CN102071259A - 猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重实时荧光pcr检测引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，设计合成出引物，利用引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，利用SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。本发明的有益效果是能够同时有效诊断和检测出猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型三种病毒，不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性。

Description

猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重实时荧光PCR检测引物及方法 

技术领域

本发明涉及一种实时荧光PCR检测方法，具体涉及猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法。 

背景技术

猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠母猪的繁殖障碍，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，在猪群中具传播快、胚胎致死率高、流行范围广、传播途径多、病原体顽固等特点，每年给养猪业造成了巨大损失。而且经常混合感染，靠中和试验和分离病毒来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，所需时间长，寻求一种操作简单、快速的检测、鉴别诊断方法是防制这类疾病的基础。 

目前，针对以上三种病毒病的诊断方法有很多，这些方法具有操作复杂、费时费力、敏感度差及阴性率高等缺点；临床已经使用的PCR诊断技术，虽然有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点，但不能准确定量；基于TaqMan技术荧光定量PCR方法能定量，但是成本较高，且需要合成特异性探针。亟需研究和开发简便、快速、特异、成本低、定量的检测方法。SYBR Green I是非特异性结合于双链DNA的荧光染料，可以和多种扩增序列结合。SYBRGreen I实时荧光PCR检测方法可以不用设计和合成特异的荧光标记的探针直接扩增检测任何基因的技术。 

发明内容

本发明要解决的技术问题设计与合成出猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型引物后，利用引物用SYBR Green I实时荧光PCR检测方法同时检测出猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型三种病毒。 

本发明的技术方案是：猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物的序列如下： 

猪圆环病毒2型引物的序列如下： 

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′； 

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′； 

猪细小病毒引物的序列如下： 

上游引物P3：5′-TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3′； 

下游引物P4：5′-TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3′； 

猪伪狂犬病毒引物的序列如下： 

上游引物P5：5′-CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3′； 

下游引物P6：5′-AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3′。 

利用上述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。 

所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份： 

SYBR Green I PreMix    17μl 

P1/P3/P5               0.5+0.5+0.5μl 

P2/P4/P6               0.5+0.5+0.5μl 

DNA                    1+1+1μl 

ddH₂O                  2μl 

                             

                       25μl 

所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。 

本发明的有益效果是能够同时有效诊断和检测出PPV、PRV和PCV2三种病毒。能最少检测出189拷贝猪伪狂犬病毒质粒、203拷贝猪细小病毒质粒和173拷贝猪圆环病毒2型质粒，不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为PRV、PPV、PCV2的检测提供了一种新的方法，可作为规模化猪场PRV、PPV、PCV2的净化检测方法，建立无PRV、PPV、PCV2的猪群，同时也为PRV、PPV、PCV2感染的分子流行病学调查，研究PRV、PPV、PCV2分子发病机制，早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。 

附图说明

图1为PRV gH基因质粒的PCR鉴定结果； 

图2为PPV VP2部分基因质粒的PCR鉴定结果； 

图3为PCV2ORF2部分基因质粒的PCR鉴定结果； 

其中，图1，图2，图3中1.目的片段M.DL 2000Marker 

图4为多重SYBR Green I荧光定量PCR反应溶解曲线； 

图5为多重SYBR Green I实时荧光PCR反应特异性试验溶解曲线； 

图6为多重SYBRGreen I实时荧光PCR反应同一浓度重复性试验溶解曲线； 

图7为多重SYBR Green I实时荧光PCR反应不同浓度重复性试验溶解曲线。 

具体实施方式

实施例 

猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物的序列如下： 

猪圆环病毒2型引物的序列如下： 

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′； 

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′； 

猪细小病毒引物的序列如下： 

上游引物P3：5′-TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3′； 

下游引物P4：5′-TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3′； 

猪伪狂犬病毒引物的序列如下： 

上游引物P5：5′-CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3′； 

下游引物P6：5′-AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3′。 

利用上述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。 

所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份： 

SYBR Green I PreMix    17μl 

P1/P3/P5               0.5+0.5+0.5μl 

P2/P4/P6               0.5+0.5+0.5μl 

DNA                    1+1+1μl 

ddH₂O                  2μl 

                              

                       25μl 

所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性 15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。 

