CN102071256A - 猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，设计与合成出引物，利用引物检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型的二重SYBRGreen I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，利用SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。本发明能够同时检测出猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型两种DNA病毒，不能检测出猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒。本发明具有较好的敏感性、重复性与稳定性，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。

Description

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法

技术领域

本发明涉及一种实时荧光PCR检测方法，具体涉及猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法。

背景技术

猪伪狂犬病病毒(PRV)的传染源以及自然贮存宿主。猪感染PRV后常引起初生仔猪发病，死亡率可达100％；猪伪狂犬病可呈现典型的潜伏感染，任何年龄的猪耐过急性感染后，均能形成潜伏感染，病毒在猪体内终生潜伏，一定条件下潜伏的病毒可以激活，引起复发性感染并向外散毒，这种机制导致伪狂犬病很难根除。猪圆环病毒2型(PCV2)具有致病性，主要引起一种新发现的传染病-断奶仔猪多系统衰竭综合征，PCV2感染猪可能不一定发病，但不良的生存环境以及不当的免疫刺激，可促使猪圆环病毒病病症的出现；猪圆环病毒还可与其它病毒等病原常常混合感染，使得疾病在诊断上变得更该加困难；其可以抑制猪的免疫系统，PCV2能够进入巨噬细胞内而不被破坏。使得到目前为止，尚没有统一、快速的诊断方法和针对该病预防疫苗和特效药物，该病有时呈亚临床感染，所以要做好该病的诊断显得很重要。

SYBR Green是非特异性结合于双链DNA的荧光染料，可以和多种扩增序列结合。SYBRGreen I实时荧光PCR不仅可以对目的核酸进行比较准确的定量，而且还可通过溶解曲线分析，利用目的片段的Tm值的不同，能够在同一PCR管内进行多重PCR反应，这就为同时进行多种动物疾病的诊断提供了一种新的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型两种病毒的二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法。

本发明的技术方案是：猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物的序列如下：

猪圆环病毒2型引物的序列如下：

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′；

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′。

猪伪狂犬病毒引物的序列如下：

上游引物P3：5′-CAA CCC GCT CGT GCT C-3′；

下游引物P4：5′-GCT GCT CCT CCA TGT CCT-3′。

利用上述引物检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型的二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBRGreen I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。

所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。

本发明的有益效果是：本发明能够同时检测PCV2、PRV两种DNA病毒，能最少检测180拷贝猪伪狂犬病毒质粒和215拷贝猪圆环病毒2型质粒；不能检测出猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒。本发明具有较好的敏感性、重复性与稳定性，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。

附图说明

图1为PCV2蛋白基因部分核苷酸序列质粒PCR鉴定结果；

图2为PRV gH蛋白基因部分核苷酸序列质粒PCR鉴定结果；

其中，图1，图2中，1.目的片段   M.DL 2000 Marker

图3为二重SYBR Green I实时荧光PCR反应溶解曲线；

图4为二重SYBR Green I实时荧光PCR反应特异性试验溶解曲线；

图5为二重SYBR Green I实时荧光PCR反应同浓度重复性试验溶解曲线；

图6为二重SYBR Green I实时荧光PCR反应不同浓度重复性试验溶解曲线。

具体实施方式

实施例

猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物的序列如下：

猪圆环病毒2型引物的序列如下：

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′；

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′。

猪伪狂犬病毒引物的序列如下：

上游引物P3：5′-CAA CCC GCT CGT GCT C-3′；

下游引物P4：5′-GCT GCT CCT CCA TGT CCT-3′。

利用上述引物检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型的二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBRGreen I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。

所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。

上述实施例中，关于材料与方法：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、细胞株和菌株

PK-15细胞，猪伪狂犬病毒标准毒株均购自中国兽药监察所；猪细小病毒，猪圆环病毒2型，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪瘟病毒和猪流感病毒标准毒株均购自河南省动物性食品安全重点实验室；工程菌DH5α感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 常用溶液及培养基

LB液体培养基；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液，100mg/ml；IPTG浓度为100mg/ml；X-gal浓度为20mg/ml，保存于棕色瓶内或用铝箔包裹的瓶内，以上溶液均贮存于-20℃备用。

1.1.3 主要仪器及试剂

紫外凝胶成像系统购自美国ALPHA INNOTECH公司；Rotor-Gene 3000型实时定量PCR扩增仪购自澳大利亚基因公司、PTC-200型PCR仪购自美国MJ公司、3K30型高速冷冻离心机购自德国SIGMA公司等。

