所述成套DNA的步骤；
3)所述成套引物的制备方法，包括将各引物对的所述两条单链DNA和/或各引物对分别单独包装得到所述成套引物的步骤；
4)所述H4的制备方法，包括将所述H4的所述两条单链DNA分别单独包装得到所述PCR引物对的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
1)所述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的系统中的应用；
2)所述H4-T在制备鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的系统中的应用；
3)所述成套引物在制备鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的系统中的应用；
4)所述H4在制备鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的系统中的应用。
本发明中，所述成套试剂的所述成套DNA H3-T和所述成套DNA H4-T一起使用时，所述H3-F、所述H3-R、所述H3-P、所述H4-F、所述H4-R和所述H4-P的摩尔数可为3:3:3:2:2:2。所述成套DNA H3-T单独使用时，所述成套DNA H3-T的所述H3-F、所述H3-R和所述H3-P的摩尔数可为1:1:1。所述成套DNA H4-T单独使用时，所述成套DNA H4-T的所述H4-F、所述H4-R和所述H4-P的摩尔数可为1:1:1。所述PCR引物对H3的所述H3-F和所述H3-R的摩尔数可为1:1。所述PCR引物对H4的所述H4-F和所述H4-R的摩尔数可为1:1。
本发明中的Premix Ex Taq可为大连宝生物工程有限公司产品。
本发明中的PCR反应均可在Roche公司的LightCycler 2.0PCR仪中进行。PCR反应的条件均可为：94℃预变性30s；94℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环。
实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂具有较高的灵敏度、特异性和重复性，且受不同模板浓度间差异的影响小：本发明的成套试剂能检测出103拷贝/20μL的H3亚型禽流感病毒；本发明的成套试剂能检测出100拷贝/20μL的H4亚型禽流感病毒；本发明的成套试剂可特异鉴定H3亚型禽流感病毒或H4亚型禽流感病毒，并且重复性好，在批内重复性实验中FAM通道(在530nm激发光下)Ct值变异系数为0.29％，ROX通道(在610nm激发光下)Ct值变异系数为0.24％。在批间重复性实验中，FAM通道和ROX通道的Ct值变异系数分别为0.51％和1.2％；本发明的成套试剂鉴定H3亚型禽流感病毒或H4亚型禽流感病毒时，不同模板间的差异对结果的干扰小。实验证明，利用本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂鉴定H3亚型禽流感病毒或H4亚型禽流感病毒，反应结束时即可根据扩增曲线判定待测样品是否含有H3亚型禽流感病毒或H4亚型禽流感病毒，具有特异性强、假阳性低、灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、操作简单、交叉污染和污染环境的机会少(不需要EB染色)等优点，而且整个反应可在30min左右完成，省时省力，并且还可同时检测多个毒株(如H3亚型和H4亚型禽流感病毒)。实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂可用来鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒。
附图说明
图1为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的特异性实验FAM通道结果。其中，1为H1亚型禽流感病毒，2为H3亚型禽流感病毒，3为H4亚型禽流感病毒，4为H5N2亚型禽流感病毒，5为H6亚型禽流感病毒，6为H7N2亚型禽流感病毒，7为H9亚型禽流感病毒，8为新城疫病毒(NDV)F48E9，9为传染性支气管炎病毒(IBV)H52，10为传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株，11为鸡毒支原体(MG)S6，12为禽呼肠孤病毒(ARV)S1733，13为阴性对照。
图2为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的特异性实验ROX通道结果。其中，1为H1亚型禽流感病毒，2为H3亚型禽流感病毒，3为H4亚型禽流感病毒，4为H5N2亚型禽流感病毒，5为H6亚型禽流感病毒，6为H7N2亚型禽流感病毒，7为H9亚型禽流感病毒，8为新城疫病毒(NDV)F48E9，9为传染性支气管炎病毒(IBV)H52，10为传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株，11为鸡毒支原体(MG)S6，12为禽呼肠孤病毒(ARV)S1733，13为阴性对照。