上述实施例中，关于材料和方法如下： 

1材料与方法 

1.1材料 

1.1.1毒株、细胞株和菌株 

PK-15细胞，猪伪狂犬病毒标准毒株均购自中国兽药监察所；猪细小病毒，猪圆环病毒2型，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪瘟病毒和猪流感病毒标准毒株均购自河南省动物性食品安全重点实验室；工程菌DH5α感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司。 

1.1.2常用溶液及培养基 

LB液体培养基；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液，100mg/ml；IPTG浓度为100mg/ml；X-gal浓度为20mg/ml，保存于棕色瓶内或用铝箔包裹的瓶内，以上溶液均贮存于-20℃备用。 

1.1.3主要仪器及试剂 

紫外凝胶成像系统购自美国ALPHA INNOTECH公司；Rotor-Gene 3000型实时定量PCR扩增仪购自澳大利亚基因公司、PTC-200型PCR仪购自美国MJ公司、3K30型高速冷冻离心机购自德国SIGMA公司等。 

SYBR Green I PreMix；EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000购自大连宝生物工程有限公司；Protein K购自华美生物工程公司；DMEM培养基购自GIBCOBRL公司；胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自LTI公司；T4DNA连接酶、PGEM-T Easy质粒载体均购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司。 

1.2方法 

1.2.1PCV2的培养增殖 

将PCV2同步接种于未贴壁的PK-15细胞，接毒量为培养液的1/10，将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养72h后，终止培养并收毒。反复冻融2～3次，收集病毒液，直接进行病毒RNA的提取或-80℃贮存备用。 

1.2.2PPV的培养增殖 

将处于对数生长期的PK-15细胞用0.25％的胰酶消化后，放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养。待细胞贴壁长至生长表面的60％～70％时，取出培养瓶用PBS液洗2～3次后，按培养液1/10体积的接种量接种PPV病毒，然后将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞病变，培养72h后收毒。将收集的病毒液反复冻融3次，直接进行病毒DNA的 提取或-70℃贮存备用。 

1.2.3PRV的培养增殖 

当PK-15细胞达90％以上时，接种100TCID₅₀PRV，37℃吸附1h，洗去未吸附病毒，加入适量的细胞维持液，待细胞病变达到70％时，终止培养，反复冻融2～3次，收集病毒液，直接进行病毒DNA的提取或-80℃贮存备用。 

1.2.4引物设计与合成 

以GenBank公布猪圆环病毒2型ORF2基因为参照序列(AF027217)，猪细小病毒NADL-2株(NC001718)VP2基因序列，Klupp等报道的猪伪狂犬病毒gH基因序列，用Primer Premier5.0生物软件分别设计出1对特异性引物，预计扩增片段分别为171bp、313bp和355bp，引物的序列如下： 

猪圆环病毒2型引物的序列如下： 

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′； 

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′； 

猪细小病毒引物的序列如下： 

上游引物P3：5′-TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3′； 

下游引物P4：5′-TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3′； 

猪伪狂犬病毒引物的序列如下： 

上游引物P5：5′-CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3′； 

下游引物P6：5′-AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3′。 

上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。 

1.2.5PCV2、PPV、PRV病毒DNA的提取 

传统的蛋白酶K提取方法：取增殖的病毒液各450μl，加入等体积样品裂解缓冲液[0.02mol/L Tris HCl(PH 7.5)，0.03mol/L EDTA，1％SDS]，混匀，再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/m L)，56℃水浴1h，然后加入等体积的平衡酚，混匀，10000rpm离心5min。取上清，经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，-20℃放置30min，12000rpm离心10min，70％乙醇洗涤2次，干燥，加入25μl超纯水溶解，贮存于-20℃备用。 

1.2.6猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒cDNA的制备 

分别取400μl的病毒液，加入400μl Trizol，剧烈振荡；加入100μl氯仿∶异戊醇(24∶1)剧烈振荡30s，混匀；放入台式离心机12000rpm，室温离心5min；取上层水相，小心转移至经DEPC水处理过的1.5ml无菌离心管中，加入150μl无水乙醇，混匀；将上步中的溶液 全部转移到UnLQ-10柱子中，室温放置2min，使溶液中的RNA尽可能的与柱子的滤膜相结合，8000rpm，离心1min；取出柱子弃去收集管中的废液，将柱子放入收集管中并加入450μlRPE Solution，室温静置2min，10000rpm，离心30s，并重复一次；取出柱子，弃去废液，12000rpm，空离3min；取出柱子，放入经DEPC水处理过的1.5ml无菌离心管中，于柱内膜中央加入16μl DEPC水，55～80℃放置2min；10000rpm，离心1min，收集管内溶液，其中含有所抽提的三种病毒的RNA，可立即使用或-70℃贮存备用。 