SYBR Green I PreMix；EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000购自大连宝生物工程有限公司；Protein K购自华美生物工程公司；DMEM培养基购自GIBCOBRL公司；胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自LTI公司；T4 DNA连接酶、PGEM-T Easy质粒载体均购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司。

1.2 方法

1.2.1 PCV2的培养增殖

将PCV2同步接种于未贴壁的PK-15细胞，接毒量为培养液的1/10，将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养72h后，终止培养并收毒。反复冻融2～3次，收集病毒液，直接进行病毒RNA的提取或-80℃贮存备用。

1.2.2 PRV的培养增殖

当PK-15细胞达90％以上时，接种100 TCID₅₀ PRV，37℃吸附1h，洗去未吸附病毒，加入适量的细胞维持液，待细胞病变达到70％时，终止培养，反复冻融2～3次，收集病毒液，直接进行病毒DNA的提取或-80℃贮存备用。

1.2.3 引物设计与合成

以GenBank公布的猪圆环病毒2型ORF2基因为参照序列(AF027217)，用Primer Premier5.0生物软件设计出1对上游引物和下游引物，预计扩增片段为171bp。引物的序列如下：

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′；

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′；

根据GenBank登录的Klupp报道的猪伪狂犬病毒gH基因序列，按照引物设计原则，应用Primer Premier 5.0生物软件设计出1对特异引物，预计扩增片段为187bp，引物序列如下：

上游引物P3：5′-CAA CCC GCT CGT GCT C-3′；

下游引物P4：5′-GCT GCT CCT CCATGT CCT-3′；

上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 PRV、PCV2、PPV病毒DNA的提取

传统的蛋白酶K提取方法：取增殖的病毒液各450μl，加入等体积样品裂解缓冲液[0.02mol/L Tris HCl(PH 7.5)，0.03mol/L EDTA，1％SDS]，混匀，再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/mL)，56℃水浴1h，然后加入等体积的平衡酚，混匀，10000rpm离心5min。取上清，经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，-20℃放置30min，12000rpm离心10min，70％乙醇洗涤2次，干燥，加入25μl超纯水溶解，贮存于-20℃备用。

1.2.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒cDNA的制备

分别取400μl的病毒液，加入400μl Trizol，剧烈振荡；加入100μl氯仿∶异戊醇(24∶1)剧烈振荡30s，混匀；放入台式离心机12000rpm，室温离心5min；取上层水相，小心转移至经DEPC水处理过的1.5ml无菌离心管中，加入150μl无水乙醇，混匀；将上步中的溶液全部转移到UnLQ-10柱子中，室温放置2min，使溶液中的RNA尽可能的与柱子的滤膜相结合，8000rpm，离心1min；取出柱子弃去收集管中的废液，将柱子放入收集管中并加入450μlRPE Solution，室温静置2min，10000rpm，离心30s，并重复一次；取出柱子，弃去废液，12000rpm，空离3min；取出柱子，放入经DEPC水处理过的1.5ml无菌离心管中，于柱内膜中央加入16μl DEPC水，55～80℃放置2min；10000rpm，离心1min，收集管内溶液，其中含有所抽提的三种病毒的RNA，可立即使用或-70℃贮存备用。

在提取的三种病毒的RNA中分别加入反转录随机引物(10pmol/μl)，4μl dNTP(2.5mmol/L)，70℃放置5min，冰浴2min；加入4μl反转录Buffer，2μl 0.1M DTT，1μl Rnaseinfnibitor(40U/μl)，42℃放置2min；加入1μlM-MLV反转录酶(200U/μl)，42℃作用1h，70℃放置15min，灭活反转录酶。将反转录后的cDNA于-20℃贮存备用。

1.2.6 质粒模板标准品的制备

以提取的PCV2 DNA和PRV DNA为模板，用优化的条件扩增ORF2基因片段和gH基因片段。在50μl反应体系中依次加入：10×PCR缓冲液5μl，MgCl₂(3mmol/L)1.5μl，dNTPs浓度为(10mmol/L)1.8μl，Taq酶1U，上、下游引物(50pmol/L)各0.5μl，模板5μl，最后用双蒸水补至50μl。将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：95℃预变性5min后，进人循环95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，30个循环后，72℃延伸10min；4℃结束反应。2.5％琼脂糖凝胶电泳。