图3为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的敏感性实验FAM通道结果。其中，1为109拷贝/20μL的T-H3溶液，2为108拷贝/20μL的T-H3溶液，3为107拷贝/20μL的T-H3溶液，4为106拷贝/20μL的T-H3溶液，5为105拷贝/20μL的T-H3溶液，6为104拷贝/20μL的T-H3溶液，7为103拷贝/20μL的T-H3溶液，8为阴性对照。
图4为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的敏感性实验ROX通道结果。其中，1为109拷贝/20μL的T-H4溶液，2为108拷贝/20μL的T-H4溶液，3为107拷贝/20μL的T-H4溶液，4为106拷贝/20μL的T-H4溶液，5为105拷贝/20μL的T-H4溶液，6为104拷贝/20μL的T-H4溶液，7为103拷贝/20μL的T-H4溶液，8为阴性对照。
图5为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的重复性实验FAM通道结果。其中，1-3为三个平行实验，4为为阴性对照。
图6为本发明的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的重复性实验ROX通道结果。其中，1-3为三个平行实验，4为为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的H1亚型禽流感病毒(利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型，病毒学报，2013，29(2):154-159)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H3亚型禽流感病毒(Visual detection of H3 subtype avianinfluenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermalamplification assay，Virology Journal,2011,5；8:337)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H4亚型禽流感病毒(H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序列测定和遗传进化分析，畜牧兽医学报，2006,37(12),1334-1339)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H6亚型禽流感病毒(H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立，畜牧与兽医，2012,44(11),12-16)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H9亚型禽流感病毒(多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H5亚型禽流感病毒(H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立，南方农业学报，2013,02:323-327)的RNA由美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室提供，公众得到美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室同意后可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的H7亚型禽流感病毒(H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立，中国兽医科技，2005,35(6),437-440)的RNA由美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室提供，公众得到美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室同意后可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的新城疫病毒(NDV)F48E9(禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立，生物技术通讯，2008,19(3)410-413)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株(应用多重反转录聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研究，中国预防兽医学报，2000,22(2),126-130)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的鸡毒支原体(MG)S6(用SDS-PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白，中国兽医科技，2003,33(2),41-43)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的禽呼肠孤病毒(ARV)S1733(禽呼肠孤病毒广西分离株σ3基因的克隆和表达，中国预防兽医学报，2005,27(3)，167-170)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的DNA/RNA抽提试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品。