在提取的三种病毒的RNA中分别加入反转录随机引物(10pmol/μl)，4μl dNTP(2.5mmol/L)，70℃放置5min，冰浴2min；加入4μl反转录Buffer，2μl 0.1M DTT，1μl Rnaseinfnibitor(40U/μl)，42℃放置2min；加入1μlM-MLV反转录酶(200U/μl)，42℃作用1h，70℃放置15min，灭活反转录酶。将反转录后的cDNA于-20℃贮存备用。 

1.2.7质粒模板标准品的制备 

以提取的PCV2DNA、PRV DNA和PPV DNA为模板，用优化的条件扩增ORF2基因片段、gH基因片段和NS1基因片段。在50μl反应体系中分别依次加入：10×PCR缓冲液5μl，MgCl₂3mmol/L，dNTPs浓度为200μm/L，Taq酶1U，引物浓度P1/P3/P5、P2/P4/P6为0.5μl，模板5μl，最后用双蒸水补至50μl，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：95℃预变性5min后，进人循环95℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环后，72℃延伸10min，4℃结束反应。2.5％琼脂糖凝胶电泳。 

将扩增出目的片段按胶回收试剂盒回收，按照载体连接试剂盒将目的片段与pGEM-TEasy载体相连接，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，进行菌液PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，送大连宝生物工程有限公司进行测序。经测序验证的阳性质粒作为模板标准品，并分别命名为pGEM-VP2、pGEM-gH和pGEM-PCV2。 

1.2.8PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green I实时荧光PCR反应体系条件的优化 

SYBR Green I实时荧光PCR反应体系如下： 

在25μl体系中加入以下成份： 

SYBR Green I PreMix     15μl 

P1/P3/P5                0.5+0.5+0.5μl 

P2/P4/P6                0.5+0.5+0.5μl 

DNA                     1+1+1μl 

ddH₂O                   4μl 

                               

                        25μl 

瞬时离心后，将EP管置于荧光定量PCR仪上95℃预变性5min；进入循环，95℃变性 15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。同时设立无模板的阴性对照。本发明反应条件的优化是在3种病毒质粒模板等量的条件下进行的。 

1.2.8.1引物浓度的优化 

分别以50pmol/μl的引物浓度0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl进行SYBR Green I实时荧光PCR反应，以选取扩增该病毒的最佳引物浓度。添加时取相等体积的引物量。 

1.2.8.2退火温度的优化 

多重SYBR Green I实时荧光PCR分别以52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的退火温度进行反应，以确定最佳的退火温度。 

1.2.8.3SYBR PreMix浓度的优化 

本发明中荧光染料预混酶SYBR Green I PreMix的浓度是5U/μl，固定SYBR Green I实时荧光PCR反应体系的总体积，通过改变荧光染料预混酶SYBR PreMix的添加量来筛选SYBR Green I荧光定量PCR反应体系中SYBR PreMix的最佳浓度。分别以10μl、12μl、15μl、17μl、20μl、22μl的浓度进行筛选。 

1.2.9特异性检验 

按照SYBR Green I荧光定量反应体系，分别加入PCV2、PPV、PRV细胞毒DNA 1μl(约20ng)，猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞毒cDNA 1μl(约20ng)，猪流感病毒细胞毒cDNA 1μl(约20ng)，猪瘟病毒细胞毒cDNA 1μl(约20ng)，同时设阴性对照，验证其特异性。 

1.2.10重复性检验 

选取PCV2、PPV、PRV同一浓度的质粒标准品进行多重SYBR Green I实时荧光PCR反应重复性试验，反应重复3次；将不同浓度的质粒标准品进行多重SYBR Green I实时荧光PCR反应重复性试验，反应重复3次；通过每种病毒的Tm值和溶解曲线的分析，验证PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR方法的稳定性。 

1.2.11实时荧光PCR敏感性测定 

分别将PCV2、PPV、PRV的重组质粒测OD₂₆₀值，计算出每微升的拷贝数，然后进行10倍梯度稀释，以此作为模板进行多重SYBR Green I实时荧光PCR反应，进而确定多重SYBRGreen I实时荧光PCR反应检测每种病毒的敏感性。 

