CN102382902A - CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法 - Google Patents
CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法,CSFV引物的序列如下:上游引物P1:5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′;下游引物P2:5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′PRV引物的序列如下:上游引物P3:5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′;下游引物P4:5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′;PCV2引物的序列如下:上游引物P5:5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′;下游引物P6:5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。本发明通过猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒三重SYBR Green Ⅰ定量PCR检测方法,能够同时检测CSFV、PRV和PCV2 3种DNA病毒,能最少检测183拷贝猪瘟病毒、231拷贝猪伪狂犬病毒和203拷贝猪圆环病毒2型;本发明的特异性试验结果良好,只出现三个特异性的峰值,重复性试验具有很好的稳定性,为有效检测和鉴别混合感染提供了一种成本低、快速、灵敏、特异、准确的新方法,有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪病毒的检测方法,具体涉及CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及检测方法。
背景技术
猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育,即公猪睾丸肿胀,精液质量下降,失去种用能力;母猪表现为不发情,返情,不孕;妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等,给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。
目前,国内外对以上三种病毒已经有大量的相关研究,建立了病毒分离、ELISA检测方法、免疫组化法、免疫荧光法等方法,以及以分子生物学为基础的检测方法,如PCR、套式PCR和竞争PCR等。但这些方法都存在这样那样的缺点:病毒分离耗时、原位杂交操作繁琐等,PCR虽然有较高的特异性和敏感性,但容易出现假阴性结果,而且不能定量,往往漏检隐性感染的动物,造成疾病的蔓延。TaqMan探针方法能够定量,但成本较高,不利于推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是CSFV、PCV2与PRV的PCR检测方法易出现假阴性结果,而且不能定量,提供一种CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及检测方法。
本发明的技术方案是:CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物:
CSFV引物的序列如下:
上游引物P1:5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′;
下游引物P2:5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′;
PRV引物的序列如下:
上游引物P3:5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′;
下游引物P4:5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′;
PCV2引物的序列如下:
上游引物P5:5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′;
下游引物P6:5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
所述引物检测CSFV、PCV2与PRV的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法,包括提取病毒的DNA后,按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测,所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系,在25μl体系中加入以下成份:
所述反应条件为:95℃预变性1min;进入循环,95℃变性10s,58℃退火15s,72℃延伸15s,40个循环,循环结束后升温至95℃15s,再降至65℃15s,开始从65℃递增至94℃,采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线,于95℃15s结束反应。
本发明的有益效果是:本发明分别设计扩增CSFV、PCV2和PRV的特异性引物,建立了能够同时检测CSFV、PCV2和PRV的三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法。本发明利用TM值来区分不同的核酸片段,核酸片段的TM值主要与GC含量、序列长度和结构有关。CSFV的扩增片段基因序列长252bp,其TM值较高,达到了89℃以上;PCV2扩增片段长171bp,TM值比CSFV的低,在85℃左右;PRV的扩增片段为187bp,GC含量相对最高,TM值比CSFV、PCV2的TM值都高,达到92℃以上,CSFV、PCV2和PRV的TM值可以很好的区分。
在本发明中,CSFV扩增片段的TM值、PCV2扩增片段的TM值和PRV扩增片段的TM值会在一定的温度范围变动,CSFV的TM值变化范围为89.6-90.0℃,PCV2的TM值变化范围为85.2-85.7℃,PRV的TM值变化范围为92.6-93.0℃,3种病毒的TM值相差较大,借此可以利用熔解曲线的三个特异性的峰对这3种病毒进行鉴别。
本发明通过猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒三重SYBR Green Ⅰ定量PCR检测方法,能够同时检测CSFV、PRV和PCV23种DNA病毒,能最少检测183拷贝猪瘟病毒、231拷贝猪伪狂犬病毒和203拷贝猪圆环病毒2型;本发明的特异性试验结果良好,只出现三个特异性的峰值,重复性试验具有很好的稳定性,为有效检测和鉴别混合感染提供了一种成本低、快速、灵敏、特异、准确的新方法,有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。