下述实施例中的PMD18-T为大连宝生物工程有限公司。
下述实施例中的Premix Ex Taq为大连宝生物工程有限公司。
实施例1、鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的制备
鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂，由名称为H3-T的成套DNA和名称为H4-T的成套DNA组成；所述H3-T由名称为H3的PCR引物对和名称为H3-P的探针组成；所述H3由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA(H3-F)和SEQ ID No.2所示的单链DNA(H3-R)组成；所述H3-P为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；所述H4-T由名称为H4的PCR引物对和名称为H4-P的探针组成；所述H4由序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA(H4-F)和SEQID No.5所示的单链DNA(H4-R)组成；所述H4-P为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA。
所述H3-P的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse，根据其在FAM通道(在530nm激发光下)的荧光信号，鉴定H3亚型禽流感病毒；所述H4-P的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse，根据其在ROX通道(在610nm激发光下)的荧光信号，鉴定H4亚型禽流感病毒。
实施例2、实施例1的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的特异性实验
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
实验中用到的病毒为H1、H3、H4、H6和H9亚型禽流感病毒，H5和H7亚型禽流感病毒，新城疫病毒(NDV)F48E9、传染性支气管炎病毒(IBV)H52、传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株、鸡毒支原体(MG)S6和禽呼肠孤病毒(ARV)S1733。利用实施例1的成套试剂对病毒的核酸进行双重荧光PCR的具体操作步骤如下：
1)模板的制备
按照DNA/RNA抽提试剂盒的说明书分别抽提并得到下述病毒的RNA：H1、H3、H4、H6和H9亚型禽流感病毒，新城疫病毒(NDV)F48E9、传染性支气管炎病毒(IBV)H52和禽呼肠孤病毒(ARV)S1733，将上述病毒的RNA和H5和H7亚型禽流感病毒的RNA进行反转录，分别得到H1亚型AIV cDNA、H3亚型AIV cDNA、H4亚型AIV cDNA、H6亚型AIV cDNA、H9亚型AIV cDNA、NDV cDNA、IBV cDNA、ARV cDNA、H5N2亚型AIV cDNA和H7N2亚型AIV cDNA。
按照DNA/RNA抽提试剂盒的说明书分别抽提传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株和鸡毒支原体(MG)S6的DNA，得到ILTV DNA和MG DNA。
2)双重荧光PCR
分别以上述步骤1)中各个病毒的cDNA和DNA为模板，以无菌超纯水为阴性对照，利用实施例1中的成套试剂进行双重荧光PCR。
每个双重荧光PCR的20μL反应体系均为：实施例1的PCR引物对H3(H3的每条引物在该反应体系中的浓度均为0.6μM)，实施例1的探针H3-P(H3-P在该反应体系中的浓度为0.6μM)，实施例1的PCR引物对H4(H4的每条引物在该反应体系中的浓度均为0.4μM)，实施例1的探针H4-P(H4-P在反应体系中的浓度为0.4μM)，Premix Ex Taq 10μL，步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水(每个反应体系中一种步骤1)的cDNA或DNA或无菌蒸馏水，无菌蒸馏水作为阴性对照)1μL，无菌蒸馏水补足20μL。
将上述反应体系放入Roche公司的LightCycler 2.0PCR仪中，设置如下条件进行反应：94℃预变性30s；94℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环。反应结束后得到不同病毒的扩增曲线(图1和图2)。