1.2.12疑似PCV2、PPV、PRV病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较 

取采自河南省郑州、洛阳、南阳地市猪场的疑似PCV2、PPV、PRV感染的病料进行多重SYBR Green I实时荧光PCR和检测，以证实该方法的实用性。 

2结果 

2.1质粒PCR扩增 

如图1，图2，图3的PRV gH基因、PPV VP2、PCV20RF2部分基因质粒PCR鉴定结果所示，分别扩增出了与预计大小相一致的171bp、355bp和313bp的片段。pGEM-PCV、pGEM-PRV和pGEM-PPV经EcoR I酶切鉴定，得到产物与预期的条带一致。测序与国内流行的毒株相比，核苷酸同源性在99.6％、99.8％、99.7％以上。 

测得提取的PPV、PCV2、PRV质粒DNA浓度分别为：pGEM-VP2质量浓度＝141μg/ml，pGEM-PCV2质量浓度＝77.5μg/ml，pGEM-gH质量浓度＝145μg/ml。经计算，PPVpGEM-VP2质粒浓度为7.86×10¹³拷贝/ml，pGEM-PCV质粒浓度为4.53×10¹³拷贝/ml，pGEM-gH质粒浓度为8.00×10¹³拷贝/ml。 

2.2PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green I实时荧光PCR反应条件的优化结果 

SYBR Green I虽然是一种无特异性的荧光染料，但在进行多重PCR试验时，它并非均一的和所有的目的片段结合，而是会和某些片段优先结合，这就需要对反应体系进行条件优化，保证体系中有足够的染料和各种引物的比例适中。 

2.2.1引物浓度优化结果 

PCV2、PPV、PRV引物均采用50pmoL/μl 0.5μl的量在25μl体系中进行反应，能够产生特异性的单一峰值，阴性对照无特异性峰值产生。PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR反应的最佳引物浓度均为0.5μl。 

2.2.2退火温度优化结果 

PPV、PRV、PCV2在退火温度55℃时，均产生了特异性的峰值。PCV2Tm值分别为81.5℃，81.5℃，81.3℃；PRV Tm值分别为87.7℃，87.7℃，87.2℃；PPV Tm值分别为74.2℃，74.6℃，74.9℃。阴性对照均无特异性峰值产生。PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green I实时荧光PCR反应的最佳退火温度为55℃。 

2.2.3SYBR Green I PreMix浓度的优化结果 

PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green I实时荧光PCR反应中SYBR Green I PreMix添加量在17μl时，三者均可产生特异性的峰值，阴性对照无特异性峰值产生。 

2.3多重SYBR Green I实时荧光PCR反应体系的确定 

通过各个反应条件的优化，最终确定了PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份： 

SYBR Green I PreMix    17μl 

P1/P3/P5               0.5+0.5+0.5μl 

P2/P4/P6     0.5+0.5+0.5μl 

DNA          1+1+1μl 

ddH₂O        2μl 

                   

             25μl 

该反应的循环参数最终确定为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。 

2.4PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR扩增产物的溶解曲线及PCV2、PPV、PRV Tm值的确定 

本发明利用Tm值的不同进行核酸片段的区分，核酸片段的Tm值主要与GC含量、序列长度和序列结构有关。PRV的扩增片段基因序列长355bp，GC含量比一般病毒高，其Tm值最高，达到了87℃以上，很容易与其他病毒区分；PCV2扩增片段长171bp，Tm值比PRV的低，在82℃左右；PPV的扩增片段为313bp，GC含量相对最低，Tm值比PRV、PCV2的Tm值都低，况且PRV、PPV和PCV2三者扩增产物的长度也不同，所以PRV、PPV、PCV2的Tm值可以很好的区分。 

按照PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR反应条件，以PCV2、PPV、PRV的重组质粒为模板，进行PCR反应，经软件Rotor-gen6.0分析后得到溶解曲线如图4所示，从图中可以看出三个特异性的峰值所对应的温度即为PRV扩增片段的Tm值、PPV扩增片段的Tm值和PCV2扩增片段的Tm值，但是它们并不是固定不变的，它们的Tm值会在一定的温度范围内变动，通过多个批次试验数据的收集整理后，最终确定了PCV2、PPV、PRV 3种病毒的Tm值，分别为：PCV280～81.2℃，PRV 86～87.5℃，PPV 73.5～75.2℃。阴性对照则无峰值产生。三种病毒的Tm值相差较大，因此，可以利用三者扩增产物片段Tm值的不同及溶解曲线的3个特异性的峰进行诊断与鉴别区分。 