将扩增出目的片段按胶回收试剂盒回收，按照载体连接试剂盒将目的片段与pGEM-T Easy载体相连接，转化DH5α感受态细胞，挑选白色菌落，进行菌液PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，送大连宝生物工程有限公司进行测序。经测序验证的阳性质粒作为模板标准品，并分别命名为pGEM-PCV2和pGEM-gH。

1.2.7 二重SYBR Green I实时荧光PCR反应体系条件的优化

SYBR Green I实时荧光PCR反应体系如下：

在25μl体系中加入以下成份：

瞬时离心后，将EP管置于荧光定量PCR仪上95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。同时设立无模板的阴性对照。本试验反应条件的优化是在两种病毒质粒模板等量的条件下进行的。

1.2.7.1 引物浓度的优化

分别以50pmol/μl的引物浓度0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl进行SYBR Green I实时荧光PCR反应，以选取扩增该病毒的最佳引物浓度。添加时取相等体积的引物量。

1.2.7.2 退火温度的优化

二重SYBR Green I实时荧光PCR分别以52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的退火温度进行反应，以确定最佳的退火温度。

1.2.7.3 SYBR PreMix浓度的优化

试验中荧光染料预混酶SYBR PreMix的浓度是5U/μl，固定SYBR Green I实时荧光PCR反应体系的总体积，通过改变荧光染料预混酶SYBR PreMix的添加量来筛选SYBR Green I实时荧光PCR反应体系中SYBR PreMix的最佳浓度。分别以10μl、12.5μl、15μl、17.5μl、20μl、22.5μl的浓度进行筛选。

1.2.8 特异性检验

按照SYBR Green I实时荧光反应体系，分别加入PCV2、PRV细胞毒DNA 1μl(约20ng)，猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞毒cDNA 1μl(约20ng)，猪流感病毒细胞毒cDNA 1μl(约20ng)，猪细小病毒细胞毒DNA 1μl(约20ng)，猪瘟病毒细胞毒cDNA 1μl(约20ng)，同时设阴性对照，验证其特异性。

1.2.9 重复性检验

选取PCV2、PRV同一浓度的质粒标准品进行二重SYBR Green I实时荧光PCR反应重复性试验，反应重复3次；将不同浓度的质粒标准品进行二重SYBR Green I实时荧光PCR反应重复性试验，反应重复3次；通过每种病毒的Tm值和溶解曲线的分析，验证PCV2、PRV二重SYBRGreen I实时荧光PCR方法的稳定性。

1.2.10 实时荧光PCR敏感性测定

分别将PCV2、PRV的重组质粒测OD260值，计算出每微升的拷贝数，然后进行10倍梯度稀释，以此作为模板进行二重SYBR Green I实时荧光PCR反应，进而确定二重SYBR Green I实时荧光PCR反应检测每种病毒的敏感性。

1.2.11 疑似PCV2、PRV病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较

取采自河南省新乡、周口等地市猪场的疑似PCV2、PRV感染的病料进行二重SYBRGreen I实时荧光PCR和常规PCR检测，以证实该方法的实用性。

2 结果

2.1 质粒PCR扩增

如图1，图2 PCV2 0RF2部分基因、PRV gH部分基因质粒PCR鉴定结果所示，分别扩增出了与预计大小相一致的171bp和187bp的片段。经鉴定得到产物与预期的条带一致。测序与国内流行的毒株相比，核苷酸同源性分别在99.6％、99.8％以上。

测得提取的PRV、PCV2质粒DNA浓度分别为：pGEM-gH质量浓度＝82.5μg/ml，pGEM-PCV2质量浓度＝77.5μg/ml，pGEM-gH质粒浓度为4.78×10¹³拷贝/ml，pGEM-PCV2质粒浓度为4.53×10¹³拷贝/ml

2.2 二重SYBR Green I实时荧光PCR反应条件的优化结果

2.2.1 引物浓度优化结果

PCV2、PRV引物均采用50pmoL/μl 0.5μl的量在25μl体系中进行反应，能够产生特异性的单一峰值，阴性对照无特异性峰值产生。PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR反应的最佳引物浓度为0.5μl。

2.2.2 退火温度优化结果

PCV2、PRV在退火温度55℃时，均产生了特异性的峰值。PCV2 Tm值分别为81.5℃，81.5℃，81.3℃；PRV Tm值分别为87.7℃，87.7℃，87.2℃。阴性对照均无特异性峰值产生。PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR反应的最佳退火温度为55℃。

2.2.2 SYBR Green I PreMix浓度的优化结果

PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR反应中SYBR Green I PreMix添加量在15μl时，二者均可产生特异性的峰值，阴性对照无特异性峰值产生。