FAM通道(在530nm激发光下，图1)中，H3亚型AIV(图1中2)的扩增曲线为S型曲线(即结果呈阳性)；H1亚型禽流感病毒(图1中1)、H4亚型禽流感病毒(图1中3)、H5N2亚型禽流感病毒(图1中4)、H6亚型禽流感病毒(图1中5)、H7N2亚型禽流感病毒(图1中6)、H9亚型禽流感病毒(图1中7)、新城疫病毒(NDV)F48E9(图1中8)、传染性支气管炎病毒(IBV)H52(图1中9)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株(图1中10)、鸡毒支原体(MG)S6(图1中11)、禽呼肠孤病毒(ARV)S1733(图1中12)和阴性对照(图1中13)的扩增曲线均为直线(即结果呈阴性)。结果表明，利用实施例1的成套试剂得到的H3亚型禽流感病毒和非H3亚型禽流感病毒的扩增曲线在FAM通道(在530nm激发光下)中有明显的不同，表明实施例1的成套试剂可用来鉴定H3亚型禽流感病毒，并且该成套试剂中的引物具有较高的特异性。
ROX通道(在610nm激发光下，图2)中，H4亚型AIV(图2中3)的扩增曲线为S型曲线(即结果呈阳性)；H1亚型禽流感病毒(图2中1)、H3亚型禽流感病毒(图2中2)、H5N2亚型禽流感病毒(图2中4)、H6亚型禽流感病毒(图2中5)、H7N2亚型禽流感病毒(图2中6)、H9亚型禽流感病毒(图2中7)、新城疫病毒(NDV)F48E9(图2中8)、传染性支气管炎病毒(IBV)H52(图2中9)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株(图2中10)、鸡毒支原体(MG)S6(图2中11)、禽呼肠孤病毒(ARV)S1733(图2中12)和阴性对照(图2中13)的扩增曲线均为直线(即结果呈阴性)。结果表明，利用实施例1的成套试剂得到的H4亚型禽流感病毒和非H4亚型禽流感病毒的扩增曲线在ROX通道(在610nm激发光下)中有明显的不同，表明实施例1的成套试剂可用来鉴定H4亚型禽流感病毒，并且该成套试剂中的引物具有较高的特异性。
根据上述结果可得知，利用实施例1的成套试剂得到的病毒的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线为S型曲线(即结果呈阳性)，表明该病毒为H3亚型禽流感病毒；利用实施例1的成套试剂得到的病毒的ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线为S型曲线(即结果呈阳性)，表明该病毒为H4亚型禽流感病毒。
实施例3、实施例1的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的敏感性实验
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
以实施例2步骤1)的H3亚型AIV cDNA为模板，用文献(Hoffmann E,Stech J,GuanY,et al.Universal primer set for the full-length amplification of allinfluenza A viruses[J].Arch Virol,2001,146:2275–2289)中的HA基因引物进行PCR扩增，将得到的序列正确的DNA片段连接到PMD18-T载体上，得到重组载体，将该重组载体命名为T-H3。参照文献(Sambrook J,Fritsh E T,Maniatis T.Molecular Cloning:alaboratory manuel[M].New York:Cold Spring Harbor.Cold Spring HarborLaboratory Press,1989.)中的Sambrook方法测定核酸的浓度与纯度，计算T-H3的拷贝数。用无菌蒸馏水调整T-H3的浓度，得到浓度分别为109拷贝/μL、108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL和102拷贝/μL的T-H3溶液。
以实施例2步骤1)的H4亚型AIV cDNA为模板，用文献(Hoffmann E,Stech J,GuanY,et al.Universal primer set for the full-length amplification of allinfluenza A viruses[J].Arch Virol,2001,146:2275–2289)中的HA基因引物进行PCR扩增，将得到的序列正确的DNA片段连接到PMD18-T载体上，得到重组载体，将该重组载体命名为T-H4。参照文献(Sambrook J,Fritsh E T,Maniatis T.Molecular Cloning:alaboratory manuel[M].New York:Cold Spring Harbor.Cold Spring HarborLaboratory Press,1989.)中的Sambrook方法测定核酸的浓度与纯度，计算T-H4的拷贝数。用无菌蒸馏水调整T-H4的浓度，得到浓度分别为109拷贝/μL、108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL和103拷贝/μL的T-H4溶液。
按照实施例2步骤2)中的双重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为上述浓度分别为109拷贝/μL、108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL的T-H3溶液和无菌蒸馏水(阴性对照)，其他步骤均不变，分别得到109拷贝/20μL、108拷贝/20μL、107拷贝/20μL、106拷贝/20μL、105拷贝/20μL、104拷贝/20μL和103拷贝/20μL的T-H3的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线和阴性对照的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线(图3)。