本发明可作为规模化猪场CSFV、PCV2和PRV的净化检测方法,建立无CSFV、PCV2和PRV的猪群,同时也为CSFV、PCV2和PRV感染的分子流行病学调查,研究CSFV、PCV2和PRV分子发病机理,CSFV、PCV2和PRV的诊断试剂盒的研制与开发,药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。
附图说明
图1是CSFV部分基因质粒PCR鉴定结果,M.DL 2000Marker,1.阴性对照,2.目的片段;
图2是PCV2部分基因质粒PCR鉴定结果,M.DL 2000Marker,1.阴性对照,2.目的片段;
图3是PRV部分基因质粒PCR鉴定结果,M.DL 2000Marker,1.阴性对照,2.目的片段;
图4是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应熔解曲线分析;
图5是多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应特异性试验熔解曲线分析;
图6是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应同浓度重复性试验熔解曲线分析;
图7是不同浓度重复性试验熔解曲线分析;
图8是不同浓度重复性试验熔解曲线分析;
图9是不同浓度重复性试验熔解曲线分析。
具体实施方式
CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物,
CSFV引物的序列如下:
上游引物P1:5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′;
下游引物P2:5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′;
PRV引物的序列如下:
上游引物P3:5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′;
下游引物P4:5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′;
PCV2引物的序列如下:
上游引物P5:5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′;
下游引物P6:5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
所述引物检测CSFV、PCV2与PRV的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法,包括提取病毒的DNA后,按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测,所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系,在25μl体系中加入以下成份:
所述反应条件为:95℃预变性1min;进入循环,95℃变性10s,58℃退火15s,72℃延伸15s,40个循环,循环结束后升温至95℃15s,再降至65℃15s,开始从65℃递增至94℃,采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线,于95℃15s结束反应。
具体实验操作如下:
1材料与方法
1.1材料
1.1.1毒株、细胞株和菌株
PRV、PPV标准毒株购自中国兽药监察所;CSFV、SIV H9亚型、PRRSV、PCV2购自河南省动物性食品安全重点实验室;DH5α感受态细胞购自宝生物工程有限公司。
1.1.2常用溶液及培养基
LB液体培养基,4℃保存;氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)贮存液,100mg/mL;X-gal,浓度为20mg/mL,用棕色瓶或用铝箔包裹的瓶保存,IPTG液,浓度为100mg/mL;贮存于-20℃备用。
1.1.3主要仪器及试剂
紫外凝胶成像系统购自美国ALPHA INNOTECH公司;Agilent Mx3005P型实时定量PCR扩增仪购自美国安捷伦Stratagene公司、PTC-200型PCR仪购自美国MJ公司等。
SYBRPremix Ex TaqTM II、EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000均购自大连宝生物工程有限公司;Protein K购自华美生物工程公司;T4DNA连接酶、PGEM-T Easy质粒载体均购自Promega公司;DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司;质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司;RNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司;反转录试剂盒购自美国MBI公司。
1.2方法
1.2.1引物的设计和合成
以CSFV 5′端保守序列、猪伪狂犬病毒gH基因序列和Gene Bank公布的PCV2 ORF2基因为参照序列(AF027217),用Primer Premier 6.0生物软件分别设计一对特异性引物,引物的序列如表1所示。
表1 荧光PCR引物序列
1.2.2PCV2、PRV、PPV DNA的提取
传统的蛋白酶K提取方法:取已经检测过的含有这三种病毒的组织,剪碎、加适量的PBS研磨,取450μL研磨后的组织液,加入等体积样品裂解缓冲液[0.02mol/L Tris HCl(PH 7.5),0.03mol/L EDTA,1%SDS],混匀,再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/m L),55℃水浴1h,然后加入等体积的平衡酚,混匀,12000r/min离心5min。取上清,经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀,-20℃放置30min,12000r/min离心5min,70%乙醇洗涤2次,干燥,加入25μL超纯水溶解,贮存于-20℃备用。
1.2.3CSFV、PRRSV、SIV H9亚型cDNA的制备
取已经检测过的含有这三种病毒的组织,剪碎、加适量的PBS研磨,取450μL研磨后的组织液,然后按试剂盒说明提取和反转录。
1.2.4质粒模板标准品的制备
以提取的PCV2DNA、PRV DNA和CSFV cDNA为模板,用优化的条件扩增基因片段。在50μL反应体系中分别依次加入:EX TaqDNA聚合酶28μL,引物浓度P1/P3/P5、P2/P4/P6为0.5μm/L,模板2μL,最后用双蒸水补至50μL,将EP管置PCR仪,按如下程序进行扩增:95℃预变性5min后,进入循环95℃30s,55℃30s,72℃20s,30个循环后,72℃延伸10min,4℃结束反应。2.0%琼脂糖凝胶电泳。