2.3 二重SYBR Green I实时荧光PCR反应体系的确定

通过各个反应条件的优化，最终确定了PPV、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

该反应的循环参数最终确定为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。同时设立无模板的阴性对照。

2.4 二重SYBR Green I实时荧光PCR扩增产物的溶解曲线及PCV2、PRV Tm值的确定

本发明利用Tm值的不同进行核酸片段的区分，核酸片段的Tm值主要与GC含量、序列长度和序列结构有关。PRV的扩增片段基因序列GC含量比一般病毒高，因此其Tm值最高，达到了87℃左右，很容易与其他病毒区分。PCV2的GC含量相对较低，况且PRV与PCV2扩增产物的长度不同，所以PRV、PCV2的Tm值可以很好的区分。

按照PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR反应条件，以PCV2、PRV的重组质粒为模板，进行PCR反应，经软件Rotor-gen6.0分析后得到溶解曲线，如图3所示，从图中可以看出2个特异性的峰值所对应的温度即为PCV2、PRV的Tm值。阴性对照则无峰值产生。PRV扩增片段的Tm值和PCV2扩增片段的Tm值并不是固定不变的，它们的Tm值会在一定的温度范围内变动，我们总结了多次试验结果的数据发现，PRV的Tm值变化范围为85.7～87.2℃，PCV2的Tm值变化范围为80.5～82.7℃，两种病毒的平均Tm值相差5.2℃，最低Tm值与最高Tm值相差超过6℃，因此，可以利用二者扩增产物片段Tm值的不同及溶解曲线的两个特异性的峰进行诊断与鉴别区分。

2.5 二重SYBR Green I实时荧光PCR特异性检验结果

从PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR特异性试验结果如图4所示，从图中可以看出，对照组中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒及阴性对照均无特异性峰值产生。只有试验组中的PCV2、PRV二重荧光PCR产生了特异性的两个峰值。PCV2 Tm值为80.8℃，PRV Tm值为86.7℃。

2.6 二重SYBR Green I实时荧光PCR重复性试验结果

2.6.1 同一浓度的PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR重复性试验结果

3次重复性试验中，各个病毒的Tm值都较为稳定。对照组中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒及阴性对照均无特异性峰值产生，如表1，图5所示。同浓度的PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR反应具有很好的稳定性。

表1 二重SYBR Green I实时荧光PCR的同一浓度重复性试验分析

2.6.2 不同浓度的PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR重复性试验结果

在不同浓度重复性试验中，各个病毒的Tm值都较为稳定。对照组中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒及阴性对照均无特异性峰值产生，如表2，图6所示。不同浓度的PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR反应同样具有很好的稳定性。

表2 二重SYBR Green I实时荧光PCR的不同浓度重复性试验分析

2.7 PCV2、PRV二重SYBR Green I实时荧光PCR敏感性试验验

pGEM-gH和pGEM-PCV2两种质粒的浓度分别为82.5μg/ml、77.5μg/ml；取等体积的两种质粒混匀后，进行10倍梯度稀释，以此作方模板进行二重SYBR Green I实时荧光PCR反应。PCV2重组质粒的敏感性可以达到215拷贝/μl，PRV重组质粒的敏感性可以达到180拷贝/μl。

2.8 实时荧光PCR与常规PCR检测比较

将疑似患PCV2、PRV仔猪组织病料30头份，阴性对照2头份提取DNA后，分别进行PCR和实时荧光CR检测，在30份病料中，常规PCR检出11份PRV阳性病料，检出率为36.7％；检出16份PCV2阳性病料，检出率为53.3％；二重实时荧光PCR同样能够检测出常规PCR所检出的阳性病料，二者符合率达100％；二重实时荧光PCR中，PRV检出20份阳性病料，检出率为66.7％，比常规PCR的检出率高30％；PCV2检出26份阳性病料，检出率为86.7％，比常规PCR的检出率高33.4％。实时荧光PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。.

Claims (2)

1.猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物，其特征在于：

猪圆环病毒2型引物的序列如下：

上游引物P1：5′-TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3′；

下游引物P2：5′-GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3′。

猪伪狂犬病毒引物的序列如下：

上游引物P3：5′-CAA CCC GCT CGT GCT C-3′；

下游引物P4：5′-GCT GCT CCT CCA TGT CCT-3′。

2.利用权利要求1所述引物检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR的方法，包括提取样品的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测，其特征在于：

所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。

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