FAM通道(在530nm激发光下)的结果显示，109拷贝/20μL(图3中1)、108拷贝/20μL(图3中2)、107拷贝/20μL(图3中3)、106拷贝/20μL(图3中4)、105拷贝/20μL(图3中5)、104拷贝/20μL(图3中6)和103拷贝/20μL(图3中7)的T-H6的扩增曲线均为S型曲线(即结果呈阳性)；阴性对照(图3中8)的扩增曲线为直线(即结果呈阴性)。结果表明，实施例1的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂最低能检测到浓度为103拷贝/20μL的H3亚型禽流感病毒。
按照实施例2步骤2)中的双重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为上述浓度分别为109拷贝/μL、108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL和103拷贝/μL的T-H4溶液和无菌蒸馏水(阴性对照)，其他步骤均不变，分别得到109拷贝/20μL、108拷贝/20μL、107拷贝/20μL、106拷贝/20μL、105拷贝/20μL、104拷贝/20μL和103拷贝/20μL的T-H4的ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线和阴性对照的ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线(图4)。
ROX通道(在610nm激发光下)的结果显示，109拷贝/20μL(图4中1)、108拷贝/20μL(图4中2)、107拷贝/20μL(图4中3)、106拷贝/20μL(图4中4)、105拷贝/20μL(图4中5)、104拷贝/20μL(图4中6)和103拷贝/20μL(图4中7)的T-H4的扩增曲线均为S型曲线(即结果呈阳性)；阴性对照(图4中8)的扩增曲线为直线(即结果呈阴性)。结果表明，实施例1的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂最低能检测到浓度为103拷贝/20μL的H4亚型禽流感病毒。
实施例4、实施例1的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的重复性实验
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将实施例3的T-H3和T-H4混合后，用无菌蒸馏水调整浓度，得到T-H3和T-H4的浓度均为108拷贝/μL的重组载体混合液。
按照实施例2步骤2)中的双重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为重组载体混合液和无菌蒸馏水(阴性对照)，其他步骤均不变，分别得到重组载体混合液和阴性对照的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线(图5)和ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线(图6)。重组载体混合液设置3个平行实验(图5和图6)。通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)来确定实时荧光定量PCR的批内重复性(表1)。将进行该次实验的时间记为实验第1天，分别在实验第4天和第7天分别按照上述方法重复该实验，确定实时荧光定量PCR的批间重复性(表2)。
在批内重复性实验中，3个平行实验在相应的荧光通道下均获得扩增曲线(图5和图6)，FAM通道(在530nm激发光下)Ct值变异系数为0.29％，ROX通道(在610nm激发光下)Ct值变异系数为0.24％。在批间重复性实验中，FAM通道和ROX通道的Ct值变异系数分别为0.51％和1.2％，表明实施例1的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂的重复性好。
表1、批内重复性实验
表2、批间重复性实验
实施例5、不同浓度模板对实施例1的成套试剂的干扰性实验
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将实施例3的T-H3和T-H4混合后，用无菌蒸馏水调整浓度，得到T-H3和T-H4的浓度分别为109拷贝/μL和103拷贝/μL的重组载体混合液1、T-H3和T-H4的浓度分别为103拷贝/μL和109拷贝/μL的重组载体混合液2、T-H3和T-H4的浓度分别为109拷贝/μL和104拷贝/μL的重组载体混合液3、T-H3和T-H4的浓度分别为104拷贝/μL和109拷贝/μL的重组载体混合液4。
按照实施例2步骤2)中的双重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为重组载体混合液1-4，其他步骤均不变，分别得到重组载体混合液1-4的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线和ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线。