将扩增出目的片段按DNA凝胶回收试剂盒回收,按照载体连接试剂盒说明书将目的片段与pGEM-T Easy载体相连接,转化DH5a感受态细胞,挑选阳性菌落,进行菌液PCR鉴定后,用质粒提取试剂盒说明提取质粒DNA,送宝生物工程有限公司进行测序。经测序验证的阳性质粒作为模板标准品,并分别命名为pGEM-CSFV、pGEM-PRV和pGEM-PCV2。
1.2.5CSFV、PCV2与PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系条件的优化
SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系如下:
在25μL体系中加入以下成份:
反应条件为:95℃预变性1min;进入循环,95℃变性10s,58℃退火15s,72℃延伸15s,40个循环,循环结束后升温至95℃15s,再降至65℃15s,开始从65℃递增至94℃,采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线,于95℃15s结束反应。
1.2.5.1引物浓度的优化
分别以50pmol/μL的引物浓度0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9μL进行荧光定量PCR反应,选取最佳引物浓度扩增病毒。
1.2.5.2退火温度的优化
三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR分别以54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的退火温度进行反应,选择最佳的退火温度。
本发明中SYBRPremix Ex TaqTM II的浓度是5U/μL,反应体系SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR总体积是固定,通过改变SYBRPremix Ex TaqTM II的添加量来筛选荧光定量PCR反应体系中SYBRPremix Ex Taq的最佳浓度。分别以10μL、11.5μL、13μL、14.5μL、16μL、17.5μL的量进行筛选。
1.2.6特异性检验
按照SYBR Green Ⅰ荧光定量反应体系,分别加入CSFV cDNA、PCV2DNA、PRV DNA(约20ng),PPV DNA 1μL(约20ng),PRRSV cDNA 1μL(约20ng),同时设阴性对照,验证其特异性。
1.2.7重复性检验
选取CSFV、PCV2、PRV同一浓度的质粒标准品进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验,重复反应三次;将不同浓度的质粒标准品进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验,重复反应三次;通过每种病毒的TM值与溶解曲线分析,验证CSFV、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的稳定性。
1.2.8荧光定量PCR敏感性测定
分别将CSFV、PCV2、PRV的重组质粒测OD260值,计算出每微升的拷贝数,然后进行10倍梯度稀释,作为模板进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应,确定复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应检测每种病毒的敏感性。
1.2.9疑似CSFV、PCV2、PRV病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较
取采自河南省内多个地市猪场的疑似CSFV、PCV2、PRV感染的病料进行复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR和检测,以验证该方法的实用性。
2结果
2.1常规质粒PCR扩增
CSFV、PCV2、PRV部分基因质粒PCR鉴定结果如图1-3所示,分别扩增出了与预计大小相一致的252bp、171bp和187bp的片段。pGEM-CSFV、pGEM-PCV2和pGEM-PRV经EcoR Ⅰ酶切鉴定,得到产物与预期的条带一致。测序与国内流行的毒株相比,核苷酸同源性在100%、100%、99.6%以上。
2.2质粒浓度的计算
测得提取的CSFV、PCV2、PRV质粒DNA浓度分别为:pGEM-CSFV质量浓度=18.8μg/mL,pGEM-PCV2质量浓度=19.9μg/mL,pGEM-PRV质量浓度=20.8μg/mL。经计算,pGEM-CSFV质粒浓度为1.38×1011拷贝/mL,pGEM-PCV2质粒浓度为2.19×1011拷贝/mL,pGEM-PRV质粒浓度为1.27×1011拷贝/mL。
2.3CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化结果
2.3.1引物浓度优化结果
CSFV、PCV2、PRV引物均采用50pmoL/μL 0.5μL的量反应体系为25μL,产生特异性的单一峰值,阴性对照无特异性峰值产生。CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的最佳引物浓度是0.5μL50pmoL/μL。
2.3.2退火温度优化结果
CSFV、PCV2、PRV在退火温度57℃时,均产生了特异性的峰值。CSFV TM值分别为89.8℃,89.8℃,89.9℃;PCV2TM值分别为85.2℃,85.3℃,85.3℃;PRV TM值分别为92.7℃,92.6℃,92.7℃。阴性对照没有产生特异性峰值。CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的退火温度优化结果为57℃。
2.3.3 SYBRPremix Ex TaqTM II浓度的优化结果CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应中SYBRPremix Ex TaqTM II添加量在14.5μL时,三者均可产生特异性的峰值,阴性对照则不产生特异性峰值。
2.4复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系的确定
通过优化各个反应条件,最终确定了CSFV、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系,在25μL体系中加入以下成份:
该反应最终确定的反应参数为:95℃预变性1min,95℃10s,58℃15s,72℃15s,40个循环。反应结束后先加热至95℃,然后再降至65℃,开始以0.5℃/sec递增至94℃检测荧光信号,进而得出扩增产物的熔解曲线。
SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,在进行复合SYBR Green Ⅰ PCR试验时,它并非均一的和所有的双螺旋结合,而是会优先和某些片段结合,这就需要优化反应体系,以确保体系中有足够的染料以及各种引物的比例适中。试验中,对三者的引物浓度、退火温度及SYBRPremix Ex TaqTM II的浓度进行了优化,结果发现CSFV、PCV2、PRV的引物以50pmoL/μL 0.4μL、0.5μL、0.6μL的量添加,退火温度57℃,SYBR Green Ⅰ预混酶13μL、14.5μL、16μL时,均有特异性峰值产生。从确保试验结果的准确度、特异性以及经济成本来考虑,最终确定采用50pmoL/μL 0.5μL,SYBR Green Ⅰ预混酶14.5μL的条件进行反应。本试验结果的特异性和重复性较好。试验的敏感性,为了避免核酸提取过程中杂质核酸片段对试验的影响,通过以重组质粒为模板,测定重组质粒的浓度,从而获得了相对纯度较高的每微升所含的重组质粒拷贝数。在试验中,发现模板的量对反应体系有很大影响,加入的模板量过大,试验结果的背景荧光值就会很高,随之非特异性的杂峰很多,对判定特异性峰值造成严重影响,因此我们选用的模板量为1μL,以保证敏感性的前提下排除了杂峰的干扰。引物浓度是一个影响荧光定量PCR扩增的关键因素,若引物浓度太低,会使反应不完全;若引物浓度太高,则发生错配以及产生非特异性产物的可能性会大大增加;因此我们经过优化后采用0.5μL,以保证反应完全,避免产生非特异性产物。
2.5CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线及CSFV、PCV2、PRV TM值的确定
按照CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件,以CSFV、PCV2、PRV的重组质粒为模板,进行荧光定量PCR反应,经软件Agilent Mx3005P分析后得到熔解曲线(图4),从图中可以看出三个特异性的峰值所对应的温度为CSFV、PCV2、PRV的TM值。通过多个批次试验数据的收集整理后,最终确定了CSFV、PCV2、PRV 3种病毒的TM值,分别为:CSFV 88.6-89.9℃,PCV285.2-85.5℃,PRV 92.5-92.8℃;阴性对照无峰值产生。
2.6多重复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性检验结果
从CSFV、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性试验结果(图5)可以看出,对照组中PRRSV、PPV及阴性对照均无特异性峰值产生。只有试验组中的CSFV、PCV2、PRV复合荧光PCR产生了特异性的三个峰值。CSFV TM值为89.8℃,PCV2TM值为85.2℃,PRV TM值为92.7℃。
2.7多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果
2.7.1同一浓度的CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果
三次重复性试验中,这3种病毒的TM值都较为稳定。对照组中PRRSV、PPV及阴性对照均无特异性峰值产生(如表2,图6)。同浓度的CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应具有很好的稳定性。
表2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的同一浓度重复性试验分析
2.7.2不同浓度的CSFV、PCV2、PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验
在不同浓度重复性试验中,这几种病毒的TM值都较为稳定。对照组中PPV、PRRSV及阴性对照都没有特异性峰值产生(如表3,图7-9)。不同浓度的CSFV、PCV2、PRV复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应同样具有很好的稳定性。
表3多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的不同浓度重复性试验分析
2.8 CSFV、PCV2、PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR敏感性试验验
pGEM-CSFV、pGEM-PCV2和pGEM-PRV三种质粒的浓度分别为18.8μg/mL、19.9μg/mL、20.8μg/mL;取等体积的两种质粒混匀后,进行10倍梯度稀释,以此作为模板进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应。CSFV重组质粒的敏感性可以达到183拷贝/μL,PCV2重组质粒的敏感性可以达到203拷贝/μL,PRV重组质粒的敏感性可以达到231拷贝/μL。
2.9三重荧光定量PCR与常规PCR检测比较
将疑似患CSFV、PCV2、PRV仔猪组织病料24头份(编号为1-24),阴性对照2头份(编号为25、26),提取DNA或cDNA,分别进行PCR和real-time PCR检测,结果如表4所示,在24份病料中,常规PCR检出13份CSFV阳性病料,检出率为54.2%;11份PCV2阳性病料,检出率为45.8%;11份PRV阳性病料,检出率为45.8%;三重荧光定量PCR同样能够检测出常规PCR所检出的阳性病料,二者吻合率达100%;三重荧光定量PCR中,CSFV检出19份阳性病料,检出率为79.2%,比常规PCR的检出率高25%;PCV2检出15份阳性病料,检出率为62.5%,比常规PCR的检出率高16.7%,PRV检出15份阳性病料,检出率为62.5%,比常规PCR的检出率高16.7%,real-time PCR检测灵敏度高于常规PCR,能检测出常规PCR不能检测的病料,而同样对于阴性样品均不能检测出。
表4 CSFV、PCV2、PRV复合荧光定量PCR方法与常规PCR方法比较
Claims (2)
1.CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物,其特征在于:
CSFV引物的序列如下:
上游引物P1:5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′;
下游引物P2:5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′;
PRV引物的序列如下:
上游引物P3:5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′;
下游引物P4:5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′;
PCV2引物的序列如下:
上游引物P5:5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′;
下游引物P6:5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
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