2.5多重SYBR Green I实时荧光PCR特异性检验结果 

从PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR特异性试验结果如图5所示，从图中可以看出，对照组中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒及阴性对照均无特异性峰值产生。只有试验组中的PCV2、PPV、PRV多重实时荧光PCR产生了特异性的三个峰值。PCV2 Tm值为80.5℃，PPV Tm值为74.5℃，PRV Tm值为87.5℃。 

2.6多重SYBR Green I实时荧光PCR重复性试验结果 

2.6.1同一浓度的PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR重复性试验结果 

3次重复性试验中，各个病毒的Tm值都较为稳定。如表1，图6所示，对照组中猪繁殖与 呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒及阴性对照均无特异性峰值产生。同浓度的PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR反应具有很好的稳定性。 

表1多重SYBR Green I实时荧光PCR的同一浓度重复性试验分析 

2.6.2不同浓度的PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR重复性试验结果 

在不同浓度重复性试验中，各个病毒的Tm值都较为稳定。如表2，图7所示，对照组中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒及阴性对照均无特异性峰值产生。不同浓度的PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR反应同样具有很好的稳定性。 

表2多重SYBR Green2 I实时荧光PCR的不同浓度重复性试验分析 

2.7PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green I实时荧光PCR敏感性试验 

敏感性试验中，以重组质粒为模板，通过测定重组质粒的浓度，获得每微升所含的重组质粒拷贝数，这就避免了DNA提取过程中产生的杂质核酸片段对PCR反应的影响。本发明中我们还发现，模板的量对多重SYBR Green I实时荧光PCR反应体系有很大影响，加入的模板量太大，所得结果的背景荧光值就会很高，而且非特异性的杂峰很多，对特异性峰值的判定造成严重影响，因此我们选用的模板量为1μl(PRV 145μg/μl，PPV 141μg/μl，PCV277.5μg/μl)，在保证敏感性的前提下较好的排除了杂峰的干扰。 

pGEM-VP2、pGEM-PCV2和pGEM-gH 3种质粒的浓度分别为141μg/ml、77.5μg/ml、145μg/ml；取等体积的2种质粒混匀后，进行10倍梯度稀释，以此作为模板进行多重SYBR Green I实时荧光PCR反应。PCV2重组质粒的敏感性可以达到173拷贝/μl，PPV重组质粒的敏感性可 以达到203拷贝/μl，PRV重组质粒的敏感性可以达到189拷贝/μl。 

2.8实时荧光PCR与常规PCR检测比较 

将疑似患PRV、PCV2、PPV仔猪组织病料30头份，阴性对照2头份提取DNA后，分别进行PCR和实时荧光PCR检测，结果显示，在30份病料中，常规PCR检出10份PPV阳性病料，检出率为33.3％；4份PRV阳性病料，检出率为13.3％；14份PCV2阳性病料，检出率为46.7％；多重荧光定量PCR同样能够检测出常规PCR所检出的阳性病料，二者符合率达100％；多重荧光定量PCR中，PPV检出25份阳性病料，检出率为83.3％，比常规PCR的检出率高50％；PCV2检出27份阳性病料，检出率为90％，比常规PCR的检出率高43.3％；PRV检出14份阳性病料，检出率为46.7％，比常规PCR的检出率高33.4％。实时荧光PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。 

Claims (2)

1.猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物，其特征在于：

猪圆环病毒2型引物的序列如下：

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′；

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′；

猪细小病毒引物的序列如下：

上游引物P3：5′-TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3′；

下游引物P4：5′-TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3′；

猪伪狂犬病毒引物的序列如下：

上游引物P5：5′-CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3′；

下游引物P6：5′-AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3′。

2.利用权利要求1所述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测，其特征在于：

所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

SYBR Green I PreMix     17μl

P1/P3/P5                0.5+0.5+0.5μl

P2/P4/P6                0.5+0.5+0.5μl

DNA                     1+1+1μl

ddH₂O                   2μl

                     

                        25μl

所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。

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