分别以浓度为109、104或103拷贝/μL的T-H3溶液中的重组载体为模板进行单重T-H3PCR，T-H3单重荧光PCR的20μL反应体系为：实施例1的PCR引物对H3(H3的每条引物在该反应体系中的浓度均为0.6μM)，实施例1的探针H3-P(H3-P在该反应体系中的浓度为0.6μM)，Premix Ex Taq 10μL，实施例3的浓度为109、104或103拷贝/μL的T-H3溶液，无菌蒸馏水补足20μL。将上述反应体系放入Roche公司的LightCycler 2.0 PCR仪中，设置如下条件进行反应：94℃预变性30s；94℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环。反应结束后得到浓度为109、104或103拷贝/μL的T-H3的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线。
分别以浓度为109、104或103拷贝/μL的T-H4溶液中的重组载体为模板进行单重T-H4PCR，T-H4单重荧光PCR的20μL反应体系为：实施例1的PCR引物对H4(H4的每条引物在该反应体系中的浓度均为0.4μM)，实施例1的探针H4-P(H4-P在反应体系中的浓度为0.4μM)，Premix Ex Taq 10μL，实施例3的浓度为109、104或103拷贝/μL的T-H4溶液，无菌蒸馏水补足20μL。将上述反应体系放入Roche公司的LightCycler 2.0 PCR仪中，设置如下条件进行反应：94℃预变性30s；94℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环。反应结束后得到浓度为109、104或103拷贝/μL的T-H4的ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线。
表3、FAM通道的Ct值
表4、ROX通道的Ct值
将AIV-H3和AIV-H4质粒标准品模板按不同浓度进行组合时发现，当一个模板浓度高而另一个模板浓度低时，仍可在不同荧光通道下分别检测到2个模板，并与单重荧光PCR检测的Ct值的变异不大。
实施例6、双重荧光PCR鉴定禽流感病毒
1、样品采集
从活禽市场采集96份咽喉、泄殖腔棉拭子，分别用含有抗生素的PBS溶液(PBS溶液中青霉素的浓度为0.8万单位/mL，硫酸链霉素的浓度为1.0万单位/mL，庆大霉素的浓度为0.5mg/mL，制霉菌素的浓度为0.5mg/mL)充分浸泡棉拭子(约4小时)，反复挤压和清洗棉拭子，8000rpm/min离心5min，得到96份棉拭子的上清液。
2、常规方法确定禽流感病毒及其亚型
按照如下病毒分离方法鉴定棉拭子的上清液中AIV：取步骤1的96份棉拭子的上清液(样品1-96)分别接种SPF鸡胚，收集24-96h致死的鸡胚尿囊液和96h以上未致死的鸡胚尿囊液，取尿囊液进行血凝试验。结果显示(表5)，样品1-3、6-14、16-22、24-26、34、37-39、52-56、63、72和87-89均具有血凝性，表明样品1-3、6-14、16-22、24-26、34、37-39、52-56、63、72和87-89均含有禽流感病毒。
取有血凝价的样品(样品1-3、6-14、16-22、24-26、34、37-39、52-56、63、72和87-89)进行血凝抑制试验，确定感染的AIV的HA亚型(表5)。结果显示，样品6、17、52和72均含有H3亚型禽流感病毒，样品17和53均含有H4亚型禽流感病毒，样品1-3、7-14、16、18-22、24-26、34、37-39、54-56、63和87-89中的禽流感病毒均不为H3亚型和H4亚型禽流感病毒。
3、双重荧光PCR确定禽流感病毒及其亚型
取步骤1的96份棉拭子的上清液(样品1-96)，按照DNA/RNA抽提试剂盒说明书，分别提取并得到96份样品的总RNA，分别调整每份样品总RNA的浓度，使这96份样品的总RNA的浓度均为10ng/μL。按照下述方法，分别对每份样品的总RNA进行双重荧光PCR：
按照实施例2步骤2)中的双重荧光PCR的方法，将步骤1)的病毒的cDNA或DNA或无菌蒸馏水分别替换为上述各样品的总RNA，其他步骤均不变，分别得到各样品的HA亚型鉴定结果(表5)。
结果显示，样品6、17、52和72均含有H3亚型禽流感病毒，样品17和53均含有H4亚型禽流感病毒，样品1-3、7-14、16、18-22、24-26、34、37-39、54-56、63和87-89中的禽流感病毒均不为H3亚型和H4亚型禽流感病毒。
结果表明，用实施例1的成套试剂检测H3亚型或H4亚型禽流感病毒结果与常规的病毒分离鉴定和血凝抑制试验确定的禽流感病毒的H3亚型和H4亚型均完全一致，并且与其他HA亚型不发生交叉反应。因此，本发明的成套试剂可以用来确定待测样品是否含有H3亚型或H4亚型禽流感病毒。
表5、96份棉拭子中禽流感病毒及其亚型的鉴定结果
样品 常规方法 双重荧光PCR
1 H1+H6 -
2 H1+H9 -
3 H6+H7+H9 -
4 * -
5 * -
6 H3+H5+H6 H3
7 H6+H7+H9 -
8 H1+H6+H7+H9 -
9 H9+H11 -
10 H1+H6+H9 -
11 H5+H7+H11 -
12 H5+H10+H11 -
13 H6+H9 -
14 H1+H7+H9 -
15 * -
16 H9+H11 -
17 H1+H3+H4 H3+H4
18 H9+H11 -
19 H6+H9+H11 -
20 H5+H10+H11 -
21 H5+H7+H11 -
22 H7+H9+H11 -
23 * -
24 H6+H7+H11 -
25 H6+H9 -
26 H7+H9+H11 -
27 * -
28 * -
29 * -
30 * -
31 * -
32 * -
33 * -
34 H7+H11 -
35 * -
36 * -
37 H6+H9+H11 -
38 H5+H7+H6+H9 -
39 H6+H9 -
40 * -
41 * -
42 * -
43 * -
44 * -
45 * -
46 * -
47 * -
48 * -
49 * -
50 * -
51 * -
52 H3+H7+H9 H3
53 H1+H4+H7 H4
54 H5+H9 -
55 H9+H11 -
56 H10+H11+H13 -
57 * -
58 * -
59 * -
60 * -
61 * -
62 * -
63 H5+H7+H11 -
64 * -
65 * -
66 * -
67 * -
68 * -
69 * -
70 * -
71 * -
72 H3+H6+H9 H3
73 * -
74 * -
75 * -
76 * -
77 * -
78 * -
79 * -
80 * -
81 * -
82 * -
83 * -
84 * -
85 * -
86 * -
87 H9+H11 -
88 H7+H9+H11 -
89 H10+H11+H13 -
90 * -
91 * -
92 * -
93 * -
94 * -
95 * -
96 * -
注：“*”表示待测样品不含有禽流感病毒，“-”表示待测样品不含有H3或H4亚型禽流感病毒。
对比例1、实施例1的成套试剂的优化实验
将实施例3的浓度为108拷贝/μL的T-H3和浓度为108拷贝/μL的T-H4混合后，得到将混合液5作为模板，进行反应体系的优化重组载体混合液5。
以重组载体混合液5中的DNA为模板，配制不同引物和探针浓度的20μL的双重荧光PCR反应体系，每个双重荧光PCR的反应体系为：实施例1的PCR引物对H3，实施例1的探针H3-P，实施例1的PCR引物对H4，实施例1的探针H4-P，Premix Ex Taq10μL，重组载体混合液5或无菌蒸馏水2μL(无菌蒸馏水作为阴性对照)，无菌蒸馏水补足20μL。H3和H4的每条引物在反应体系中的浓度以及H3-P和H4-P在反应体系中的浓度如表6所示。
表6、不同反应体系中引物和探针的浓度(μM)
注：H3列中，每个数字表示H3引物的两条单链DNA和H3-P的浓度；H4列中，每个数字表示H4引物的两条单链DNA和H4-P的浓度。
将上述反应体系放入Roche公司的LightCycler 2.0 PCR仪中，设置如下条件进行反应：94℃预变性30s；94℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环。反应结束后得到不同浓度的引物和探针的FAM通道(在530nm激发光下)的扩增曲线和ROX通道(在610nm激发光下)的扩增曲线。
结果显示，当H3引物的两条单链DNA和H3-P的浓度均为0.6μM、H4引物的两条单链DNA和H4-P的浓度均为0.4μM时，该反应体系的扩增效果最好。表明，鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂中H3和H3-P的最佳浓度为0.6μM，H4和H4-P的最佳浓度为0.4μM。

Claims (5)

1.鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂，由名称为H3-T的成套DNA和名称为H4-T的成套DNA组成；
所述H3-T由名称为H3的PCR引物对和名称为H3-P的探针组成；所述H3由序列表中SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述H3-P为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述H4-T由名称为H4的PCR引物对和名称为H4-P的探针组成；所述H4由序列表中SEQID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成；所述H4-P为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA。
2.鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1所述的成套试剂。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于：所述探针标记有荧光染料；所述荧光染料为FAM和/或Eclipse和/或ROX。
4.根据权利要求2或3所述的产品，其特征在于：所述产品还包括DNA聚合酶。
5.权利要求1所述的成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的产品中的应用。
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